ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ Метод определения содержания водорастворимых

витаминов

Издание официальное

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом мясной промышленности имени В.М. Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМП им В.М. Горбатова Россельхозакадемии)

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 226 «Мясо и мясная продукция»

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 июня 2013 г. № 362-ст

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0-2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном формационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (gost.ru)

© Стандартинформ, 2014

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ P 55482-2013

Расхождение между результатами двух отдельных определений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости, R, значения которого приведены в таблице 1.

Результат анализа при доверительной вероятности Р = 0,95 представляют в виде

\Xi-Xz\tR    (4)

где Xi и Хг - результаты двух отдельных определений, выполненных в разных лабораториях,

мг/кг;

R- предел воспроизводимости, мг/кг.

Границы относительной погрешности 5, находящиеся с доверительной вероятностью Р = 0,95, при соблюдении условий настоящего стандарта, не должны превышать значений, приведенных в таблице 1.

10    Точность метода

Точность метода была установлена при межлабораторном испытании, проведенном в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 4.2).

Показатели прецизионности метода определены в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-2 (пункт 7.5).

11    Требования безопасности

11.1    При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

11.2    Помещение, в котором проводятся измерения, должно быть оборудовано приточновытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

11.3    При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования

безопасности по ГОСТ Р 12.1.019.

11.4    При подготовке проб необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с ультразвуковой баней по ГОСТ 12.1.001.

УДК 637.5.04/.07:006.354    ОКС    67.120.10

Ключевые слова: мясо, мясные продукты, водорастворимые витамины, высокоэффективная жидкостная хроматография, отбор и подготовка проб, проведение измерений, метрологические характеристики, точность метода

Подписано в печать 01.08.2014. Формат 60х84¹/в.

Уел. печ. л. 1,40. Тираж 66 экз. Зак. 3190.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ Метод определения содержания водорастворимых витаминов

Meat and meat products.

Method for determination of water-soluble vitamins

Дата введения - 2014-07-01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на мясо и мясную продукцию, в том числе субпродукты, а так же специализированные и функциональные мясные продукты, и устанавливает метод определения массовой доли следующих форм водорастворимых витаминов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ):

В₁ - тиамин, тиаминмонофосфат, тиаминдифосфат, тиаминтрифосфат;

В₂ — рибофлавин, флавинмононуклеотид, флавиндинуклеотид;

В₃ - никотиновая кислота, никотинамид;

В₅ - пантотеновая кислота, кофермент А;

В₆ - пиридоксин, пиридоксамин, пиридоксаль, пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат;

В-12- цианкобаламин, гидроксикобаламин, метилкобаламин, 5-дезоксиаденозилкобаламин;

С - аскорбиновая кислота;

Н - биотин.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р 51447-99 Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб ГОСТ Р 52501-2005 Вода для лабораторного анализа. Технические условия ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ 12.1.001-89 Система стандартов безопасности труда. Ультразвук. Общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 83-79 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия ГОСТ 4025-95 Мясорубки бытовые. Технические условия

ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

Издание официальное

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия ГОСТ 5823-78 Реактивы. Цинк уксуснокислый 2-водный. Технические условия ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9245-79 Потенциометры постоянного тока измерительные. Общие технические условия ГОСТ 9792-73 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб ГОСТ 14261-77 Кислота соляная особой чистоты. Технические условия ГОСТ 20264.4-89 Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности ГОСТ 20469-95 Электромясорубки бытовые. Технические условия

ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотноосновного титрования

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии по стандартизации в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения, Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

3    Сущность метода

Метод основан на экстракции водорастворимых витаминов путем последовательного проведения кислотного и ферментативного гидролиза, осаждении белков, и количественном определении витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в ультрафиолетовой (УФ) области спектра с заданной длиной волны.

Полученные результаты в виде пиков на хроматограмме сопоставляют с пиками стандартных образцов с заведомо известными концентрациями.

4    Средства измерения, вспомогательное оборудование, материалы и реактивы

Хроматограф жидкостной, оборудованный:

-    детектором многоволновым УФ, обеспечивающим измерение при длинах волн 210,245 и 254 нм;

-    насосом градиентным;

-    колонкой хроматографической для ВЭЖХ длиной 150-250 мм и диаметром 2,1-4,6 мм с обращенной фазой С18 либо С16 размером частиц 3,5-5 мкм, имеющая эффективность не менее 5000 теоретических тарелок по пикам витаминов;

-    блоком термостатирования колонок с поддержанием температуры 30 °С;

-    программным обеспечением.

Баня ультразвуковая лабораторная с регулятором времени.

Баня водяная лабораторная, имеющая диапазон температур от 20 °С до 100 °С, с точностью поддержания температуры ± 0,5 °С.

Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ± 0,1 мг.

pH-метр со стеклянным и хпорсеребряным электродами (или комбинированным стеклянным электродом) с диапазоном измерений от 0 до 14 ед. pH по ГОСТ 9245.

Центрифуга лабораторная, с центробежным ускорением 5000 д. ²

ГОСТ P 55482-2013

Холодильник по ГОСТ 26678.

Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025 или электромясорубка бытовая по    ГОСТ    20469 с

отверстиями решетки диаметром от 2 до 3 мм.

Дозаторы пипеточные переменного объема дозирования 0,200-2,000 см³ с относительной погрешностью дозирования ± 1 %.

Дозаторы пипеточные переменного объема дозирования 1,0-10,0 см³ с относительной погрешностью дозирования ± 1 %.

Стаканы В-1-100 по ГОСТ 25336.

Пробирки центрифужные конические вместимостью 50 см³ с завинчивающейся крышкой. Фильтры мембранные, материал мембраны - полиамид, размер диаметра пор 0, 45 мкм, стерильные.

Фильтр «синяя лента» обеззоленная, диаметром не менее 11 см.

Виалы вместимостью 1,8 см³.

Колбы 2-100-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

Колбы конические со шлифом вместимостью 10 и 100 см³ по    ГОСТ    23932.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода для лабораторного анализа по ГОСТ Р 52501. Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552, х. ч.

Калий фосфорнокислый, однозамещенный по ГОСТ 4198, х. ч.

Кислота соляная по ГОСТ 14261, ос. ч.

Кислота серная по ГОСТ 4204, х. ч.

Натрий углекислый по ГОСТ 83, х. ч.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч.

Кислота трихпоруксусная кристаллическая, х. ч.

Цинк уксуснокислый 2-водный по ГОСТ 5823, ч. д. а.

Ацетонитрил, ос. ч.

Препарат ферментативный а-амилаза из Aspergillus oryzae амилолитической активностью (АС) 2000 ед./г

Тиамина гидрохлорид (Витамина В^ массовой долей основного вещества не менее 99,0 %. Рибофлавин (Витамин В₂) массовой долей основного вещества не менее 99,0 %.

Никотиновая кислота (Витамин В₃) массовой долей основного вещества не менее 98,0 %. Кислота пантотеновая (Витамин В₅) массовой долей основного вещества не менее 99,0 %. Пиридоксина гидрохлорид (Витамин В₆) массовой долей основного вещества не менее 99,0 %. Цианокобаламин (Витамин Bi₂) массовой долей основного вещества не менее 99,0 %.

Кислота аскорбиновая (Витамин С) массовой долей основного вещества не менее 99,9 %. Биотин (Витамин Н) массовой долей основного вещества не менее    99,0    %.

Допускается использование других средств измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных в настоящем стандарте.

Допускается использование других реактивов по качеству и чистоте не ниже вышеуказанных

5    Отбор и подготовка проб

5.1    Отбор проб - по ГОСТ Р 51447, ГОСТ 9792.

5.2    Пробу продукта измельчают, дважды пропуская через мясорубку с диаметром решетки 2-3 мм, и тщательно перемешивают.

5.3    Подготовленную пробу помещают в стеклянную колбу с притертой пробкой.

Срок хранения подготовленной пробы в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С - не более 2 ч. Подготовку проб определению проводят по 6.2.

6    Подготовка к проведению измерений

6.1    Приготовление растворов

6.1.1    Приготовление буферного раствора калия фосфорнокислого однозамещенного молярной концентрации с (КН₂Р0₄) = 0,025 моль/дм³, 3,4 ед. pH (фосфатный буфер)

3,40 г калия фосфорнокислого однозамещенного растворяют в стакане в небольшом количестве дистиллированной воды, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³ и доводят объем дистиллированной водой до метки. Затем добавляют по каплям ортофосфорную кислоту и доводят значение pH до 3,4 ед. pH.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 7 дней.

Раствор фильтруют, пропуская через складчатый фильтр «синяя лента» обеззоленная.

Перед использованием раствор дегазируют на ультразвуковой бане в течение 25-30 мин.

6.1.2 Приготовление основных растворов витаминов

6.1.2.1    Основной раствор витамина В₁ массовой концентрации 0,06 мг/см³

Взвешивают (0,0060 ± 0,0001) г гидрохлорида тиамина, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 70-80 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают до полного растворения и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Раствор готовят перед использованием.

6.1.2.2    Основной раствор витамина В₂ массовой концентрации 0,06 мг/см³

Взвешивают (0,030 ± 0,001) г рибофлавина, переносят в мерную колбу вместимостью 500 см³, добавляют 400-450 см³ дистиллированной воды, с помощью механического дозатора добавляют 0,20 см³ ортофосфорной кислоты, нагревают до температуры 70 °С - 80 °С на водяной бане до полного растворения витамина, охлаждают и доводят до метки дистиллированной водой.

Раствор готовят перед использованием.

6.1.2.3    Основной раствор витамина В₃ массовой концентрации 0,2 мг/см³

Взвешивают (0,020 ± 0,001) г никотиновой кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 70-80 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают до полного растворения и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Раствор готовят перед использованием.

6.1.2.4    Основной раствор витамина В₅ массовой концентрации 0,2 мг/см³

Взвешивают (0,020 ± 0,001) г пантотеновой кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 70-80 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают до полного растворения и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Раствор готовят перед использованием.

6.1.2.5    Основной раствор витамина В₆ массовой концентрации 0,06 мг/см³

Взвешивают (0,0060 ± 0,0001) г гидрохлорида пиридоксина, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 70-80 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают до полного растворения и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Раствор готовят перед использованием.

6.1.2.6    Основной раствор витамина В₁₂ массовой концентрации 0,01 мг/см³

Взвешивают (0,0010 ± 0,0001) г цианокобаламина, переносят в мерную колбу вместимостью 500 см³, добавляют 400-450 см³ дистиллированной воды, с помощью механического дозатора добавляют 0,20 см³ ортофосфорной кислоты и нагревают до температуры 70 °С - 80 °С на водяной бане до полного растворения витамина, охлаждают и доводят до метки дистиллированной водой.

Раствор готовят перед использованием.

6.1.2.7    Основной раствор витамина Н массовой концентрации 0,01 мг/см³

Взвешивают (0,0010 ± 0,0001) г витамина Н, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 70-80 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают до полного растворения и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Раствор готовят перед использованием.

6.1.3 Приготовление градуировочных растворов витаминов

6.1.3.1    Градуировочный раствор смеси витаминов Bi, В₂, В₆ массовой концентрации 0,02 мг/см³

В коническую колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 10 см³ с помощью механического

дозатора вносят по 2 см³ основных растворов витамина В₁ (см. 6.1.2.1), витамина В₂ (см. 6.1.2.2), витамина В₆ (см. 6.1.2.5).

Раствор готовят перед использованием.

6.1.3.2    Градуировочный раствор смеси витаминов В₃ и В₅ массовой концентрации 0,1 мг/см³

В коническую колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 10 см³ с помощью механического дозатора вносят по 2 см³ основных растворов витамина В₃ (см. 6.1.2.3) и витамина В₅ (см. 6.1.2.4).

Раствор готовят перед использованием.

6.1.3.3    Градуировочный раствор смеси витамина В₁₂ и витамина Н массовой концентрации 0,005 мг/см³

В коническую колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 10 см³ с помощью механического дозатора вносят по 2 см³ основных растворов витамина В₁₂ (см. 6.1.2.6) и витамина Н (см. 6.1.3.7).

Раствор готовят перед использованием.

6.1.3.4    Градуировочный раствор витамина С массовой концентрации    0,5    мг/см³

Взвешивают (0,050 ± 0,001) г витамина С, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³,

добавляют 70-80 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают до полного растворения и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Раствор готовят перед использованием.

ГОСТ P 55482-2013

6.1.4 Приготовление рабочих растворов

6.1.4.1    Раствор соляной кислоты молярной концентрации с (HCI) = 0,1 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1 дм³ добавляют 700 - 800 см³ дистиллированной воды, с помощью механического дозатора приливают 8,5 см³ концентрированной кислоты соляной (р = 1,188 г/см³) и доводят объем до метки дистиллированной водой.

6.1.4.2    20 %-ный раствор натрия углекислого

Взвешивают (20,00 ± 0,05) г натрия углекислого, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и растворяют дистиллированной водой, доводя объем до метки.

6.1.4.3    20 %-ный раствор трихпоруксусной кислоты

Взвешивают (20,00 ± 0,05) г трихпоруксусной кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и растворяют дистиллированной водой, доводя объем до метки.

6.1.4.4    Раствор кислоты серной молярной концентрации с (H₂S0₄) = 1,0 моль/дм³ готовят по ГОСТ 25794.1.

6.1.4.5    Раствор натрия гидроокиси молярной концентрации c(NaOH) = 10,0 моль/дм³

Взвешивают (40,00 ± 0,05) г натрия гидроокиси, переносят в мерную колбу вместимостью 100

см³ и растворяют дистиллированной водой, доводя объем до метки.

6.1.4.6    25 %-ный раствор цинка уксуснокислого 2-водного

Взвешивают (25,00 ± 0,05) г цинка уксуснокислого 2-водного, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и растворяют дистиллированной водой, доводя объем до метки.

6.1.4.7    5 %-ный раствор трихпоруксусной кислоты

Взвешивают (5,00 ± 0,01) г трихпоруксусной кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и растворяют дистиллированной водой, доводя объем до метки.

6.1.4.8    3 %-ный раствор трихпоруксусной кислоты

В мерную колбу вместимостью 100 см³ отвешивают (3,00 ± 0,01) г трихпоруксусной кислоты и растворяют в дистиллированной воде, доводя объем до метки.

6.1.4.9    Срок хранения рабочих растворов при комнатной температуре в темном месте:

-    рабочего раствора натрия гидроокиси (см. 6.1.4.5) - не более 1 мес;

-    остальных растворов - не более 2 мес.

6.2 Подготовка пробы

6.2.1    Подготовка пробы для определения витамина В₁ и В₂

(5,00 ± 0,05) г продукта помещают в коническую колбу, вместимостью 100 см³, добавляют 40 см³ соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм³ (см. 6.1.4.1), закрывают пробкой и тщательно перемешивают. Колбу с содержимым нагревают на водяной бане при температуре 100 °С в течение 30 мин, затем охлаждают.

После охлаждения доводят pH гидролизата до (4,5 ± 0,1) ед. pH 20 %-ным раствором натрия углекислого (см. 6.1.4.2). Добавляют (0,100 ± 0,005) г ферментативного препарата а-амилазы из Aspergillus oryzae. Возможно использование ферментного препарата в форме раствора. Рекомендуется уточнять активность фермента по ГОСТ 20264.4.

Колбу с содержимым помещают на водяную баню и выдерживают 16 ч при температуре 37 °С в защищенном от света месте.

Для осаждения белков к гидролизату добавляют 3 см³ 20 %-ного раствора трихпоруксусной кислоты (см. 6.1.4.3). Колбу с содержимым нагревают на водяной бане при температуре 100 °С в течение 15 мин.

Содержимое колбы переносят в центрифужную пробирку объемом 50 см³, доводят раствор до метки дистиллированной водой и центрифугируют 5 мин с центробежным ускорением 5000 д.

Полученный супернатант пропускают через мембранный фильтр с размером диаметра пор 0,45 мкм в виалу из темного стекла.

Срок хранения подготовленной пробы в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С - не более 12 ч.

6.2.2    Подготовка пробы для определения витамина В₃

(5,00 ± 0,05) г продукта помещают в коническую колбу вместимостью 100 см³, добавляют 40 см³ серной кислоты молярной концентрации 1,0 моль/дм³ (см. 6.1.4.4). Колбу с содержимым нагревают на водяной бане при 100 °С в течение 90 мин, затем охлаждают.

После охлаждения доводят значение pH до 10,0-11,0 ед. pH раствором гидроокиси натрия молярной концентрации 10,0 моль/дм³ (см. 6.1.4.5).

Для осаждения белков к гидролизату добавляют 2 см³ 25 %-ного раствора цинка уксуснокислого 2-водного (см. 6.1.4.6).

Содержимое колбы переносят в центрифужную пробирку объемом 50 см³, доводят раствор до метки дистиллированной водой и центрифугируют 5 мин с центробежным ускорением 5000 д.

Полученный супернатант пропускают через мембранный фильтр с размером диаметра пор 0,45 мкм в виалу.

5

Срок хранения подготовленной пробы в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С - не более 24 ч.

6.2.3    Подготовка пробы для определения витамина В₅

(5,00 ± 0,05) г продукта помещают в коническую колбу, вместимостью 100 см³, добавляют 40 см³ дистиллированной воды. Доводят значение pH до (4,5 ± 0,1) ед. pH, приливая по каплям ортофосфорную кислоту. Добавляют (0,100 ± 0,005) г ферментативного препарата а-амилазы из Aspergillus oryzae, возможно использование ферментного препарата в форме раствора. Рекомендуется уточнять активность фермента по ГОСТ 20264.4.

Колбу с содержимым помещают на водяную баню и выдерживают 16 ч при температуре 37 °С в защищенном от света месте.

Для осаждения белков к гидролизату добавляют 3 см³ 20 %-ного раствора трихпоруксусной кислоты (см. 6.1.4.3). Содержимое колбы переносят в центрифужную пробирку объемом 50 см³, доводят раствор до метки дистиллированной водой и центрифугируют 5 мин с центробежным ускорением 5000 д.

Полученный супернатант пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в виалу.

Срок хранения подготовленной пробы в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С - не более 4 ч.

6.2.4    Подготовка пробы для определения витамина В₆ и витамина В₁₂

(10,0 ± 0,1) г продукта помещают в коническую колбу, вместимостью 100 см³, добавляют 40 см³ 5 %-ного раствора трихпоруксусной кислоты (см. 6.1.4.7), закрывают пробкой и тщательно перемешивают. Колбу с содержимым нагревают на водяной бане при температуре 100 °С в течение 30 мин, затем охлаждают.

После охлаждения доводят значение pH до (4,5 ±0,1) ед. pH 20 %-ным раствором натрия углекислого. Добавляют (0,200 ± 0,005) г ферментативного препарата а-амилазы из Aspergillus oryzae, возможно использование ферментного препарата в форме раствора. Рекомендуется уточнять активность фермента по ГОСТ 20264.4.

Колбу с содержимым помещают на водяную баню и выдерживают 16 ч при температуре 37 °С в защищенном от света месте.

Содержимое колбы переносят в центрифужную пробирку объемом 50 см³, доводят раствор до метки дистиллированной водой и центрифугируют 5 мин с центробежным ускорением 5000 д.

Полученный супернатант пропускают через мембранный фильтр с размером диаметра пор 0,45 мкм в виалу.

Срок хранения подготовленной пробы в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С - не более 12 ч.

6.2.5    Подготовка пробы для определения витамина С

(5,00 ± 0,05) г продукта помещают в коническую колбу вместимостью 100 см³, добавляют 40 см³ 3 %-ного раствора трихпоруксусной кислоты (см. 6.1.4.8), закрывают пробкой и перемешивают. Колбу с содержимым выдерживают на ультразвуковой бане при температуре 20 °С в течение 30 мин.

Содержимое колбы переносят в центрифужную пробирку объемом 50 см³, доводят раствор до метки дистиллированной водой и центрифугируют 5 мин с центробежным ускорением 5000 д.

Полученный супернатант пропускают через мембранный фильтр с размером диаметра пор 0,45 мкм в виалу.

Срок хранения подготовленной пробы в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С - не более 4 ч.

6.2.6    Подготовка пробы для определения витамина Н

(10,0 ±0,1) г продукта помещают в коническую колбу, вместимостью 100 см³, добавляют 40 см³ серной кислоты, молярной концентрации 1,0 моль/дм³ (см. 6.1.4.4). Колбу с содержимым нагревают на водяной бане при температуре 100 °С в течение 120 мин, затем охлаждают.

После охлаждения доводят значение pH до (4,5 ±0,1) ед. pH 20 %-ным раствором натрия углекислого (см. 6.1.4.2). Добавляют (0,200 ± 0,005) г ферментативного препарата а-амилазы из Aspergillus oryzae, возможно использование ферментного препарата в форме раствора. Рекомендуется уточнять активность фермента по ГОСТ 20264.4.

Колбу с содержимым помещают на водяную баню и выдерживают 16 ч при температуре 37 °С в защищенном от света месте.

Для осаждения белков к гидролизату добавляют 3 см³ 20 %-ного раствора трихпоруксусной кислоты (см. 6.1.4.3). Колбу с содержимом нагревают на водяной бане при температуре 100 °С в течение 15 мин.

Содержимое колбы переносят в центрифужную пробирку объемом 50 см³, доводят раствор до метки дистиллированной водой и центрифугируют 5 мин с центробежным ускорением 5000 д.

Полученный супернатант пропускают через мембранный фильтр с размером диаметра пор 0,45 мкм в виалу.

Срок хранения подготовленной пробы в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С - не более 12 ч.

6.3 Градуировка хроматографа

6

ГОСТ P 55482-2013

6.3.1    Градуировку хроматографа выполняют, используя градуировочные растворы витаминов, приготовленные по 6.1.3.

6.3.2    Для каждого градуировочного раствора проводят два параллельных измерения по 7.1.

6.3.3    Каждую хроматограмму обрабатывают в соответствии с компьютерной программой, определяя время удерживания, спектральные отношения и площади пиков.

6.3.4    Из площади пиков двух параллельных измерений, рассчитанных с помощью компьютерной программы, вычисляют среднеарифметическое значение для каждой массовой концентрации каждого витамина.

7 Проведение измерений

7.1    Условия проведения хроматографического анализа подбирают в зависимости от вида применяемого жидкостного хроматографа и хроматографической колонки.

В качестве примера могут быть приведены следующие условия хроматографического определения водорастворимых витаминов, выполненные на жидкостном хроматографе с колонкой 5 мкм 4,6 х 150 мм^{4 5}.

Подвижная фаза: буферный раствор калия фосфорнокислого однозамещенного (3,4 ед. pH), ацетонитрил, вода.

Перед введением пробы, колонку кондиционируют 4 мин буферным раствором калия фосфорнокислого однозамещенного с pH 3,4 ед. pH в соотношении с водой 35 : 65.

0,02 см⁶ анализируемого раствора вводят в подготовленный к работе жидкостный хроматограф и записывают хроматограмму в следующих условиях.

Градиент: 16 мин ацетонитрил от 0 % до 30 %, дистиллированная вода от 65 % до 35 %, буферный раствор калия фосфорнокислого однозамещенного (3,4 ед. pH) 35 %.

Скорость подачи элюента 1,0 см⁶/мин.

Температура колонки 30 °С.

Хроматограмму записывают по следующим длинам волн:

210 нм-для витамина В₅, витамина В₆, витамина В-|₂, витамина Н;

245 нм - для витамина С;

254 нм - для витамина Bi, витамина В₂, витамина В₃.

7.2    Идентификацию пиков хроматограммы исследуемого раствора проводят сравнением с хроматограммой градуировочного раствора по двум параметрам: времени удерживания и спектральному отношению R.

7.3    Если время удерживания и спектральные отношения пиков хроматограммы анализируемого раствора совпадают в пределах допускаемых отклонений (ЛR < 0,05, Л tR < 3 %) с временем удерживания и спектральными отношениями соответствующих им пиков хроматограммы градуировочного раствора, результат идентификации считают положительным.

7.4    Если спектральные отношения совпадают в пределах допускаемого отклонения, а разница времени удерживания пиков хроматограммы исследуемого раствора и хроматограммы градуировочного раствора больше допускаемого отклонения, проводят хроматографический анализ соответствующего градуировочного раствора по 7.1 и сравнивают время удерживания. В случае совпадения в дальнейшем используют новую хроматограмму в качестве образца.

В случае повторного несовпадения времени удерживания используют метод добавок, для чего в анализируемый раствор вносят определенный объем растворов витаминов с массовой концентрацией, сравнимой с массовой концентрацией «сомнительных» пиков и анализируют по 7.1.

Если на хроматограмме пробы с добавкой площади «сомнительных» пиков увеличились на величину, соответствующую величине добавки, эти пики относятся к определяемым компонентам.

Если на хроматограмме пробы с добавкой наряду с «сомнительными» пиками присутствуют пики, время удерживания и спектральные отношения которых совпадают с соответствующими параметрами добавленных компонентов, сомнительные пики не относятся к определяемым компонентам.

7.5    Если время удерживания соответствующих пиков хроматограммы анализируемого раствора и хроматограммы градуировочного раствора совпадают в пределах допускаемого отклонения, а разница спектральных отношений больше допускаемого отклонения, настоящий метод неприменим к данному образцу.

7.6 Массовая концентрация витаминов в анализируемом растворе не должна превышать предельных значений градуировочных растворов. В случае превышения анализируемый раствор, содержащий витамины с помощью механического дозатора разбавляют в рассчитанное количество раз и проводят хроматографический анализ разбавленных растворов. Если массовая концентрация витаминов в анализируемом растворе ниже предельного значения градуировочного раствора, то необходимо увеличить массу продукта, используемого при подготовке пробы.

8    Обработка результатов измерений

Массовую долю каждого витамина в продукте X, мг/кг, рассчитывают по формуле

Ccr-Sx-Vp    (1)

X =    -

S_CT ■ т ■ 10ОО

где С_ст - массовая концентрация витамина в градуировочном растворе, мг/см³;

S_x- площадь пика витамина в анализируемой пробе, уел. ед. (см. 6.3.4);

S_CT- площадь пика индивидуального витамина в градуировочном растворе, уел. ед.;

Vp - объем раствора для пробоподготовки (сумма объемов раствора для гидролиза, раствора для осаждения белков и раствора для доведения pH до необходимого значения), см³; т- масса анализируемой пробы, г;

1000 - коэффициент перевода массы анализируемой пробы (г в кг).

За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, округленное до второго десятичного знака.

9    Метрологические характеристики

Расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных одним оператором при анализе одной и той же пробы с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов, не должно превышать предела повторяемости (сходимости), г, значения которого приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Метрологические характеристики метода при доверительной вероятности Р= 0,95

Наименование определяемого компонента Диапазон измеряемых массовых концентраций, мг/кг Границы относительной погрешности, 5, % Предел повторяемости, г, мг/кг Предел воспроизводимости, R, мг/кг Витамин В-1 0,5-20,0 18 0,15 Xqq 0,30 Хсо Витамин В2 0,5-20,0 35 0,3 ХСр 0,45 Хсо Витамин В3 5,0-100,0 20 0,15 Xqq 0,30 Хсо Витамин В5 5,0-100,0 20 0,3 ХСр 0,45 Хсо Витамин В6 0,5-20,0 25 0,2 хСр 0,30 Хсо Витамин В-12 0,01 -5,0 34 0,30 xCD 0,45 Хсо Витамин С 10,0-500,0 23 0,15 Xqq 0,30 Хсо Витамин Н 0,01 -5,0 20 0,15 Xqq 0,30 Хс„ хср — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, (мг/кг); Хср - среднеарифметическое значение результатов двух отдельных определений, выполненных в разных лабораториях, (мг/кг).

Результат анализа при доверительной вероятности Р= 0,95 представляют в виде

\х₁-х₂\±г    (3)

где х₁ и х₂ - результаты двух параллельных определений, мг/кг; г- предел повторяемости, мг/кг.

1

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ»

123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.ru    info@gostinfo.ru

2

3

4

В настоящем стандарте используется жидкостной хроматограф Dionex Ultimate 3000 с

5

колонкой Acclaim PolarAdvantage II. Данная информация является рекомендуемой, приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования других

6

средств измерений с аналогичными свойствами.