Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

48 страниц

349.00 ₽

Купить МР 1.2.0052-11 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Методические рекомендации определяют порядок и методы оценки безопасности искусственных наноматериалов по их воздействию на функцию иммунитета

 Скачать PDF

Оглавление

1. Область применения

2. Введение

3. Нормативные ссылки

4. Общие положения

5. Порядок оценки воздействия искусственных наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета у иммунизированных животных

     5.1. Модель оценки функции иммунитета у крыс, иммунизированных белковым антигеном

     5.2. Определение гуморального иммунного ответа по специфическим антителам класса IgG у крыс

     5.3. Методы оценки клеточного звена иммунитета у иммунизированных и не иммунизированных крыс

     5.4. Модель оценки функции иммунитета у мышей, иммунизированных корпускулярным (клеточным) антигеном

6. Порядок оценки воздействия искусственных наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета у не иммунизированных животных в тестах ех vivo

     6.1. Экспериментальная модель

     6.2. Применяемые средства измерений и оборудование

     6.3. Методы тестирования функциональной активности клеток иммунной системы

     6.4. Статистическая обработка результатов

Приложение 1. Обозначения и сокращения

Нормативные ссылки:
Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27
Стр. 28
стр. 28
Стр. 29
стр. 29
Стр. 30
стр. 30

Страница 1

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации__


1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета


Методические рекомендации МР 1.2.0052—11


Издание официальное


Москва • 2012

Страница 2

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей


и благополучия человека


1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета


Методические рекомендации МР 1.2.0052—11

Страница 3

ББК51.2


093


093 Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета: Методические рекомендации.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2012.—46 с.


ISBN 978—5—7508—1144—1


1.    Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Г. Г. Онищенко); Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания РЛМН (В. А. Тутельян, И. В. Гмошинский, С. А. Хо-тимченко, М. М. Галпаров. В. В. Бессонов, Д. Б. Никитюк, Э. Н. Трушина,


О. К. Мустафина, О. И. Передеряев. Е. А. Арманова, О. Н. Тананова,


A.    А. Шумакова, Р. В. Распопов, В. А. Шипелин); Федеральным бюджетным учреждением науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (И. А. Дятлов,


B.    П. Холодсико, В. В. Фирстова, В. Д. Потапов, О. В. Полежаева,


Е. В. Зырина, П. А. Шрамко); Учреждением Российской академии наук Институтом биохимии им. А. Н. Баха РАН (В. О. Попов, Б. Б. Дзантиев,


А. В. Жердев); Учреждением Российской академии наук Центром «Биоинженерия» РАН (К. Г. Скрябин) в рамках Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008—2011 годы».


2.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 29 декабря 2011 г.


3.    Введены в действие 29 декабря 2011 г.


4.    Введены впервые.


ББК S1.2


ISBN 978—5—7508—1144—1


С Роспотребнадзор, 2012 С Федеральный центр гигиены н


эпидемиологии Роспотребнадзора, 2012

Страница 4

MP 1.2.0052—11

Содержание


I.    Область применения.............................................................................................4


II.    Введение................................................................................................................5


III.    Нормативные ссылки............................................................................................7


IV.    Общие положения...............................................................................................10


V.    Порядок оценки воздействия искусственных наночастиц и


наноматериалов на функцию иммунитета у иммунизированных животных...........................................................................................................14


5.1.    Модель оценки функции иммунитета у крыс, иммунизированных


белковым антигеном.................................................................................14


5.2.    Определение гуморального иммунного ответа по специфическим


антителам класса IgG у крыс....................................................................16


5.3.    Методы оценки клеточного звена иммунитета у


иммунизированных и не иммунизированных крыс...............................20


5.4.    Модель оценки функции иммунитета у мышей, иммунизированных


корпускулярным (клеточным) антигеном...............................................30


VI. Порядок оценки воздействия искусственных наночастиц и


наноматериалов на функцию иммунитета у не иммунизированных животных в тестах ex vivo.................................................................................33


6.1.    Экспериментальная модель......................................................................34


6.2.    Применяемые средства измерений и оборудование...............................37


6.3.    Методы тестирования функциональной активности клеток


иммунной системы....................................................................................40


6.4.    Статистическая обработка результатов...................................................44


Приложение I. Обозначения и сокращения...........................................................46


3

Страница 5

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации


Г. Г. Онищенко


27 декабря 2011 г.


Дата введения: с момента утверждения


1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета

Методические рекомендации МР 1.2.0052—11
I. Область применения

1.1.    Настоящие методические рекомендации определяют порядок и методы оценки безопасности искусственных наноматериалов по их воздействию на функцию иммунитета.


1.2.    Настоящие методические рекомендации могут применяться:


•    при оценке безопасности разрабатываемых новых и уже используемых наноматериалов;


•    при оценке рисков, связанных с процессами производства, оборота, использования и утилизации наноматериалов;


•    в процессе проведения экспертизы продукции сельского хозяйства, фармацевтической промышленности, биотехнологического производства, пищевых продуктов, содержащих наночастицы и наноматериалы;


•    при проведении мероприятий по осуществлению надзора (контроля) в процессе производства, переработки и утилизации искусственных наноматериалов.


1.3.    Методические рекомендации разработаны с целью обеспечения единства измерений и представления результатов при оценке воздействия наноматериалов на функцию иммунитета.

Страница 6

MP 1.2.0052—11


1.4. Методические рекомендации предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями и иными организациями и учреждениями, проводящими исследования по оценке безопасности наноматериалов и продукции наноиндустрии.

II. Введение

В связи с расширением использования нанотехнологий в различных отраслях промышленности, наночастицы и наноматериалы могут содержаться в значимых количествах в объектах окружающей среды (атмосферный воздух, вода, почва), продовольственном сырье и пищевых продуктах. Ввиду этого, оценка риска, связанного с их воздействием на организм, представляет собой важную задачу, решаемую в ходе осуществления санитарно-эпидемиологического надзора.


Одним из важнейших этапов оценки риска является характеристика опасности, то есть количественное определение степени воздействия опасного фактора (в данном случае наноматериалов) на наиболее чувствительные органы и системы. В их числе, согласно имеющимся в настоящее время данным, одно из ведущих мест принадлежит иммунной системе. Это связано, во-первых, с тем, что клетки иммунной системы принадлежат к числу наиболее быстро дифференцируемых и обновляемых клеток организма, в них с высокой эффективностью протекают процессы митоза, биосинтеза ДНК и других биополимеров. Ввиду наличия у наночастиц многих типов способности проникать через биологические мембраны в клетки и взаимодействовать с биополимерами, нормальная функция иммунных клеток должна рассматриваться как одна из наиболее чувствительных к повреждающему действию этих факторов. Аналогией повреждающего действия наноматериалов на генетический аппарат клетки и биосинтетические процессы является в данном случае действие ионизирующей радиации, как известно, повреждающей также, в первую очередь, клетки иммунной системы.


В рамках Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии на 2008—2011 гг.» был разработан и утвержден в установленном порядке Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ряд методических документов, включающих порядок и методы тестирования эффектов наночастиц и наноматериалов в биологических системах различного уровня организации (МУ 1.2.2520—09 «Токсиколого-гигиеническая оценка


5

Страница 7

безопасности наноматериалов»; МУ 1.2.2634—10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза»; МУ 1.2.2635—10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов»; МУ 1.2.2741—10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных»; МУ 1.2.2745—10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных»; МУ 1.2.2869—11 «Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных»; МУ 1.2.2874—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных»; МР 1.2.2522—09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека»; МР 1.2.2566—09 «Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo»). Рассматриваемый комплекс методик позволяет проводить оценку безопасности наночастиц и наноматериалов на иерархически организованной системе биологических объектов in vitro и in vivo, включая культуры микроорганизмов, клеточные культуры, гидробионты (беспозвоночные и рыбы), высшие растения, организмы лабораторных животных с использованием комплекса морфологических, биохимических, токсикологических, микробиологических, физиологических и иных методов. Вместе с тем, вопрос об учёте в рамках указанной методологии воздействия наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета сохраняет свою актуальность.


В настоящих методических рекомендациях представлены методические подходы к оценке воздействия наночастиц и наноматериалов, в первую очередь, на клеточное звено иммунитета (пролиферация имму-нокомпетентных клеток, их функциональные характеристики), а также на гуморальное звено иммунитета, оцениваемое по продукции специфических антител. Изучение перечисленных показателей осуществляется на модели экспериментальных животных, которым вводили наномате-риапы принципиально в двух возможных режимах: a) in vivo, когда количественно оцениваются параметры системы иммунитета непосредст-вено в организме экспонированных лабораторных животных и б) ex vivo, когда лабораторные тесты проводятся в строго контролируемых условиях, в культурах клеток, полученных от животных, которым предварительно вводили наноматериалы по определённой схеме. В качестве экспериментальных моделей предлагается использование как предварительно иммунизированных посторонним (по отношению к тестируемым наноматериапам) антигеном, так и не иммунизированных животных.

Страница 8

MP 1.2.0052—11

III. Нормативные ссылки

3.1.    Федеральный закон от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».


3.2.    Федеральный закон от 2 января 2000 г. № 29-ФЗ «О качестве и безопасности пищевых продуктов».


3.3.    Федеральный закон от 26 июня 2008 г. № 102-ФЗ «Об обеспечении единства измерений».


3.4.    Федеральный закон от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании».


3.5.    Федеральный закон от 10 января 2002 г. №7-ФЗ «Об охране окружающей среды».


3.6.    Постановление Правительства Российской Федерации от 30 июня 2004 г. № 322 «Об утверждении Положения о Федеральной службе в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека».


3.7.    Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. № 987 «О государственном надзоре и контроле в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов».


3.8.    Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. № 988 «О государственной регистрации новых пищевых продуктов, материалов и изделий».


3.9.    Постановление Правительства Российской Федерации от 2 февраля 2006 г. № 60 «Об утверждении Положения о проведении социально-гигиенического мониторинга».


3.10.    Постановление Правительства Российской Федерации от 15 сентября 2005 г. № 569 «О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации».


3.11.    Приказ Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».


3.12.    Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики».


3.13.    Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 23 июля 2007 г. № 54 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы».


3.14.    Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 г. № 79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки рис-


7

Страница 9

ка, методов идентификации и количественного определения наноматериалов».


3.15.    СП 2.2.2.1327—03 «Гигиенические требования к организации технологических процессов, производственному оборудованию и рабочему инструменту».


3.16.    МУ 1.2.2520—09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов».


3.17.    МУ 1.2.2636—10 «Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции, полученной с использованием нанотехнологий и наноматериалов».


3.18.    МУ 1.2.2741—10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных».


3.19.    МУ 1.2.2745—10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных».


3.20.    МУ 1.2.2874—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных».


3.21.    МУ 1.2.2634—10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза».


3.22.    МУ 1.2.2635—10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов».


3.23.    МУ 1.2.2869—11 «Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных».


3.24.    МУК 4.2.2429—08 «Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах».


3.25.    МР 1.2.2522—09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека».


3.26.    МР 1.2.2566—09 «Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo'».


3.21. МР 1.2.0022—11 «Порядок отбора проб для контроля за наноматериалами».


3.28.    МР 1.2.0023—11 «Контроль наноматериалов в пищевой продукции».


3.29.    МР 1.2.0024—11 «Контроль наноматериалов, применяемых в химической промышленности».


3.30.    МР 1.2.2641—10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах».


3.31.    ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».

Страница 10

MP 1.2.0052—11


3.32.    ГОСТ 26678-85 «Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия».


3.33.    ГОСТ Р 51652-2000 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия».


3.34.    ГОСТ 24104-2001 «Весы лабораторные. Общие технические требования».


3.35.    ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».


3.36.    ГОСТ 27987-88 «Анализаторы жидкости потенциометрические ГСП. Общие технические условия».


3.37.    ГОСТ 24861-91 «Шприцы инъекционные однократного применения».


3.38.    ГОСТ 3-88 «Перчатки хирургические резиновые. Технические условия».


3.39.    ГОСТ 4328-77 «Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия».


3.40.    ГОСТ 4198-75 «Реактивы. Калий фосфорнокислый одноза-мещенный. Технические условия».


3.41.    ГОСТ 4233-77 «Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия».


3.42.    ГОСТ 4172-76 «Реактивы. Натрий фосфорнокислый двуза-мещенный 12-водный. Технические условия».


3.43.    ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».


3.44.    ГОСТ 6709-72 «Вода дистиллированная. Технические условия».


3.45.    ГОСТ 2493-75 «Реактивы. Калий фосфорнокислый двузаме-щенный 3-водный. Технические условия».


3.46.    ГОСТ 4204-77 «Реактивы. Кислота серная. Технические условия».


3.47.    ГОСТ 4201-79 «Натрий углекислый кислый. Технические условия».


3.48.    ГОСТ 11293-89 «Желатин. Технические условия».


3.49.    ГОСТ 908-2004 «Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия».


3.50.    ГОСТ 22280-76 «Реактивы. Натрий лимоннокислый 5,5-вод-ный. Технические условия».


3.51.    ГОСТ 3773-72 «Реактивы. Аммоний хлористый. Технические условия».


9

Страница 11

3.52.    ГОСТ 245-75 «Реактивы. Натрий фосфорнокислый одноза-мещенный 2-водный. Технические условия».


3.53.    ГОСТ 2263-79 «Натр едкий технический».


3.54.    ГОСТ 3118-77 «Реактивы. Кислота соляная. Технические условия».


3.55.    ГОСТ 17299-78 «Спирт этиловый технический. Технические условия».


3.56.    ГОСТ 7.32-2001 «Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления».


3.57.    ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025—2006 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий».


IV. Общие положения


4.1.    Целью оценки воздействия наноматериалов искусственного происхождения на функцию иммунитета является:


•    выявление процессов иммунной защиты организма, являющихся мишенями токсического действия наночастиц и наноматериалов;


•    установление зависимости доза-эффект, возможных эффектов кумуляции наночастиц в организмах животных по показателям воздействия на функцию иммунитета;


•    токсиколого-гигиеническая и медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов и продукции, их содержащей;


•    гигиеническое нормирование содержания наноматериалов в объектах окружающей среды и потребительской продукции;


•    экспертиза наночастиц и наноматериалов, производимых на территории Российской Федерации или ввозимых на территорию Российской Федерации;


•    оценка риска для здоровья населения при поступлении наноматериалов в организм с пищей, водой, атмосферным воздухом и иными путями;


•    разработка мероприятий по охране здоровья населения и окружающей среды от воздействия наночастиц и наноматериалов.


4.2.    Оценка воздействия наноматериалов на показатели системы иммунитета проводится в экспериментах in vivo, при путях поступления наночастиц и наноматериалов, максимально приближенных к условиям экспонирования ими через объекты окружающей среды в обстановке реального воздействия, а также в системах ex vivo, включающих тестирование в культуре клеток, полученных от животных, которым вводили наноматериалы.

Страница 12

MP 1.2.0052—11


4.3.    Объектами оценки воздействия наноматериалов на систему иммунитета являются состав и численная характеристика популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток, их функциональные характеристики в базальных условиях и при антигенной и неспецифической стимуляции, показатели апоптоза, уровни гуморальных факторов иммунитета (цитокинов, антител).


4.4.    Выбор биологического объекта воздействия наночастиц и наноматериалов (вида, линии лабораторных животных), принципы выбора действующих доз, пути, длительность и кратность введения наночастиц и наноматериалов, состав опытных и контрольных групп тестируемых организмов устанавливаются для отдельных тест-систем в соответствии с МУ 1.2.2520—09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов», МР 1.2.2566—09 «Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo», МУ 1.2.2634—10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза», МУ 1.2.2635—10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов», МУ 1.2.2869— 11 «Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных».


4.5.    При выборе наноматериалов, являющихся объектами оценки токсического действия на иммунную систему, необходимо принимать во внимание:


•    возможность экспозиции работников нанотехнологических производств, потребителей продукции наноиндустрии и населения в целом наночастицами и наноматериалами на данной территории, в условиях промышленного производства или при потреблении продукции определённого типа;


•    данные литературы из источников, отвечающих критериям научной полноты и достоверности о наличии у тестируемых наноматериалов и их близких аналогов цитотоксических, генотоксических, мутагенных, иммунотоксических свойств;


•    степень потенциальной опасности наноматериалов для здоровья человека в соответствии с МР 1.2.2522—09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека».


4.6.    Лаборатория (организация), проводящая исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должна быть аккредитована на проведение работ в соответствующей области. В лаборатории должны соблюдаться правила надлежащей лабораторной практики в соответствии с приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики».


11

Страница 13

4.7.    В организации (лаборатории), проводящей исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должна быть разработана программа по обеспечению качества проводимых исследований. Все производственные операции проводятся в соответствии со Стандартными операционными процедурами (СОП), осуществляемыми в целях обеспечения качества, достоверности и воспроизводимости результатов исследования.


4.8.    Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наномагериалов на функцию иммунитета, должны быть укомплектованы необходимым оборудованием и средствами измерений, прошедшими поверку (калибровку) в установленном порядке. Эксплуатация оборудования и средств измерений проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения поверки (калибровки) и текущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание. Применяются средства измерений, имеющие сертификат и зарегистрированные в Государственном реестре средств измерений.


4.9.    Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должны иметь помещения для содержания и работы с лабораторными животными (виварии, клиники лабораторных животных), требования к которым изложены в МУ 1.2.2869—11 «Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных».


4.10.    Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должны иметь условия для работы с биологическим материалом, включая культуры иммунекомпетентных клеток, чистые боксированные помещения, ламинарные шкафы с горизонтальным потоком воздуха, обеспечивающие длительную экспозицию облучения внутренних поверхностей ультрафиолетовым светом.


4.11.    Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должны иметь оборудование, обеспечивающее безопасность работы с наноматериалами неорганического и биогенного происхождения: ламинарные вытяжные шкафы, перчаточные боксы, снабжённые системой вентиляции (НЕРА-фильтры), препятствующие поступлению аэрозоля наноматериалов в воздух производственных помещений и в окружающую среду.


4.12.    Документом, подтверждающим результаты проведённых исследований по влиянию наноматериалов на функцию иммунитета, явля-

Страница 14

MP 1.2.0052—11


ется отчёт о проведённом исследовании. Отчет содержит следующие сведения:


•    название исследования;


•    адрес организации;


•    даты начала и завершения исследований;


•    цель и задачи исследования;


•    характеристика тестируемых наночастиц и наноматериалов (химический состав, CAS-номер, средний, минимальный и максимальный размер частиц, форма частиц, наличие примесей, состав дисперсионной среды (носителя) в соответствии с МУ 1.2.2636—10 «Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции, полученной с использованием нанотехнологий и наноматериалов»);


•    применяемая биологическая модель и обоснование её использования;


•    перечень исследованных биологических образцов и применяемых стандартных образцов;


•    вид, линию, пол и возраст используемых лабораторных животных;


•    состав применяемых рационов, условия содержания животных;


•    метод введения наночастиц/наноматериапов, применяемые дозы, длительность и кратность введения;


•    план (дизайн) исследования;


•    перечень использованных средств измерений и вспомогательного оборудования и режимы их работы;


•    методы статистической обработки результатов;


•    результаты исследования, представленные в виде обобщающих таблиц, рисунков с соответствующей статистической обработкой и комментариев к ним;


•    заключение; выводы; список использованных источников.


Оформление отчёта о результатах исследования должно соответствовать требованиям ГОСТ 7.32-2001 «Отчёт о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления».


Отчет о результатах проведенного исследования составляется ответственным исполнителем, утверждается руководителем организации и скрепляется печатью организации.


4.13. Организация (лаборатория), проводящая исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должна обеспечить конфиденциальность результатов исследований в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации.


13

Страница 15

V. Порядок оценки воздействия искусственных наночастнц н наноматериалов на функцию иммунитета у иммунизированных животных


5. /. Модель оценки функции иммунитета у крыс, иммунизированных белковым антигеном


5.1.1.    Тестирование проводят на шести группах крыс-самцов линии Вистар или линии Спрейг-Доули исходной массой 100—120 г (группы № 1—-6). Численность групп животных составляет не менее 10 особей. Животные всех групп на протяжении всего периода тестирования получают полусинтетический рацион в соответствии с МУ 1.2.2520—09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов». Крыс размещают в клетках из ударопрочной пластмассы группами по 3—4 особи; рацион и питьевую воду предоставляют в режиме свободного неограниченного доступа.


Примечание: возможно использование при проведении тестирования крыс других линий, а также нелинейных животных. Используемые схемы иммунизации при этом должны быть модифицированы в соответствии с индивидуальными особенностями иммунного реагирования у этих животных.


5.1.2.    Тестируемые наночастицы и наноматериалы диспергируют в дистиллированной воде и дополнительно обрабатывают ультразвуком (частота 44 кГц, время и мощность обработки устанавливаются опытным путём) во избежание процессов агрегации. При необходимости степень диспергирования наноматериала проверяют методом электронной микроскопии согласно МР 1.2.2641—10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах». Дисперсию наночастиц вводят ежедневно внутрижелудочно (в/ж) через зонд на протяжении 28 дней.


5.1.3.    Иммунизацию крыс осуществляют к парентерально вводимому модельному' белковому антигену - овальбумину куриного яйца (ОВА). ОВА представляет собой фосфопротеид, состоящий из одной аминокислотной цепи, имеющий молекулярную массу 44 кД. Данный белок высоко иммуногенен для большинства видов млекопитающих. В целях повышения интенсивности иммунного ответа используют адъювант - свежеосаждённый гидроксид алюминия.


Иммунизацию осуществляют по следующей схеме. На 1-й, 3-й и 5-й день опыта крысам внутрибрюшинно (в/б) вводят дозу 100 мкг ОВА, адсорбированного на 10 мг гидроксида алюминия в 0,2 см3 физиологического раствора. На 21-й день опыта вводят дополнительно еще 10 мкг ОВА в тех же условиях для индукции вторичного иммунного ответа.

Страница 16

MP 1.2.0052—11


5.1.4.    Взятие биологического материала (цельная кровь, сыворотка крови) осуществляют на 29-й день тестирования в три пробирки, из которых одна обработана для предотвращения свёртываемости крови 1,6 мг трикалиевой соли ЭДТА, а другая - 100 мм3 1-го раствора гепарина, путём взятия крови из нижней полой вены под глубокой эфирной анестезией.


5.1.5.    План (дизайн) тестирования рекомендуется составлять в соответствии с данными, представленными в табл. 1.


Таблица 1


Типовой дизайн лабораторного теста по влиянию наночастиц на показатели системы иммунитета у иммунизированных ОВА крыс

Шя


п/п


групп


Обозначение


групп


Чис


ло


крыс


Сенсибилизация


Внутрижслудочное введение препаратов

1


Контроль


10


Не сенсибилизированные


В/ж введение дистиллированной воды в дозе 10 см* на кг массы тела с 1-го по 28-й дни опыта

2


Сенсибилиза


ция


10


В/б сенсибилизация овальбумином на А1(ОН)з на 1,3, 5 и 21-й дни опыта


В/ж введение дистиллированной воды 10 см3 на кг массы тела с 1-го по 28-й дни опыта

3


Введение наночастиц, доза «А»


10


Не сенсибилизированные


В/ж введение дисперсии наночастиц в дистиллированной воде в дозе «А» с 1 -го по 28-й дни опыта

4


Введение наночастиц, доза «Б»


10


Не сенсибилизированные


В/ж введение дисперсии наночастиц в дистиллированной воде в дозе «Б» с 1-го по 28-й дни опыта

5


Сенсибилизация + наночастицы, доза


«А»


10


В/б сенсибилизация овальбумином на А1(ОН)3 на 1,3, 5 и 21-й дни опыта


В/ж введение дисперсии наночастиц в дистиллированной воде в дозе «А» с 1 -го по 28-й дни опыта

6


Сенсибилизация + наночастицы, доза «Б»


10


В/б сенсибилизация овальбумином на А1(ОН)3 на 1, 3, 5 и 21-й дни опыта


В/ж введение дисперсии наночастиц в дистиллированной воде в дозе «Б» с 1-го по 28-Й дни опыта

Примечание: 1) величину дозы «А» наноматериала устанавливают на основе анализа возможных сценариев пероральной экспозиции наноматсриалом человека в условиях контаминации пищевых продуктов и воды отходами дея-


15

Страница 17

тельности нанотехнологических производств и (или) возможного поступления наноматериала, входящего в состав потребительской продукции с учетом возможной неопределенности и 10-кратного коэффициента запаса, определяемого биологической природой используемой модели (тестирование на грызунах); 2) доза «Б» является 10—100-кратно агравированной (увеличенной) в сравнении с дозой «А»; 3) при выборе доз наноматериала следует учитывать данные о его собственных токсических свойствах (LD50) - при наличии таковых.


5.1.6. Антиген для сенсибилизации готовят в соответствии со следующей прописью.


Готовят следующие растворы:


1) 20 или 2 мг ОВА (5-кратно перекристаллизованный препарат производства «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный) в 1см3 стерильного апирогенного физиологического раствора (0,15 М NaCl) по ГФ СССР, X, 426;


2)    10 % по массе алюмокалиевые квасцы хч в дистиллированной воде «для инъекций»;


3)    4 % по массе (1М) гидроксид натрия хч в дистиллированной воде «для инъекций».


Все растворы фильтруют через мембранные фильтры с размером пор 0,2 мкм для удаления пыли и бактерий.


В стерильном стеклянном флаконе смешивают 1 см3 раствора 1, 1 см3 раствора 2 и добавляли по каплям 0,6 см3 раствора 3. Смесь перемешивают и оставляют на 5 мин, после чего переносят в центрифужную пробирку объёмом 10 см3. Отмывают образовавшийся осадок троекратно объёмами по 10 см3 стерильного апирогенного физиологического раствора; после каждой отмывки осадок седиментируют центрифугированием при ускорении 3 000 g в настольной лабораторной центрифуге с охлаждением в течение 5 мин. Окончательно осадок диспергируют в 40 см3 стерильного апирогенного физиологического раствора. Полученную смесь вводят крысам. Препарат антигена годен к использованию в течение не более 48 часов. Примечание: перед использованием дисперсию антигена необходимо взбалтывать.


5.2. Определение гуморального иммунного ответа по специфическим антителам класса JgG у крыс


Интенсивность гуморального иммунного ответа оценивают по концентрации циркулирующих специфических IgG антител с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного теста на полистироле.

Страница 18

MP 1.2.0052—11


5.2.1. Оборудование


Фотометр планшетный автоматический «ЭФОС 9305» (производства «ОАО М3 Сапфир», Россия) с интерференционными светофильтрами на длину волны 492 и 620 нм или иной другой прибор с аналогичными параметрами


Воздушный термостат на температуру 37 °С Водяная баня на температуру 37 °С Лабораторный настольный встряхиватель Устройство для отмывки лунок иммунофер-ментных планшет на 8 каналов Весы аналитические лабораторные электронные с верхним пределом взвешивания 120 г 2-го класса точности ±0,1 мг с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104--2001 Весы технические лабораторные электронные с верхним пределом взвешивания 120 г и ценой деления 0,01 г


Мономер универсальный со стеклянным электродом для измерения pH водных растворов; погрешность измерения ± 0,05 ед. pH Секундомер


Пипетка полуавтоматическая 8-канальная регулируемая на объем 20—200 мм3 с наконечниками Пипетки полуавтоматические 1-канальные на объемы 0—20; 20—200 и 200—1 000 ммс наконечниками Дистиллятор лабораторный Магнитная мешалка


Колбы мерные наливные на объемы 500, 1 000 и 2 000 см3


Цилиндры мерные на 25, 50, 100 см3 Стаканы стеклянные на 500 и 1000 смШприц на объем 2 см3


ГОСТ 24104-2001


ГОСТ 27987-88


ГОСТ 1770-74 ГОСТ 1770-74


ГОСТ 24861-91


5.2.2. Материалы и реактивы Овальбумин куриного яйца (ОВА), 5-кратно перекристаллизованный или другой с аналогичными параметрами


17

Страница 19

Кроличьи моносгтецифические антитела против IgG крысы, меченные пероксидазой, лиофилизо-ванные производства НИИЭМ им Н. Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России или аналогичные Нормальная лошадиная сыворотка (НЛС) Фосфат калия однозамещенный, хч Фосфат калия двузамещенный трехводный, хч Хлорид натрия, хч Лимонная кислота, хч


Фосфат натрия двузамещенный 12-водный, хч Кислота серная d = 1,84, хч Гидроксид натрия, хч Натрий двууглекислый безводный, хч Твин-20 (полиоксиэтиленсорбитан монолаурат) производства «Sigma-Aldrich», Германия или другой с аналогичными параметрами Орто-фенилендиамин градации «Analytical grade»


Перекись водорода «медицинская» 33 % Желатин («пищевая марки П-11»)


Планшеты полистирольные разборные плоскодонные со «средней» степенью связывания.


ГОСТ 4198-75 ГОСТ 2493-75 ГОСТ 4233-77 ГОСТ 908-2004 ГОСТ 4172-76 ГОСТ 4204-77 ГОСТ 4328-77 ГОСТ 4201-79


ТУ 6-02-570—75 ГОСТ 11293-89


5.2.3. Приготовление рабочих растворов


Буфер для иммобилизации антигенов. Навеску 4 г гидроксида натрия хч переносят в мерную колбу на 100 см3, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Навеску 8,4 г натрия двууглекислого помещают в стакан на 1 000 см3, растворяют в 800—900 см3 дистиллированной воды на магнитной мешалке. Добавляют раствор гидроксида натрия при перемешивании под контролем иономера до достижения pH 9,7 ±0,1. Смесь количественно переносят в мерную колбу на I 000 см3 и доводят водой до метки.


Фосфатно-солевой буфер (ФСБ). Навеску 68 г калия фосфата одно-замещенного переносят в мерную колбу на 500 см3, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Навеску 228 г калия фосфата двузамещенного трехводного переносят в мерную колбу на 1 000 см3, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Полученные растворы смешивают под контролем иономера до достижения величины pH = 7,95 ± 0,05. Навеску 180 г натрия хлорида переносят в мерную колбу на 1 000 см3, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. В мерную колбу на 2 000 см3 вносят мерным цилиндром 20 см3 сме-

Страница 20

MP 1.2.0052—11


си раствора фосфатов и 100 см3 раствора натрия хлорида и доводят дистиллированной водой до метки.


Раствор Твин-ФСБ. В мерную колбу на 2 ООО см3 вносят с помощью шприца 2 см3 Твин-20 и доводят ФСБ до метки.


Раствор НЛС-ФСБ. Смешивают 100 см3 ФСБ с 1 см3 нормальной лошадиной сыворотки.


Блокирующий реагент. Смешивают 0,2 г желатины с 20 см3 ФСБ, оставляют на 16 ч в холодильнике, после чего нагревают при 37 °С на водяной бане до полного растворения.


Субстратный буфер. В стакан на 1 000 см3 вносят навески 26,3 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного и 5,6 г лимонной кислоты тригидрата. Растворяют на магнитной мешалке в 800—900 смдистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу на 1 000 см3, доводят до метки и проверяют pH, который должен составлять 6,0 ±0,1.


Раствор субстрата (готовится непосредственно перед употреблением). Навеску 6,0 ±0,1 мг орто-фенилендиамина растворяют при нагревании до 40—50 °С в 15 см3 субстратного буфера и непосредственно перед нанесением на планшету вносят 40 мм3 33 % перекиси водорода, разведенной 1 : 1 дистиллированной водой.


Останавливающий реагент (фиксатор). В мерную колбу на 1 000 см3 вносят 900—950 см3 дистиллированной воды и отмеряют цилиндром 28 см3 серной кислоты. Раствор перемешивают, охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до метки.


5.2.4. Проведение анализа


В лунки полистирольных планшет вносят по 1,0 мкг ОВА в 100 мм3 0,1 М Na-б и карбонатного буфера pH 9,7 ±0,1 и оставляют на 16 ч в холодильнике. По окончании адсорбции антигена буфер удаляют путем промывки 0,01 М Na-фосфатным буфером pH 7,3 ±0,1 с 0,15 М NaCl и 0,1 % Твин-20 (Твин-ФСБ). В лунки на 30 мин вносят по 200 мм3 1 % раствора желатина в Твин-ФСБ. Отмывку повторяют, после чего вносят в лунки по 100 мм3 стандартных растворов крысиных антител к ОВА, очищенных методом аффинной хроматографии, или исследуемых сывороток крови крыс в разведении 1 : 2 000. Разведения выполняют в ФСБ с 0,1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА-ФСБ). Планшеты инху-бируют 120 мин при 20 °С со встряхиванием, после чего 5-кратно отмывают Твин-ФСБ и вносят по 100 мм3 кроличьих антител к IgG крысы, конъюгированных с пероксидазой, в разведении 1 :4 000 в БСА-ФСБ (примечание: рабочее разведение конъюгированных антител может быть указано на ампуле с сухим препаратом). Инкубацию и отмывку повто-


19