МР 1.2.2641-10
Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах

Методические рекомендации МР 1.2.2641—10

Москва * 2010

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей н благополучия человека

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ. САНИТАРИЯ

Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах

Методические рекомендации МР 1.2.2641—10

ББК 51.20 060

060 Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах: Методические рекомендации.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010.—83 с.

ISBN 978—5—7508—0934—9

1.    Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Г. Г. Онищенко, И. В. Брагина,

Т. Ю. Завистяева); Учреждением Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт питания РАМН (В. А. Тутсльян, И. В. Гмо-шинский, С. А. Хотимчеико, И. В. Аксенов, Е. А. Арианова. В. В. Бессонов.

В. М. Верников, М. М. Г. Гаппаров, Р. В. Распопов, О. И. Передеряев, О. Н. Та-нанова, А. А. Шумакова, К. И. Эллер); Учреждением Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Почетного академика If. Ф. Гамалеи РАМН (А. Л. Гинц-бург. Б. С. Народицкий, М. М. Шмаров, Д. Ю. Логунов); Государственным учебно-научным учреждением Биологический факультет Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова (М. П. Кирпичников,

К. В. Шайтан, А. Л. Бонарцев, А. В. Феофанов, Д. В. Багров, В. В. Воинова,

А. П. Босхомджиев, А. С. Шеба нова, А. С. Китаев, М. F. Боздаганян, О. М. Ковалева, А. А. Корчагина, Ф. С. Орехов, Е. С. Трифонова, А. В. Честнова); Учреждением Российской Академии наук Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН (В. О. Попов, Б. Б. Дзантиев, А. В. Жердев); Учреждением Российской академии наук Институт проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН (Д. С. Павлов, Ю. Ю. Дгебуадзе, Е. С. Бродский, Е. Ю. Крысанов,

Т. Б. Демидова, А. В. Купцов); Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы» (ФГУП ВНИИМС) (С. А. Кононогов, С. С. Голубев); Учреждением Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН (К. Г. Скрябин. О. А. Зейналов, Н. В. Равин, С. П. Комбарова); ООО «Интер-лвб» (А. Н. Веденин, Г. В. Казыдуб).

2.    Разработаны в рамках реализации Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008—2010 годы».

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 24 мая 2010 г.

4.    Введены в действие с 24 мая 2010 г.

5.    Введены впервые.

ББК 51.20

ISBN 978—5—7508—0934—9

€> Роспотребнадзор, 2010 С Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010

MP 1.2.2641—10

Содержание

I.    Область применения................................................................................................4

II.    Введение..................................................................................................................4

III.    Общие положения.................................................................................................5

IV.    Перечень и краткая характеристика приоритетных видов

наноматериалов......................................................................................................8

V.    Методы визуализации наноматериалов в составе природных

биологических и абиотических объектов...........................................................11

VI.    Методы анализа химического состава наноматериалов в составе

природных биологических и абиотических объектов.......................................38

VII.    Определение фуллеренов в безалкогольных и сокосодержащих

напитках, нектарах, соках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии......................................................................................................65

VIII.    Определение псевдоаденовирусных наночастиц методом

полимеразной цепной реакции............................................................................73

Приложение. Список использованных сокращений..............................................83

3

MP 1.2.2641—10

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

24 мая 2010 г.

Дата введения: 24 мая 2010 г.

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах

Методические рекомендации _МР    1.2.2641—10_

I. Область применения

1.1.    Настоящие методические рекомендации определяют методы исследования содержания наночастиц и наноматериалов искусственного происхождения в некоторых видах пищевых продуктов и компонентах биоты.

1.2.    Настоящие методические рекомендации применяются в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с процессами производства и оборота наноматериалов.

1.3.    Методические рекомендации разработаны с целью обеспечения единства измерений при анализе наноматериалов искусственного происхождения на всех стадиях их жизненного цикла.

1.4.    Методические рекомендации предназначены для специалистов органов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, научно-исследовательских организаций гигиенического профиля и медицинских учебных заведений, а также иных организаций и учреждений, занимающихся вопросами определения приоритетных наночастиц и наноматериалов.

II. Введение

Использование нанотехнологий и наноматериалов является одним из самых перспективных направлений науки и техники в XXI веке. Особенности поведения вещества в виде наночастиц, свойства которых во

4

MP 1.2.2641—10

многом определяются законами квантовой физики, открывают широкие перспективы в целенаправленном получении материалов с новыми свойствами, такими как уникальная механическая прочность, особые спектральные, электрические, магнитные, химические, биологические характеристики.

В ближайшей перспективе следует ожидать резкого увеличения объёмов производства во всём мире ряда приоритетных наноматериалов, в частности таких, как наночастицы оксидов кремния, титана, цинка, железа, церия, алюминия, металлические наночастицы железа, меди, кобальта, никеля, алюминия, серебра, золота, углеродные нанотрубки, фуллерены, наночастицы биополимеров и рекомбинантных вирусов. Это с неизбежностью приведёт к поступлению значительных количеств наноматериалов в окружающую среду, их накоплению в компонентах биоты и абиотических средах с последующей передачей человеку.

Это делает необходимой разработку государственной системы контроля и надзора за производством нанотехнологической продукции, составной частью которой является мониторинг наличия приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, компонентах биоты, сельскохозяйственных растениях и животных, пищевых продуктах.

Настоящие методические рекомендации разработаны в рамках реализации Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008—2010 гг.» в целях установления единого, научно обоснованного подхода к выявлению и количественному определению наиболее важных видов наноматериалов в природных биологических и абиотических объектах, включая некоторые виды пищевых продуктов.

III. Общие положения

3.1.    Проведение исследований по выявлению и количественному определению наноматериалов определяются правилами надлежащей лабораторной практики.

3.2.    Требования к стаадартным наноматериалам.

3.2.1.    Для верификации, стандартизации и калибровки методов, применяемых при определении наноматериалов, используются стандартные образцы наноматериалов (стандарты).

3.2.2.    Каждый стандарт наноматериала должен быть охарактеризован на соответствие государственному эталонному образцу по показателям химического состава (включая наличие примесей), размеру и форме частиц, удельной площади поверхности, типу кристаллической структуры. Указанные характеристики определяются с использованием методов масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, трансмиссионной электронной микроскопии, определения изотерм адсорбции инертных

5

MP 1.2.2641 — 10

газов, рентгенофазового (рентгенодифракционного) анализа. В случае стандартных образцов фуллеренов при проверке соответствия используется метод обращённофазовой ВЭЖХ.

3.2.3.    Каждый стандартный образец наноматериала должен быть снабжён «Паспортом безопасности наноматериалов», который составляется в соответствии с ГОСТ 30333-95 «Паспорт безопасности вещества (материала)».

3.2.4.    Стандартные образцы наноматериалов должны иметь упаковку для защиты при транспортировке от загрязнения или порчи.

3.2.5.    Хранение стандартных образцов наноматериалов осуществляется отдельно от остальных применяемых веществ с соблюдением условий хранения, указанных в паспорте безопасности, на протяжении всего срока годности образца.

3.2.6.    Хранение и использование стандартных образцов наноматс-риалов осуществляется в соответствии с утвержденным протоколом исследования.

3.3.    Требования к используемому оборудованию.

3.3.1.    Организации, проводящие определение наноматериалов должны быть оснащены необходимым оборудованием, прошедшим метрологический контроль в установленном порядке.

3.3.2.    Эксплуатация оборудования проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения калибровки и текущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание.

3.4.    Планирование и проведение исследований.

3.4.1.    Определение наноматериапов проводится по утвержденному плану с ведением протокола и составлением отчета, в который заносятся все результаты исследований.

3.4.2.    Результаты определения наноматериалов заносятся в протокол, в котором отражены цели работы и методы, используемые для достижения этих целей. Протокол исследования утверждается руководителем организации, проводящей исследования, и включает: цель и задачи исследования, имеющиеся сведения об определяемом наноматериале (физические, химические, биологические, токсикологические свойства), используемые стандартные образцы, схему исследования и её обоснование, методы отбора проб природных объектов, методы исследования, результаты исследований, метрологическую характеристику анализа, статистическую обработку результатов исследования, заключение.

Вносимые в протокол исследования изменения, а также отклонения от протокола (незапланированные события, непредвиденные обстоя-

6

MP 1.2.2641—10

тельства и т. д.) записываются и подписываются исполнителем, датируются в приложении с указанием причин и утверждаются руководителем исследования.

3.5.    Требования к оформлению отчета.

3.5.1.    По окончании проведенных определений оформляется отчет, в котором представляются: название; адрес организации; даты начала и завершения исследований; цель и задачи исследования; характеристика определяемого наноматериала; перечень исследованных образцов и применяемых стандартов; схема проведения исследования; описание методов статистической обработки результатов; результаты исследования, представленные в виде обобщающих таблиц, рисунков с соответствующей статистической обработкой и комментариев к ним; заключение.

3.5.2.    Отчет о результатах проведенного исследования составляется ответственным исполнителем, утверждается руководителем организации и скрепляется печатью организации.

3.6.    Система обеспечения качества исследований.

3.6.1.    Контроль за качеством проведения исследований включает в себя оформление перечня исследований, проводимых в организации, с указанием для каждого исследования руководителя и заказчика, названия определяемого наноматериала, даты начала и состояния каждого исследования на текущий момент времени, оценку протоколов и методов исследования на соответствие правилам лабораторной практики, мониторинг текущих исследований, отчет о проведенных проверках и рекомендации по устранению недостатков.

3.6.2.    Для осуществления контроля качества руководство организации назначает, в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики, ответственных лиц за мониторинг исследования из числа сотрудников, не участвующих в исследовании.

3.7.    Стандартные операционные процедуры.

3.7.1.    Стандартные операционные процедуры разрабатываются на все производственные операции, включая: поступление, идентификацию, маркировку, отбор образцов, обработку проб, использование и хранение исследуемых проб, хранение и аттестацию стандартов; обслуживание и калибровку измерительных приборов и оборудования; приготовление реактивов, ведение записей, отчетов и их хранение; обслуживание помещений; обезвреживание или утилизация наноматериалов и содержащих их образцов (если это необходимо); осуществление программы по обеспечению качества.

3.7.2.    Соблюдение стандартных операционных процедур осуществляется в целях обеспечения качества, достоверности и воспроизводимости результатов исследования.

7

MP 1.2.2641—10

3.7.3.    Отклонения от стандартных операционных процедур должны быть документально оформлены и утверждены руководителем исследования.

3.7.4.    Организация, проводящая настоящие исследования, должна иметь утвержденный порядок приема и учета поступления анализируемых проб и стандартов наноматериалов; проводить учет анализируемых проб и стандартов наноматериалов при поступлении, расходовании, возврате заказчику или их утилизации; принимать меры по обеспечению идентификации исследуемых образцов (название, химическая формула-при наличии) и их стабильности на протяжении всего исследования. Для образцов наноматериалов на этикетке дополнительно должны указываться степень дисперсност и, размер, форма частиц, при необходимости - удельная площадь поверхности и кристаллическая структура.

3.8. Меры конфиденциальности.

3.8.1.    Сотрудники, принимающие участие в проведении исследований, обязаны соблюдать конфиденциальность в отношении любых данных, полученных в ходе исследования, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

3.8.2.    Организация, проводящая исследования, должна обеспечить конфиденциальность результатов исследований в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации.

IV. Перечень и краткая характеристика приоритетных видов наноматериалов

Исходя из ситуации с производством и использованием наночастиц и наноматериалов, а также имеющихся сведений о факторах риска, связанных с наночастицами, при выборе приоритетных видов наноматериалов но содержанию в природных биологических и абиотических объектах и пищевых продуктах следует руководствоваться следующими принципами:

•    в наборе анализируемых наночастиц должны присутствовать представители основных групп;

•    анализируемые наночастицы производятся или в ближайшее время будут производиться в больших объемах;

•    наночастицы могут оказывать воздействие на организм;

•    наночастицы должны быть «стандартными», т. е. хорошо охарактеризованными и однородными по размеру, составу и форме.

Стандартные образцы наноматериалов классифицируются в соот-ветствии с их химическим составом. За основу принята классификация, используемая в международном реестре наночастиц и наноматериалов:

•    металлические наночастицы (Au, Ag, Pt, Pd, Ru, Ni, Си и другие);

MP J.2.2641—10

•    наночастицы оксидов металлов и неметаллов (Si0₂, AJ₂0₃, ТЮ₂, Sn0₂, ZnO, M0O3, V₂0₅, PbO, Fe₂0₃, NiO и другие);

•    полупроводниковые наночастицы (CdS, CdSe, PbS, PbTe, GaN, GaAs, InN и другие);

•    углеродные наночастицы (фуллерены Сб<ь углеродные нанотрубки и некоторые другие);

•    наночастицы органически модифицированных слоистых силикатов и алюмосиликатов (наноглины различного состава);

•    наночастицы из органических разветвленных полимеров (денд-римеры различного состава).

Далее приведены краткие характеристики некоторых видов промышленно выпускаемых наноматериалов, для которых характерны наибольшие объёмы производства и, следовательно, наибольшая вероятность выявления в составе объектов природной среды.

4.1.    Фуллерены - наночастицы, образованные определённым (обычно 60 или 70) числом атомов углерода, организованных в сферический каркас. Фуллерены можно рассматривать как отдельную аллотропическую форму углерода, не тождественную двум ранее известным -алмазу и графиту. Форма выпуска фуллсренов: порошки или растворы в органических растворителях, а также нанопленки (толщиной до 20 нм). В эту группу входят и химически модифицированные фуллерены: гидроксил ированные, галогенированные, связанные с аминокислотами и металлами. Немодифицированные фуллерены практически нерастворимы в воде и полярных растворителях, а также в алифатических углеводородах и жирах; умеренно растворимы в ароматических углеводородах (толуол, ксилол, хлорбензол). Возможно получение коллоидных (мицеллярных) водных растворов фуллеренов в комплексе с некоторыми поверхностно-активными веществами и полимерами. Многие химически модифицированные фуллерены хорошо растворимы в воде. Истинные (молекулярные) растворы фуллеренов окрашены (имеют красный или фиолетовый цвет), имеют характеристический максимумом поглощения в ближнем ультрафиолете при длине волны 324—340 нм.

Контаминация природных биологических и абиотических объектов фуллеренами возможна в ходе их производства, перевозки фуллерен-содержашей продукции и утилизации её отходов.

4.2.    Углеродные нанотрубки по структуре близки к фуллеренам, но представляют собой не сферические, а линейные (протяженные) каркасные конструкции, сложенные атомами углерода. Различают однослойные (одностенные) и многослойные (многостенные) нанотрубки. Последние представляют из себя конструкции из коаксиально вложенных одна в другую однослойных нанотрубок разного диаметра. Другим по-

9

MP 1.2.2641—10

казателем структуры нанотрубок является спиральность, то есть величина атомарного сдвига, достигаемого при замыкании плоского слоя, образованного атомами углерода, в трубку. В промышленных условиях производятся нанотрубки различного диаметра (от 1 до 90 нм) и различной степени очистки в виде порошков, суспензий в органических растворителях, в отдельных случаях в виде гелей или пленок. Нанотрубки, как и фуллерены, практически нерастворимы в воде и полярных растворителях, однако они обладают липофильностью и способны накапливаться в организме. По условиям своего получения одностенные углеродные трубки практически всегда содержат примесь металлических катализаторов (как правило, переходных металлов VIII группы или меди).

4.3.    Наночастицы металлического серебра имеют форму, близкую к сферической, и размер, в зависимости от условий получения, от 5 до 80 нм. Различные препараты наносеребра имеют разную степень гетерогенности по размерам частиц. Препараты наночастиц серебра нестабильны и проявляют выраженную склонность к агрегации с образованием комплексов значительно большего, чем исходные частицы, размера. Стабильные дисперсии наночастиц серебра в воде или в органических растворителях (гексан, бензол и т. д.) могут быть получены в присутствии анионактивных поверхностно-активных веществ или полимеров, например, поливинилпирролидона. Они представляют собой жидкости, окрашенные (в зависимости от концентрации наночастиц) в жёлтый или коричневый цвет.

4.4.    Наиочастицы диоксида титана выпускаются в двух основных видах, различающихся по своей кристаллической структуре: анатаза -представлена наночастицами формы, близкой к сферической, и размером в диапазоне 5—15 нм; рутил - представлен наночастицами в форме палочек или стержней диаметром около 10 и длиной до 40 нм. Обе изоформы наноразмерного диоксида титана в чистом виде представляют собой лёгкие белые порошки, которые интенсивно электризуются. Они не растворимы в воде, но легко диспергируются в воде с образованием жидкостей молочно-белого цвета, которые затем медленно (на протяжении часов) седиментируют. В среде биологических жидкостей различного состава наночастицы диоксида титана агрегируют с образованием комплексов субмикронного размера.

4.5.    Наночастицы диоксида кремния представлены двумя модификациями: аморфной (кремнезем) и кристаллической (кварц). Форма частиц близка к сферической, размер, в зависимости от условий получения, варьирует от 5 до 80 нм. Внешний вид наноматериала - лёгкие порошки белого цвета. Наночастицы аморфного кремнезема обладают различной степенью пористости, поэтому данные оценки их удельной плошали

10

MP 1.2.2641—10

поверхности на основании геометрии частиц и по методу изотерм адсорбции инертных газов могут сильно расходиться. В среде биологических жидкостей различного состава наночастицы диоксида кремния, так же, как и диоксида титана, агрегируют с образованием комплексов субмикронного размера.

4.6.    Наночастицы оксида алюминия имеют сферическую форму и размер в диапазоне, как правило, 30—60 нм. В форме нанопорошков они стабильны, в воде и биологических жидкостях проявляют склонность к а/регации. По своему агрегатному состоянию представляют собой лёгкие порошки белого цвета, нерастворимые в воде и органических растворителях, но растворимые в разбавленных кислотах и щелочах.

4.7.    Наночастицы оксида цинка имеют форму близкую к сферической и размер в диапазоне 10—100 нм. Они представляют собой лёгкий порошок белого цвета, не растворимый в воде и органических растворителях, но легко растворимый в разбавленных кислотах и щелочах.

V. Методы визуализации наномагериалов в составе природных биологических и абиотических объектов

5. /. Электронная микроскопия

Для подтверждения присутствия в биопробах определяемых наноматериалов в форме наночастиц, определения их размера, формы и локализации используется электронная микроскопия. Для наночастиц, максимальный размер которых менее 5 нм, их форма не описывается. Приведенный метод определения наночастиц предназначен для определения частиц металлов и оксидов металлов.

5.7. /. Принцип метода

В основе метода просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) лежит упругое рассеяние пучка электронов при взаимодействии с исследуемым объектом. Изображение формируется потоком рассеянных электронов с энергией 50—200 кэВ, прошедших через находящийся на подложке образец, и при помощи системы магнитных линз проецируется на матрицу ПЗС-камсры.

Для идентификации наночастиц используются аналитические методики ПЭМ - дифракция электронов с выбранной области, спектроскопия характеристических потерь энергии электронов (СХПЭЭ) и измерение изображений в диапазоне характеристических потерь энергии электронов на анализируемом элементе.

В режиме дифракции электронов результатом измерений является электронограмма, содержащая отдельные рефлексы в случае монокри-сталлического образца или концентрические кольца в случае поликри-

11

MP 1.2.2641—10

сталлического образца. Идентификация аморфных наночастиц с помощью дифракции электронов невозможна.

Методика СХПЭЭ может использоваться на ПЭМ, снабжённых системой фильтрации электронов по энергии, и позволяет идентифицировать элементный состав частиц, вплоть до единичных частиц, найденных на образце в режиме регистрации изображения. Электроны, прошедшие через образец, делятся на два типа: первая группа - упруго рассеянные и прошедшие сквозь образец электроны, не испытавшие каких-либо энергетических потерь, вторая группа - неупруго рассеянные электроны, испытавшие потери энергии в результате взаимодействия с образцом. В методике СХПЭЭ анализируется энергетический спектр неупруго рассеянных электронов. Результатом измерения является график, на котором вдоль оси х отложены значения энергий, по оси у - интенсивность сигнала (зависящая от количества электронов, испытавших потери энергии). Пики в спектре потерь энергии, которые обычно называют краями поглощения, различаются для разных материалов и зависят от строения электронных оболочек атомов образца.

Математически спектр характеристических потерь с выбранной точки описывается соотношением:

/(а,Д) - интенсивность сигнала, зарегистрированного приемником (например, CCD-камерой) при выбранном диапазоне энергий (ДЕ-Д/2; ДЕ + Д/2) и углах рассеяния от 0 до а;

--это    количество    электронов,    приходящееся    на    интервал

dw

потерь энергии 1 эВ, которые за 1 с рассеиваются на углы от 0 до а. Величина ДЕ задает середину интервала, в котором снимается спектр; с - коэффициент усиления электронной системы прибора; е - заряд электрона.

На микроскопах, оснащённых системой фильтрации электронов по энергии, помимо режима снятия спектров ХПЭЭ с выбранной области, возможен также режим пространственно-разрешённой СХПЭЭ, или элементное картирование. Конечным результатом эксперимента по картированию некоторого выбранного элемента является дискретное изображение, на котором интенсивность цвета каждой точки пропорциональна концентрации этого элемента.

Каждый элемент имеет максимум на спектре характеристических потерь, соответствующий энергии некоторой электронной оболочки (эти значения табулированы и обычно указаны в программном обеспечении.

dN{a,w)

MP 1.2.2641—10

поставляемом с электронным микроскопом). Для того, чтобы провести элементное картирование, с выбранной анализируемой области снимаются три изображения: два формируются электронами, имеющих энергии, отличные от максимума поглощения (AE_Wi - А/2; AE_Wi + А/2) и (AE_W2 ~ А/2; AEwj + А/2), а третье изображение формируется электронами, имеющими энергию, близкую к максимуму поглощения (AE_Wmax-Д/2; AEwmax + А/2). Первые два изображения используются для того, чтобы сформировать фоновое изображение и вычесть фон из изображения, полученного в диапазоне энергий (AE_Wmax - А/2; AEwmax ⁺ Д/2)- Таким образом, суть элементного картирования заключается в получении изображений на характеристических энергиях искомого элемента.

В единичных случаях фон может быть построен, исходя из единственного изображения (AEwi - А/2; AEwi + А/2), однако для большей универсальности рекомендуется строить фон по двум изображениям, т. е. использовать трехоконную методику. Ширина окна А обычно выбирается 10—15 эВ.

5.1.2. Приборы и оборудование

5.1.2.1. Средства измерения.

Просвечивающий электронный микроскоп с компьютерным управлением со следующими параметрами:

•    диапазон величин ускоряющего напряжения электронов не меньше 80—100 кВ;

•    диапазон увеличений в режиме ПЭМ 10 000—200 000;

•    система фильтрации электронов по энергии и параллельная детектирующая система спектров ХПЭЭ с разрешением по энергии не хуже 2 эВ и областью измерения энергий электронов в диапазоне не менее 0—2 500 эВ;

•    возможность работы в режиме дифракции параллельного пучка электронов;

•    наличие полевой апертурной диафрагмы диаметром 1 мкм или меньше;

•    предельное пространственное разрешение не хуже 0,5 нм.

Система фильтрации электронов по энергии может быть как внут-риколонная, так и постколонная. Рекомендуется использовать микроскопы с ПЗС-камерой в качестве системы регистрации изображений, т. к. результаты сразу же получаются в цифровом виде.

13

MP 1.2.2641—10

Для удобства оператора желательно наличие в составе микроскопа телевизионной камеры, транслирующей изображение с люминесцентного экрана на экран монитора.

Не реже одного раза в месяц или непосредственно перед измерениями проверяется правильность настройки микроскопа, включая следующие параметры: разрешающая способность микроскопа, коррекция астигматизма, калибровка масштаба изображения на ПЗС-камере при различных коэффициентах увеличения (в первую очередь в рабочем диапазоне увеличений). Выбираются ускоряющее напряжение и параметры линз объектива, при которых будут проводиться измерения дифракции электронов, и при этих параметрах определяется (проверяется) эффективная длина камеры (расстояние между образцом и ПЗС-матрицей). Для проверки перечисленных параметров используются соответствующие стандартные образцы.

Разрешающая способность проверяется путем получения изображений от кристаллов, в которых должны быть видны (разрешены) плоскости кристаллической решетки. В зависимости от предельной разрешающей способности микроскопа в качестве стандартных могут быть использованы следующие образцы: кристаллы асбеста (межплоскостные расстояния 0,903 и 0,452 нм), кристаллы фтапоцианина меди (межило-скостные расстояния 1,03 нм), графитизированный углерод (мсжплоско-стные расстояния 0,34 нм), ориентированные кристаллы золота (меж-плоскостные расстояния 0,204, 0,143 и 0,102 нм).

Коррекция астигматизма проверяется с помощью образца, в котором присутствуют неоднородности с четкими краями (стандартный образец - углеродная пленка с дырочками), по симметричности (должны быть симметричны) полос Френеля, формирующихся на краях неоднородностей (на краях дырочек в углеродной пленке), при фокусировке и дефокусировке изображения (выполняется путем дефокусировки линз объектива).

Для калибровки масштаба изображения используется стандартный образец с регулярными неоднородностями, расстояние между которыми известно (например, реплики дифракционных решеток с известным расстоянием между штрихами).

Для измерения длины камеры (расстояния между образцом и ПЗС-матрицей) применяется стандартный поликристаллический образец, для которого известны межплоскостные расстояния кристаллической решетки.

Внеочередная проверка настройки микроскопа проводится, если в процессе измерений выявляются артефакты, которые, по мнению оператора, могут быть связаны с разъюстировкой микроскопа. Если очередная или внеочередная проверка выявила существенную разъюстировку мик-

MF 1.2.2641—10

роскопа по одному или нескольким из перечисленных выше параметров, то определение наночастиц в образцах проводиться не может до устранения неисправности.

Электронный микроскоп может применяться для определения наночастиц в биологических объектах (пробах), если при проверке правильности настройки микроскопа получены следующие результаты:

•    тест на разрешающую способность подтверждает, что разрешение микроскопа не хуже 0,5 нм;

•    удалось добиться эффективной коррекции астигматизма;

•    масштаб изображений откалиброван с точностью до 5 %;

•    измерена длина камеры (расстояние между образцом и ПЗС-матрицей) и определены ускоряющее напряжение и параметры линз объектива, при которых будут проводиться измерения дифракции электронов в исследуемых образцах.

5.1.2.2. Вспомогательное оборудование.

Гомогенизатор - аппарат для измельчения животных тканей и клеток и превращения их в гомогенат. Подходит любой гомогенизатор (ручной Даунса, ручной Поттера Эльвейема, электромеханический, ультразвуковой), который может работать с небольшими количествами (100—300 мг) гомогенизируемых тканей Ультрамикротом, обеспечивающий нарезку срезов для электронной микроскопии толщиной от 30 до 300 нм с точностью не хуже 10 %

Вакуумная система для напыления углеродных пленок

Весы лабораторные аналитические Электрошкаф сушильный лабораторный с погрешностью поддержания температуры ± 2,5 °С в интервале от 50 до 350 °С Холодильник бытовой рН-метр

Колбы плоскодонные конические на 250см³ с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32 Колбы мерные вместимостью 100, 500, I 000 см тип 2-100-2, 2-500-2 Воронки лабораторные Флаконы стеклянные завинчивающиеся из темного стекла (вайл) объемом 10 см³

ГОСТ 24104-2001

ТУ 16-531.639 ГОСТ 16317-87 ГОСТ 27987-88

ГОСТ 25336-82

ГОСТ 1770-74 ГОСТ 25336-82

15

MP 1.2.2641—10

5.1.3. Реактивы и материалы

5.1.3.1. Реактивы.

Хлорид натрия, хч    ГОСТ 4233-77

Фосфат калия однозамещенный, квалификации, хч ГОСТ 4198-75

Фосфат калия двузамещенный трехводный,

квалификации хч    ГОСТ 2493-75

Дистиллированная вода    ГОСТ 6709-79

Четырехокись осмия (0s0₄) фирмы «Sigma-

Aldrich» (США) или аналогичная

Спирт этиловый абсолютированный (содержание

- 99,8 % по объему)    ТУ 6-09-5100—83

Спирт этиловый ректифицированный, 96 % Стр: 16

ГОСТ Р 51652-2000

Уранилацетат фирмы «Sigma-Aldrich» (СИЛА) или аналогичный

Цитрат свинца фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный

Нитрат свинца фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный

Цитрат натрия фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный Гидроксид натрия (NaOH), хч Ацетон, чда

Эпон 812 (Epoxy Embedding Medium) фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный Додецил янтарный ангидрид фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный Мстилэндиковый ангидрид МЭА-610 фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный Тридиметиламинофенол (катализатор DMP-30) фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный Додецилсульфат натрия, хч Протеиназа К, удельная активность >30,0 ед/мг, фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичная Глутаровый альдегид Нейтральный формалин Толуидиновый синий фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный Формвар (Formvar® solution) фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный

ГОСТ 4328-77 ГОСТ 2603-79

ТУ 6-09-64—75

ТУ 6-02-1273—89 ГОСТ 1625-89

MP 1.2.2641—10

Кислота соляная, НС1, хч Кислота серная, H2SO4, хч Кислота азотная, HNO3, хч Дихлорэтан

Протеаза «Флавозим» фирмы «Novozymes» (Дания) или аналогичная

5.1.3.2. Материалы.

Специальные тефлоновые платы с лунками для заливки фирмы «Ted Pella, Inc.» (США) или аналогичные

Лобзик фирмы «Ted Pella, Inc.» (США) или аналогичный

Специальный держатель для блоков фирмы «Ted Pella, Inc.» (США) или аналогичный Бритва фирмы «Ted Pella, Inc.» (США) или аналогичная

ГОСТ 3118-77 ГОСТ 4204-77 ГОСТ 4461-77 ГОСТ 1942-86

ГОСТ 25336-82

ТУ 03-11—03

Чашки 11етри

Бленды, покрытые формваровой пленкой фирмы «Ted Pella, Inc.» (США) или аналогичные Бумажный фильтр типа Whatman или аналогичный

Медные сеточки с предварительно нанесённой формваровой плёнкой или с напыленным тонким слоем углерода фирмы «Ted Pella, Inc.»

(США) или аналогичные Одноразовые пластиковые пробирки Дозаторы пипеточные с диапазоном объема доз 20—200 мм³, 200—1 000 мм³ и дискретности установки доз 5 мм³ с наконечниками Ножницы Пинцет Скальпель

Посуда мерная лабораторная 11осуда лабораторная стеклянная

5.1.3.3. Приготовление растворов.

5.1.3.3.1. Приготовление двукратного раствора фосфорно-солевого буфера (0,2 М) 0,04 М КН₂Р0₄,0,16 М К₂НР0₄, pH 7,2—7,4,1,76 % (w/v) КС1.

Для приготовления раствора на лабораторных весах готовят навески 6,2 г КН₂Р0₄ х Н₂0, 33,64 г К₂НР0₄ х 2Н₂0 и 17,4 г КС1 и вносят их в мерную колбу объемом 1 000 см³, содержащую 500 см³ дистиллирован-

ТУ 64-2-30—80

ТУ 64-16-55—90 ГОСТ 1239-93 ГОСТ 21241-89 ГОСТ 21240-89 ГОСТ 1770-74 ГОСТ 25336-82

17

MP 1.2.2641—10

ной воды. Соли растворяют при перемешивании и объем раствора доводят до 1 ООО см³.

5.1.3.3.2.    Приготовление однократного раствора фосфатно-солевого буфера: 0,02 М КН₂Р0₄, 0,08 М К;НР0₄, pH 7,2—7,4, 0,88 % (w/v) KCI.

Для приготовления 100 см³ однократного раствора фосфатносолевого буфера (0,1 М) к 50 см³ двукратного раствора фосфатносолевого буфера добавляют 50 см³ дистиллированной воды.

5.1.3.3.3.    Приготовление раствора гидроксида натрия, 10 М, pH 14.

Для приготовления 100см³ ЮМ раствора гидроксида натрия в

стеклянный стакан, содержащий 50 см³ дистиллированной воды, вносят 40 г гидроксида натрия. Гидроксид натрия растворяют при перемешивании. После его полного растворения объём раствора доводят до 100 см³ дистиллированной водой.

5.1.3.3.4.    Приготовление раствора гидроксида натрия, 1 М, pH 14.

Для приготовления 100 см³ 1 М раствора гидроксида натрия к

10 см³ 10 М раствора гидроксида натрия добавляют 90 см³ дистиллированной волы.

5.1.3.3.5.    Приготовление раствора для фиксации: 2,5 % (v/v) глутаро-вый альдегид, 2 % (v/v) формалин, на фосфатно-солевом буфере, pH 6,9.

Для приготовления 100 см³ раствора в мерную колбу вносят 50 см³ двухкратною раствора фосфатно-солевого буфера (по п. 5.1.3.3.1), 10 см* коммерческого препарата глутарового альдегида (25% водный раствор) и 5 см³ коммерческого препарата формалина (40 % водный раствор). На pH-метре доводят pH буфера до 6,9 добавлением 1 М НС1 и далее доводят объём раствора до 100 см³ дистиллированной водой.

5.1.3.3.6.    Приготовление 2 %-го (w/v) водного раствора четырёх-окиси осмия.

Для приготовления 100 см³ раствора 2 г 0$0₄ вносят в мерную колбу, содержащую 70—80 см³ дистиллированной воды. Перемешивают до полного растворения Os0₄, затем объём раствора доводят до 100 см³ дистиллированной водой.

5.1.3.3.7.    Приготовление 1 %-го (w/v) четырёхокиси осмия на фосфатно-солевом буфере.

Готовят непосредственно перед использованием! Для приготовления 100 см³ раствора в мерную колбу вносят 50 см³ 2 %-го водного раствора Os0₄ (по п. 5.1.3.3.6) и 50 см³ двукратного раствора фосфатносолевого буфера (поп. 5.1.3.3.1).

5.1.3.3.8.    Приготовление 50 %-го раствора этилового спирта.

В мерную колбу объемом 1 000 см³, содержащую 479 см³ дистиллированной воды, вносят 521 см³ 96 %-го этилового спирта.

5.1.3.3.9.    Приготовление 60 %-го раствора этилового спирта.

MP 1.2.2641—10

В мерную колбу объемом 1 ООО м\ содержащую 375 м³ дистиллированной воды, вносят 625 м³ 96 %-го этилового спирта.

5.1.3.3.10.    Приготовление 70 %-го раствора этилового спирта.

В мерную колбу объемом 1 000 см³, содержащую 271 см³ дистиллированной воды, вносят 729 см³ 96 %-го этилового спирта.

5.1.3.3.11.    Приготовление 80 %-го раствора этилового спирта.

В мерную колбу объемом 1 000 см³, содержащую 167 см³ дистиллированной воды, вносят 833 см³ 96%-го этилового спирта.

5.1.3.3.12.    Приготовление 0,3 %-го раствора формвара в дихлорэтане.

Для приготовления 10 см³ раствора 30 мг формвара помещают в

мерную колбу с притёртой крышкой. Туда же вносят 10 см³ дихлорэтана (градация хч). Полное растворение достигается за 3 дня. Раствор хранят в темноте.

5.1.3.3.13.    Приготовление 2 %-го раствора уранилацетата на 70 %-м этиловом спирте.

Для приготовления 10 см³ раствора 200 мг уранилацетата растворяют в 10 см³ 70 %-го этанола.

5.1.3.3.14.    Приготовление раствора цитрата свинца.

Для приготовления 50 см³ раствора цитрата свинца в мерную колбу на 50 см³ с притёртой пробкой вносят 30 см³ дистиллированной воды, 1,33 г нитрата свинца (PtyNCb)?) и 1,76 г цитрата натрия (Na3C₆H₅0₇). Полностью весь нитрат свинца переходит в цитрат свинца в течение 30 мин при периодическом встряхивании раствора. После 30-минутной инкубации к раствору добавляют 8 см³ 1 N раствора гидроксида натрия. Объём раствора доводят до 50 см³ дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Величина pH готового раствора должна быть в пределах 12 ± 1. Раствор можно хранить до 6 месяцев.

5.1.3.3.15.    Приготовление 0,1 %-го (w/v) водного раствора толуи-динового синего.

Для приготовления 10 см³ раствора 10 мг толуидинового синего растворяют в 10 см³ дистиллированной воды.

5.1.4. Стандартные образцы наноматериалов, применяемые при калибровке метода

В качестве образцов сравнения используются стандартные наноматериалы, которые предполагается обнаружить в биопробах.

Образец сравнения подвергается анализу методами электронной микроскопии на том же самом приборе, на котором осуществляется исследование образцов. Для образца сравнения методом просвечивающей электронной микроскопии должно быть получено распределение по размерам и описана форма наночастиц. Анализ проводится и данные

19