МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

Средства воспроизводства

СПЕРМА

Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов

Издание официальное

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения,обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЖ Рос-сельхозакадемии), Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») и Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Научно-исследовательский институт племенного дела» (ФГБНУ «ВНИИплем»)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации (ТК 148)

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 59-П от 27 сентября 2013 г.)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны no МК (ИСО 3166)004-97 Код страны no МК (ИСО 3166)004-97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации Беларусь BY Госстандарт Республики Беларусь Казахстан KZ Госстандарт Республики Казахстан Молдова MD Молдова-Стандарт Россия RU Росстандарт Узбекистан UZ Узстандарт

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 октября 2013 г. № 1261-ст введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 года

5    Взамен ГОСТ 20909.3-75. ГОСТ 20909 4-75, ГОСТ 20909.5-75 и ГОСТ 20909 6-75

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты» В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указаллепе «Национальные стандарты» Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2014

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и рассмотрен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

Средства воспроизводства СПЕРМА

Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов

Product for reproduction Semen

Physical, biological, biochemical, morphological analysis technique

Дата введения — 2015—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на свежеполученную неразбавленную, свежепопученную разбавленную и замороженную сперму производителей сельскохозяйственных животных (далее - сперма) и устанавливает методы испытаний физических свойств, биологического, биохимического и морфологического анализов.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007 6 Система стандартов безопасности труда Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 302-79 Термометр медицинский максимальный стеклянный. Технические условия ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 2290-76 Бальзам пихтовый. Технические условия

ГОСТ 2874-82 Вода питьевая. Гигиенические требования и контроль за качеством ГОСТ 4014-75 Красители органические. Нигрозин водорастворимый. Технические условия ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия ГОСТ 4234-77 Реактивы. Калий хлористый. Технические условия ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия ГОСТ 4478-78 Реактивы. Кислота сульфосалициловая 2-водная. Технические условия ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецезионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и анализа

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ 5962-67 Спирт этиловый ректификованный. Технические условия ГОСТ 6507-90 Микрометры. Технические условия

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

Издание официальное

ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 9307-78 Красители органические. Нигрозин спирторастворимый. Технические условия

ГОСТ 9412-93 Марля медицинская. Общие технические условия

ГОСТ 9949-76 Ксилол каменноугольный. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 17299-78 Спирт этиловый технический. Технические условия

ГОСТ 21239-93 (ИСО 7741-86) Инструменты хирургические Ножницы Общие требования и методы испытаний

ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний ГОСТ 22280-76 Реактивы. Натрий лимоннокислый 5.5-водный. Технические условия ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25706-83 Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования ГОСТ 27775-88 Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. Термины и анализа ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 32222-2013 Средства воспроизводства. Сперма. Методы отбора проб

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку

3    Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 27775.

4    Отбор проб спермы

Отбор проб - по ГОСТ 32222.

Для анализов используют свежеполученную неразбавленную и разбавленную сперму, хранившуюся при температуре 30 °С - 35 *С не более 30 мин с момента ее получения, и замороженную сперму, хранившуюся не более 30 мин после оттаивания.

5    Методы испытаний физических свойств

5.1    Определение цвета

Цвет спермы определяют визуально при хорошем естественном или искусственном освещении.

5.2    Определение объема и массы эякулята

5.2.1    Объем эякулята в кубических сантиметрах (см³) определяют в градуированных слермопри-емниках или мерной стеклянной пипеткой.

5.2.2    Массу эякулята в граммах (г) определяют взвешиванием на лабораторных весах типа ВЛТ-500 (ВТК-500) с погрешностью не более ± 0.08 г по ГОСТ 24104

5.3 Определение pH

5.3.1    Сущность метода

pH спермы определяют потенциометрическим методом. Сущность метода заключается в измерении электродного потенциала, возникающего при погружении электрода в сперму.

5.3.2    Средства измерений, материалы и реактивы Для проведения анализа применяют:

- рН-метр-милливольтметр с диапазоном измерения от 0 до 14 ед. pH. погрешностью ± 0,04 ед. pH; ¹

ГОСТ 32277-2013

-    бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;

-    калий хлористый по ГОСТ 4234;

-    воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

Допускается использование других средств измерений с аналогичными метрологическими характеристиками. а также материалов и реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

5.3.3    Проведение анализа

pH спермы определяют с помощью рН-метра-милливольтметра в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

5.3.4    Обработка результатов

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1. Допускаемые расхождения между результатами двух измерений не должны превышать ± 0,1ед. pH.

5.4    Определение осмотического давления

5.4.1    Сущность метода

Сущность метода определения осмотического давления свежело луче иной неразбавленной спермы заключается в установлении разности температур в точке таяния льда и в точке истинной кристаллизации.

5.4.2    Средства измерений, оборудование, материалы и реактивы

Для проведения анализа применяют;

-    термометр лабораторный типа ТЛ-50 с конусным шлифом № 4 с диапазоном измеряемых температур от минус 30 °С до 40 °С, ценой деления 0,20 °С;

-    мешалку проволочную с петлей, входящей в пробирку с размером диаметра 1,4 - 1.7 см,

-    штатив лабораторный;

-    кольца резиновые толщиной 2-3 мм;

-    лупу с увеличением 8 - 10^х по ГОСТ 25706;

-    термос металлический вместимостью не менее 1000 см²;

-    лед или снег;

-    углекислоту твердую (сухой лед) или азот жидкий по ГОСТ 9293 или натрий хлористый по ГОСТ

4233;

-    спирт этиловый технический по ГОСТ 17299;

-    воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

Допускается использование другого оборудования с техническими характеристиками и средств измерений с метрологическими характеристиками, а также материалов, реактивов и посуды по качеству не ниже вышеуказанных.

5.4.3    Подготовка к проведению анализа

5.4.3.1    Готовят термос с одной из следующих охлаждающих смесей;

-    лед с поваренной солью в соотношении 3:1;

-    смесь этилового спирта с сухим льдом;

-    этиловый спирт, охлажденный пропусканием через змеевик паров жидкого азота

Температуру в термосе постоянно поддерживают на уровне минус 38 °С - минус 40 °С.

5.4.3.2    Перед началом анализа проводят настройку термометра, устанавливая на нем нулевую точку. Для этого термометр вначале помещают в мелкораздробленный тающий лед или снег и наблюдают уровень ртути в капилляре.

Затем устанавливают нулевую точку на термометре по замерзанию дистиллированной воды, определяя ее следующим образом. Закрепляют на штативе пробирку с размером диаметра 2,2 - 2,5 см. Во вторую пробирку меньшего диаметра наливают дистиллированную воду в таком объеме, чтобы после введения в пробирку термометра с надетой на него проволочной мешалкой его ртутный резервуар был полностью погружен в воду. На пробирку с термометром и дистиллированной водой надевают два резиновых кольца. Подготовленную таким образом пробирку с термометром вставляют в пробирку, закрепленную в штативе. Пробирки с термометром опускают в термос (ванну) с охлаждающей смесью. В процессе охлаждения воду беспрерывно помешивают вертикальными движениями мешалки, постоянно наблюдая за понижением уровня ртути в капилляре. При переохлаждении воды начинает выделяться теплота кристаллизации и столбик ртути быстро поднимается до истинной температуры замерзания воды, оставаясь некоторое время на этом уровне. Температуру замерзания воды регистрируют с точностью до 0.2 X.

5.4.4    Проведение анализа

В промытую и тщательно подсушенную фильтровальной бумагой пробирку наливают сперму в таком количестве, чтобы ртутный резервуар термометра был полностью погружен в нее. Пробирку с термометром помещают во вторую пробирку, закрепленную в штативе. Температуру замерзания спермы устанавливают по 5.4.3.2. При определении осмотического давления разных эякулятов пробирку и термометр после каждого испытания тщательно ополаскивают дистиллированной водой и просушивают.

5.4.5    Обработка результатов

5.4.5.1    Осмотическое давление спермы при температуре 0 °С Р₀. Па (кгс/см²), вычисляют по формуле

Р₀ = К Д'.    О)

где К - постоянный коэффициент, используемый при расчете осмотического давления, равный 1.204 Пахград'¹ или 12.04 кгсхсм'^град*¹;

А(- разность между нулевой точкой на термометре и истинной температурой замерзания спермы. °С.

Результат округляют до третьего десятичного знака.

Пример

Ну новая точна на термометре установлена на уровне 4.46 °С. После трехкратного измерения истинная температура замерзания спермы составляла 3,80 °С, 3,81 °С и 3,80 ^еС. Таким образом, среднеарифметическое значонио температуры замерзания спермы составит 3,80 °С.

Разность температуры At = 4,46 - 3,80 = 0,66 °С.

Следовательно, осмотическое давление при температуре О °С вычисляют по формуле РО ■ 1,204 (или 12,04) 0,66 ■ 0,794 Па (или 7,94 кгс/см2).

5.4.5.2    Осмотическое давление спермы при заданной температуре Р_п. Па (кгс/см²). вычисляют по формуле

7i.+'n

Т

'о

где Т₀ - константа, равная 273X;

/„-температура, при которой требуется определить осмотическое давление спермы. °С;

Р₀ - осмотическое давление при температуре 0 °С. Па (кгс/см²).

Результат округляют до второго десятичного знака.

Пример

Осмотическое давление спермы при температуре 39 °С составляет: Р39 = (273 *39) / 273 • 0,79 (или 7,94) ■ 0,91 Па (или 9,1 кгс/см2).

5.5 Определение концентрации сперматозоидов

Концентрацию сперматозоидов определяют в счетных камерах, с помощью измерения светорассеяния и специальных компьютерных программ.

5.5.1    Определение концентрации сперматозоидов в счетной камере

5.5.1.1    Сущность метода заключается в подсчете сперматозоидов в счетной камере для форменных элементов крови.

5.5.1.2    Оборудование, материалы и реактивы Для проведения анализа применяют:

-    микроскоп биологический различных марок с окуляром 15* и объективом 20*;

-    камеру счетную Горяева для анализа количества форменных элементов крови;

-    баллон резиновый или груша резиновая;

-    эритроцитарный смеситель (меланжер);

-    стекла шлифованные покровные 20 * 20 по ГОСТ 6672;

-    салфетки марлевые по ГОСТ 9412;

-    натрий хлористый по ГОСТ 4233. 3 %-ный раствор;

-    спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;

-    эфир петролейный марки 40-70. ³

ГОСТ 32277-2013

Допускается использование другого оборудования с техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

5.5.1.3    Проведение анализа

Сперму тщательно перемешивают и набирают до метки «1» в меланжер, предварительно обработанный смесью спирта и эфира в соотношении 1 : 1 и высушенный. Для разбавления спермы и обездвиживания сперматозоидов в меланжер вводят до метки «101» 3 %-ный раствор хлористого натрия (разбавление спермы в 100 раз). Зажав большим и указательным пальцами оба конца наполненного меланжера, тщательно перемешивают содержимое, переворачивая меланжер вверх и вниз не менее 60 раз.

Удалив из меланжера первые три - четыре капли, кончик меланжера обтирают марлевой салфеткой и осторожно наносят одну каплю смеси на край притертого к счетной камере шлифовального покровного стекла. Капля, затекая под стекло, заполняет камеру Горяева. Подсчет сперматозоидов проводят при таком увеличении микроскопа, чтобы в поле зрения помещалось 16 малых (один большой) квадратов. Сперматозоиды подсчитывают в 80 малых (пяти больших) квадратах, расположенных по диагонали. Для подсчета сперматозоидов, расположенных в глубине камеры, постоянно вращают микровинт. Положение сперматозоидов внутри или вне квадрата определяют по месту нахождения головки. Головки, расположенные на левой и верхней линиях, относят к тому квадрату, в котором проводят подсчет. Головки можно также учитывать на правой и нижней линиях.

5.5.1.4    Обработка результатов

Концентрацию сперматозоидов спермы С. млрд/см³, вычисляют по формуле

(3)

где п - количество подсчитанных сперматозоидов в 80 маленьких квадратах;

200 - постоянный коэффициент.

Пример

В 80 мапеньких (пяти больших) квадратах насчитали 100 сперматозоидов. Следовательно, концентрация сперматозоидов о см3 составит

Cm-—mOJ ЧПрд/СЧ!>

200

5.5.2 Определение концентрации сперматозоидов путем измерения светорассеяния

5.5.2.1    Сущность метода заключается в определении оптической плотности спермы, величина которой пропорциональна концентрации сперматозоидов.

5.5.2.2    Средства измерений, материалы, посуда и реактивы

Для проведения анализа применяют.

- фотометр, спектрофотометр, фотоэлектроколориметр, позволяющие измерять оптическую плотность раствора в диапазоне длин волн от (675 ± 25) нм при допускаемой абсолютной погрешности измерения спектрального коэффициента пропускания не более ± 2 % в оптических кюветах толщиной поглощающего слоя 10 мм;

-    воронка лабораторная В-56-80 ХС по ГОСТ 25336;

-    пробирки типа П2Т по ГОСТ 25336 вместимостью 10 см³;

-    пипетку градуированную вместимостью 10 см³ по ГОСТ 29227;

-    микропипетку вместимостью 0.1 см³;

-    салфетки марлевые по ГОСТ 9412;

-    бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;

-    натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280, 3 %-ный раствор.

Допускается использование других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также материалов, реактивов и посуды по качеству не ниже вышеуказанных.

5.5.2.3    Подготовка к проведению анализа

Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика используют сперму с высокой концентрацией сперматозоидов. из которой готовят разведения различной концентрации. Например, берут сперму с концентрацией сперматозоидов, равной 1,2 млрд/см³. Сперму разводят 3.5 %-ным раствором лимоннокислого

5

натрия в соответствии с таблицей 1 из расчета приготовления разведений с интервалом концентрации сперматозоидов в растворе от 0.02 до 0.20 млрд/см³.

Таблица 1

Номер пробирки Объем спермы. см3 Объем раствора лимоннокислого натрия, см3 Концентрация сперматозоидов в растворе, млрд/ см3 Номер пробирки Объем спермы, см3 Объем раствора лимоннокислого натрия, см3 Концентрация сперматозоидов в растворе, млрд'см3 1 1.0 5.0 0.20 6 0.5 5.5 0,10 2 0.9 5,1 0,18 7 0,4 5.6 0.08 3 0.8 5.2 0,16 8 0.3 5.7 0,06 4 0.7 5.3 0.14 9 0.2 5.8 0,04 5 0.6 5.4 0.12 10 0.1 5.9 0.02

Концентрацию сперматозоидов в каждом разведении уточняют, подсчитывая их количество в камере Горяева по 5.5.1. Измеряют оптическую плотность приготовленных разведений при (675 ± 25) нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Для построения градуировочного графика откладывают по оси абсцисс значения концентрации сперматозоидов, а по оси ординат - соответствующие им величины оптической плотности. Градуировочный график строят для каждого прибора. Проверку градуировочного графика проводят ежемесячно.

5.5.2 4 Проведение анализа

В чистую пробирку наливают 5см³ 3.5 %-ного раствора лимоннокислого натрия и микропипеткой вносят точно 0.02 см³ свежелолученной спермы быков; 0.01 см³ свежеполученной спермы баранов и козлов; 0.2 см³ свежеполученной спермы хряков и жеребцов, не допуская попадания пены или вазелина. Перед внесением спермы в раствор лимоннокислого натрия микропипетку вытирают снаружи чистой марлевой салфеткой для удаления излишка спермы. После внесения спермы микропипетку промывают в этом же растворе, набирая раствор в пипетку и выдувая его не менее трех раз. Суспензию тщательно перемешивают, осторожно переворачивая закрытый флакончик, не допуская при этом образования пены.-

Измеряют оптическую плотность суспензии, используя в качестве контрольного (фонового) раствора 3.5%-ный раствор лимоннокислого натрия.

5.5.2.5 Обработка результатов

Концентрацию сперматозоидов в миллиардах на кубический сантиметр (млрд/см³) спермы определяют при помощи градуировочного графика по соответствующему значению оптической плотности раствора.

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать 10 %.

6 Методы биологических анализов

6.1    Определение подвижности сперматозоидов

6.1.1    Сущность метода

Сущность метода заключается в визуальном определении с помощью микроскопа в раздавленной капле спермы количественного соотношения сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением (ППД) к их общему числу.

6.1.2    Оборудование, материалы, посуда и реактивы

Для проведения анализа применяют;

-    микроскоп биологический увеличением 150 - 200 раз;

-    столик электрообогреваемый к микроскопу, обеспечивающий поддержание температуры спермы в пределах (37 ± 1) °С;

-    термобокс водяной или электрический, обеспечивающий поддержание температуры (37 ± 1) °С;

-    корнцанг;

-    пинцет анатомический по ГОСТ 21241;

6

ГОСТ 32277— 2013

-    ножницы по ГОСТ 21239;

-    стекла предметные 26 * 100 по ГОСТ 9284;

-    стекла покровные 20 * 20 по ГОСТ 6672;

-    пипетки пастеровские;

-    пипетки градуированные вместимостью 5 см³ 2-го класса точности по ГОСТ 29227;

-    пробирки вместимостью 2 см³ по ГОСТ 25336;

-    пробки резиновые для пробирок;

-    салфетки марлевые стерильные;

-    натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280. 2.9 %-ный раствор;

-    алюминиевый сосуд Дьюара вместимостью 4-35 дм³.

Допускается использование другого оборудования с техническими характеристиками, а также материалов. реактивов и посуды по качеству не ниже вышеуказанных.

6.1.3 Подготовка к проведению анализа

6.1.3.1    От каждого свежеполученного эякулята отбирают 0,1 - 0 ,5 см³ спермы; от каждой партии замороженной спермы, расфасованной в соломинки, облицованные или необлицованные гранулы, отбирают из жидкого азота по две дозы и помещают в отдельный сосуд Дьюара..

6.1.3.2    В чистую стерильную пробирку мерной пипеткой вносят 0.5 см³ 2.9 %-ного раствора лимоннокислого натрия. Затем пробирки закрывают резиновыми пробками и ставят в термостат при температуре /(37 ± 1) *С на срок не более 30 мин.

6.1.3.3    Соломинки или облицованные гранулы со спермой с помощью охлажденного корнцанга, а необлицованные гранулы с помощью охлажденного анатомического пинцета, вынимают из сосуда Дьюара. Соломинки или облицованные гранулы погружают в водяную баню при температуре (37 ± 1) °С на 20 - 30 с, а затем вынимают и протирают насухо стерильной салфеткой. Ножницами отрезают оба конца соломинки или один конец облицованной гранулы. Одну дозу спермы из соломинки, облицованной гранулы или необлицованной гранулы помещают в пробирку с 2.9 %-ным раствором лимоннокислого натрия, находящуюся в термостате.

6.1.3.4    Затем объем содержимого пробирок доводят до 1 см³ 2.9 %-ным раствором лимоннокислого натрия, пробирки закрывают резиновыми пробками и перемешивают. Пробирки помещают в термостат при температуре (37 ± 1) °С на срок не более 30 мин.

6.1.4    Проведение анализа

На электрообогревательный столик микроскопа помещают предметное стекло и после его нагрева до температуры (37 ± 1) °С стерильной пастеровской пипеткой из пробирки, находящейся в термобоксе. наносят небольшую каплю разбавленной спермы и покрывают стеклом. Устанавливают увеличение. дающее возможность добиться четкого изображения, и. просматривая весь препарат, выбирают участок с небольшим движением сперматозоидов. Определяют визуально в трех полях зрения соотношение сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением (ППД) к общему количеству сперматозоидов, включая и неподвижных, а также сперматозоидов, имеющих манежное и колебательное движение. В случае оценки свежеполученной спермы допускается проведение анализа в капле неразбавленной спермы.

6.1.5    Обработка результатов

Результаты анализа представляют в процентах.

6.2 Определение выживаемости сперматозоидов при температуре (37 ± 1) °С после

оттаивания спермы

6.2.1    Сущность метода

Сущность метода заключается в определении количества сперматозоидов в замороженной сперме. сохранивших прямолинейное поступательное движение (ППД) после оттаивания и хранения в течение 5 ч в термостате при температуре (37 ± 1) °С.

6.2.2    Оборудование, материалы, посуда и реактивы

Оборудование, материалы, посуда и реактивы - по 6.1.2 и 6.2.2.

6.2.3    Подготовка к проведению анализа

Оттаянную сперму в пробирке № 2 по 6.1.3.3 инкубируют в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 5 ч.

6.2.4    Проведение анализа

После 1.2 и 5 ч инкубации спермы в термостате определяют подвижность сперматозоидов по 6.1.

6.2.5    Обработка результатов

7

Сперматозоиды имеют выживаемость не менее 5 ч. если после 5 ч инкубации спермы в термостате при температуре (37 ± 1) ®С в ней обнаруживают не менее 1 % сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением (ППД).

7    Методы биохимического анализа

7.1    Определение содержания кетоновых тел

7.1.1    Сущность метода

Сущность качественного метода анализа содержания кетоновых тел в неразбавленной свежепо-лученной сперме заключается в положительной реакции нитропруссидной пробы в присутствии кетоновых тел и визуальной оценке интенсивности окрашивания.

7.1.2    Оборудование и реактивы

Для проведения анализа применяют:

-    пробирки стеклянные типа П 2Т вместимостью 10 см³ по ГОСТ 25336:

-    пипетки пастеровские;

-    натрий нитропруссид, насыщенный раствор:

-    сульфосалициловую кислоту по ГОСТ 4478,10 %-ный водный раствор;

-    натрия гидрооксид (натрий едкий) по ГОСТ 4328. 40 %-ный раствор;

-    воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

Доп\скается использование других реактивов и посуды по качеству не ниже вышеуказанных.

7.1.3    Подготовка к проведению анализа

7.1.3.1    Приготовление 10 %-ного раствора сульфосалициловой кислоты

В стеклянную пробирку вместимостью 10 см³ по ГОСТ 25336 вносят 1.00 г порошка сульфосалициловой кислоты и растворяют в 9.0 см³ дистиллированной воды.

Раствор применяют свежеприготовленным.

7.1.3.2    Приготовление 40 %-ного раствора гидроокисида натрия

В стеклянной пробирке вместимостью 10 см³ по ГОСТ 25336 растворяют 4.00 г гидрооксида натрия в 6.0 см³ дистиллированной воды.

Раствор применяют свежеприготовленным.

7.1.4    Проведение анализа

В пробирку вместимостью 10 см³ вносят 0.4 см³ неразбавленной свежеполученной спермы, прибавляют три капли 10 %-ного раствора сульфосалициловой кислоты. Пробирку встряхивают, затем добавляют одну каплю насыщенного раствора нитропруссида натрия. Пробирку снова тщательно встряхивают после чего осторожно пастеровской пипеткой с длинным концом подслаивают на дно пробирки 0.2 - 0.3 см³ 40 %-ного раствора гидрооксида натрия.

При наличии кетоновых тел на границе соприкосновения раствора гидрооксида натрия со спермой в течение 30 с образуется окрашенное кольцо.

7.1.5    Обработка результатов

Массовую долю кетоновых тел в процентах определяют по интенсивности окрашивания кольца:

-    слабо-розовое и светло-малиновое окрашивание - 0.5 - 2.9 10 ³ %;

-    окрашивание в малиновый цвет - 3.0 - 3.4 10‘³ %;

-    окрашивание в вишневый цвет - 3.5 - 4.9 • 10'³ %;

-    окрашивание в темно-вишневый цвет - более 5 • 10‘³ % кетоновых тел.

8    Методы морфологического анализа

8.1    Определение содержания сперматозоидов с аномальной морфологией и включений

8.1.1    Сущность метода

Сущность метода заключается в подсчете под микроскопом патологических форм сперматозоидов и включений спермы. При подсчете патологических форм сперматозоидов учитывают количество сперматозоидов с аномальной морфологией.

Примечание - К аномальным формам относят сперматозоиды с отклонениями в строении головки (микроскопическая, круглая, несимметричная, укороченная, заостренная, двойная, без мембраны или жгутика), шейки (двойная, ломаная, изогнутая, укороченная), тела (изогнутое, удвоенное, нитевидное, с цитоплазматической

1

2

3