Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

27 страниц

456.00 ₽

Купить ГОСТ 20264.4-89 — официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на ферментные препараты и устанавливает методы определения активности амилолитического комплекса препаратов микробного происхождения

  Скачать PDF

Заменяет ГОСТ 20264.4-74

Ограничение срока действия снято: Протокол № 4-93 МГС от 21.10.93 (ИУС 4-94).

С 01.01.2013 прекращено применение на территории РФ в части пищевых продуктов. Действует ГОСТ Р 54330-2011 (ИУС 3-2012)

Оглавление

1 Методы отбора проб

2 Определение амилолитической активности (АС)

3 Определение глюкоамилазной активности

4 Определение осахаривающейся активности (ОС)

Показать даты введения Admin

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

ГОСТ 20264.4-89

S коп. БЗ 3—89/249


Издание официальное

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ

Москва

УДК 577.15.001.4 : 006.354    Группа    С09

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ГОСТ

20264.4—89

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ

Методы определения амилолитической актианости

Enzyme preparations. Methods for fhe determination of amylase activity

ОКСТУ 9291

Срок действия с 01.07.90 до 01.07.95

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты и устанавливает методы определения активности амилолитического комплекса ферментных препаратов микробного происхождения.

1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

Методы отбора проб — по ГОСТ 20264.0.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (АС)

2.1.    Метод основан на гидролизе крахмала ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы.

Амилолитическая активность характеризует способность амилолитических ферментов катализировать гидролиз крахмала до декстринов различной молекулярной массы и выражается числом единиц указанных ферментов в 1 г препарата.

За единицу амилолитической активности (АС) принята способность фермента при определенных значениях температуры, pH и времени действия катализировать до декстринов различной молекулярной массы 1 г крахмала, что составляет 30% крахмала, введенного в реакцию.

Издание официальное ★

2.2.    А п п а р а ту р а, материалы, реактивы

Перепечатка воспрещена © Издательство стандартов, 1989

Весы лабораторные общего назначения не ниже 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Колориметр фотоэлектрический лабораторный (фотоэлектроколориметр) по ГОСТ 12083, обеспечивающий измерения в интервалах длин волн 434—450 нм и 630—670 нм с погрешностью ±1% абс. (по коэффициенту пропускания) или 0,01 Д (по оптической плотности) или спектрофотометр.

Прибор для измерения pH среды в диапазоне 0—14 с погрешностью измерения ±0,1 pH.

Термостат или ультратермостат, обеспечивающий температуру нагрева (30,0±0,2)°С.

Баня водяная.

Мешалка магнитная.

Термометры по ГОСТ 215 с пределами измерения 0—55°С и ценой деления шкалы не более 0,1°С.

Холодильник бытовой.

Стаканчики для взвешивания по ГОСТ 25336.

Стаканы вместимостью от 100 до 2000 см3 по ГОСТ 25336.

Колбы типа Кн вместимостью от 100 до 2000 см3 по ГОСТ 25336.

Колбы мерные наливные 1 или 2-го исполнения вместимостью 100, 200, 250 и 1000 см3 по ГОСТ 1770.

Воронки типа В по ГОСТ 25336.

Пипетки 1, 2 и 3-го исполнения вместимостью от 0,5 до 20 см3 и 100 см3 по ГОСТ 20292.

Пробирки П1—21—200, или П1—16—150, или П2—19—180, или П2—16—150(180) по ГОСТ 25336.

Бюретка типа I; 1, 2 или 3-го исполнения по ГОСТ 20292.

Эксикатор по ГОСТ 25336.

Секундомер по ГОСТ 5072.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Крахмал растворимый по ГОСТ 10163.

Ацетатный буферный раствор с pH 4,7, приготовленный по ГОСТ 4919.2.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный по ГОСТ 4172, раствор молярной концентрацией '/is моль/дм3.

Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, раствор солярной концентрацией '/is моль/дм3.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрацией вещества эквивалента 0,1 моль/дм3, приготовленный по ГОСТ

4919.2.

Йод по ГОСТ 4159.

Калий йодистый по ГОСТ 4232.

ГОСТ 20164.4-89 С. 3

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания:

1.    Все реактивы должны быть квалификации ч„ х. ч. или ч. д. к.

2.    Допускается использование импортной посуды и приборов с метрологическими характеристиками и реактивов с квалификацией не ниже отечественных.

2.3. Подготовка к анализу

2.3.1.    Приготовление раствора крахмала с массовой долей 1% С субстрата)

(1,00±0,01) г крахмала, взятого с учетом влажности, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 25 смг воды и перемешивают. Затем добавляют в колбу еще 25 см3 во ды, помещают колбу в кипящую водяную баню не менее чем на 10—15 мин, непрерывно перемешивая содержимое до полного растворения крахмала. После этого содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 см3 ацетатного буферного раствора с pH 4,7 (для препаратов грибного происхождения), фосфатного буферного раствора с pH 6,0 (для препаратов бактериального происхождения) или фосфатного буферного раствора с pH 5,6 (для препаратов из дрожжевых микроорганизмов). Объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой и содержимое колбы перемешивают. Раствор должен быть прозрачным.

Раствор крахмала готовят в день проведения анализа.

2.3.2.    Приготовление фосфатного буферного раствора с pH 5,6 и pH 6,0

Смешивают растворы фосфорнокислого натрия и фосфорнокислого калия концентрацией ‘/is моль/дм3 в соотношении 0,5:9,5 (для pH 5,6) и 1:9 (для pH 6,0).

Величину pH проверяют на приборе. В случае отклонения pH буфера от требуемого, соответствующими растворами доводят его до нормы.

2.3.3.    Приготовление основного раствора йода

0,50 г йода и 5,00 г йодистого калия растворяют в бюксе с притертой крышкой в небольшом количестве воды.

Содержимое перемешивают на магнитной мешалке при плотно закрытой крышке бюксы.

Раствор после полного растворения йода переносят в мерную колбу с притертой крышкой вместимостью 200 см3 и объем доводят дистиллированной водой до метки.

Основной раствор йода хранят в течение 1 мес в склянке из темного стекла с притертой пробкой.

2.3.4.    Приготовление рабочего раствора йода

2 см3 основного раствора йода разводят раствором соляной кислоты концентрацией 0,1 моль/дм3 при анализе препаратов грибного происхождения и концентрацией 0,5 моль/дм3 — препаратов бактериального происхождения с предполагаемой активностью больше 50 ед/см3 в мерной колбе вместимостью 100 см3.

Перед употреблением рабочего раствора проверяют его оптическую плотность в диапазоне длин волн 434—450 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Оптическая плотность рабочего раствора йода должна быть равна 0,220 (±0,01).

В случае отклонения ее от этого значения добавляют в раствор несколько капель соляной кислоты или основного раствора йода.

2.3.5.    Приготовление основного раствора очищенных ферментных препаратов

0,1000—1,0000 г исследуемого препарата (в зависимости от предполагаемой активности) растворяют в небольшом количестве воды, при необходимости тщательно растирая стеклянной палочкой, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Препараты с нерастворимыми наполнителями фильтруют. Раствор хранят в течение суток при температуре от 2 до 6°С.

2.3.6.    Приготовление рабочего раствора очищенных ферментных препаратов

Рабочий раствор готовят в соответствии с табл. 1 из основного раствора (для навески 0,1000 г), разбавляя его дистиллированной водой так, чтобы в 5 см3 рабочего раствора содержалась масса фермента, обеспечивающая в принятых условиях гидролиз крахмала от 20 до 60%.

Т аблаца 1

Амилолитическая активность (АС), ед/г, (предполагаем**)

Масса препарата в б см* рабочего раствора (т,), мг

Объем основного раствора, необходимый для вторичного раабавдемия. см*

Общий объем разбавленного раствор*, см*

От 20 до 80 включ.

5,0

50,0

50.0

> 80 > 150

»

2,0

20,0

50,0

» 150 » 300

»

1.0

10,0

50,0

» 300 > 700

»

0,5

5,0

50,0

> 700 >1200

»

0,25

10,0

200,0

» 1200 > 2500

>

0,125

5,0

200,0

>2500 > 5000

»

0.05

2,0

200.0

Св. 5000

0,025

1,0

200,0

Примечание. Для анализа берут две параллельные навески препарата ■ аз каждой делают одно разведение, которое анализируют не менее трех раз.

Рабочий раствор ферментного препарата готовят непосредственно перед определением.

2.3.7. Приготовление основного раствора из воздушно-сухой культуры гриба

5,00 г исследуемой воздушно-сухой культуры гриба, предварительно растертой в ступке, переносят в коническую колбу вместимостью 250 см3, обавляют 90 см3 дистиллированной веды ■

ГОСТ 29264.4-19 С. 5

10 см* ацетатного буферного раствора с pH 4,7. Смесь выдерживают в течение 1 ч в термостате при температуре (30,0±0,2)°С, периодически перемешивая и затем фильтруют. Фильтрат используют в качестве основного раствора.

Фильтрат хранят в течение суток при температуре от 2 до 6°С.

2.3.8. Приготовление рабочего раствора из воздушно-сухой культуры гриба

Рабочий раствор готовят из основного раствора, разбавляя его дистиллированной водой, в соответствии с табл. 2.

Таблица 2

Амклолятнческая активность (АС) культуры гриба, ед/г, (предполагаемая)

Масса культуры гриба в б см* рабочего раствора

(mi), мг

Объем основного раствора, необходимый для вторичного разбавления, см*

Общий объем разбавленного раствора, см*

От 5 до 15 включ.

37,5

15

100

» 15 » 50

»

10,0

4

100

» 50 » 100

»

2,5

1

100

» 100 » 150

»

1,25

1

200

» 150 » 300

»

0,625

0,5

200

2.3.9.    Приготовление основного раствора из культуральной жидкости бактериального происхождения

В мерную колбу вместимостью 100 см3 наливают 90 см8 дистиллированной воды и вносят 1 см3 испытуемой культуральной жидкости. Объем доводят до метки дистиллированной водой.

2.3.10.    Приготовление рабочего раствора из культуральной жидкости

Рабочий раствор готовят из основного раствора, разбавляя его дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 100 смв соответствии с табл. 3.

Таблица 3

Амилолитмческая активность (АС) культуральной жидкости, ед/см*.

Объем культуральной жидкости в б смрабочего раствора, см*

Объем основного раствора, необходимый для вторичного разбавления, см*

От

10 до 25 включ.

0,01

20,0

»

25 » 50

»

0,005

10,0

»

50 » 75

»

0,003-0,0035

6,0-7,0

»

75 » 100

э

0,0025

5,0

»

100 » 125

»

0,0020

4,0

»

125 » 150

»

0,0015

3.0

Св.

150

0,00125

2,5

Примечание. При анализе культур бактериального происхождения с предполагаемой активностью 50—150 ед/см® берут разведение фермента, обеспечивающее гидролиз крахмала от 0,02 до 0,04 г.

С. 6 ГОСТ 20264.4-69

2.4.    Проведение анализа

Берут две пробирки, наливают в каждую по 10 см3 раствора крахмала (субстрата) и ставят в термостат или водяную баню е температурой (30±0,2)°С на 5—10 мин. Затем, не вынимая пробирок из термостата, наливают в первую 5 см3 дистиллированной воды (контрольная пробирка), во вторую — 5 см3 рабочего раствора анализируемого продукта (опытная). Смеси быстро перемешивают и выдерживают в термостате в течение 10 мин, используя секундомер.

Затем из каждой пробирки поочередно отбирают по 0,5 см3 раствора и переносят в колбы с предварительно налитыми 50 смрабочего раствора йода. Содержимое колб перемешивают.

Полученные растворы приобретают следующую окраску:

Контрольный раствор — синий цвет, опытный — фиолетовый различной интенсивности в зависимости от количества непрогид-ролизованного крахмала.

Через 5—10 мин после смешивания определяют оптическую плотность растворов фотоэлектрическим колориметром в диапазоне длин волн 630—670 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Контрольным раствором при колориметрировании является дистиллированная вода.

2.5.    Обработка результатов

Массу прогидролизованного крахмала (т) в граммах вычисляют по формуле

тг"-0’1-    о>

где Di — оптическая плотность контрольного раствора;

Z?2 — оптическая плотность опытного раствора;

0,1 — масса крахмала, взятая для анализа, г.

Если масса прогидролизованного крахмала меньше 0,02 г или больше 0,06 г, то анализ повторяют, подбирая другое разведение.

Амилолитическую активность (АС) в ед/г для препаратов бактериального происхождения и в ед/см3 для культуральной жидкости вычисляют по-формуле

АС= -§:8j?n?+0-001671 .1000.    (2)

т,

Амилолитическую активность (АС\) в ед/г для препаратов грибного происхождения вычисляют по формуле

АС JL'2J»1"1-0,.03766_ 1000    (3)

т,    ’    '

где /п1 — масса ферментного препарата, содержащаяся в 5 см3 рабочего раствора, мг;

ГОСТ 20264.4-19 С. 7

5,885; 0,001671; 7,264; 0,03766 — коэффициенты расчетного уравнения, полученные при математической обработке экспериментальных данных зависимости массы прогид-ролизованного крахмала от массы фермента, взятого для анализа в пересчете на 1 ч действия фермента.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов определения активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок препарата, относительное допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 5%. Результат округляют до первого десятичного знака.

Предел возможных значений относительной погрешности измерений при доверительной вероятности Р=0,95 составляет 5%.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОАМИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ

3.1.    Метод основан на определении глюкозы, образующейся при гидролизе растворимого крахмала ферментом глюкоамилазы.

Глюкоамилазная активность (ГлС) характеризует способность ферментного препарата катализировать расщепление растворимого крахмала до глюкозы и выражается числом единиц активности в грамме препарата.

За единицу глюкоамилазной активности принята способность фермента катализировать гидролиз растворимого крахмала при определенных условиях температуры и pH, высвобождая за 1 мин 1 мкмоль глюкозы.

3.2.    Аппаратура, матер и а лы, реактивы

Аппаратура и материалы — по п. 2.2 со следующими дополнениями.

Колориметр фотоэлектрический лабораторный (фотоэлектроколориметр) по ГОСТ 12083, обеспечивающий измерения в интервале длин волн 390—415 нм с погрешностью ±1% абс. (по коэффициенту пропускания) или 0,01 Д (по оптической плотности) или спектрофотометр.

Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, раствор молярной концентрацией 1 моль/дм3.

Калий железистосинеродистый по ГОСТ 4207.

Глюкоза по ГОСТ 6038.

Натрий уксуснокислый по ГОСТ 199.

Кислота уксусная по ГОСТ 61.

Крахмал растворимый по ГОСТ 10163.

Кислота бензойная по ГОСТ 10521.

Калий гидроокись по ГОСТ 24363, раствор молярной концентрацией 1 моль/дм3.

Кальций хлористый.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962 или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300.

С 8 ГОСТ 20244.4—М

Глюкозооксидаза с ферментативной активностью 100000 ед/г.

Пероксидаза.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечание. Все реактивы должны быть квалификации ч.; х. ч. или ч. д. а.

3.3. Подготовка к анализу

3.3.1.    Приготовление раствора крахмала с массовой долей 1% (субстрата) — по п. 2.3.1.

3.3.2.    Приготовление фосфатного буферного раствора с pH 7,5 концентрацией 1 моль дм3

Смешивают равные объемы растворов фосфорнокислого одно-замещенного калия и гидроокиси калия концентрацией 1 моль/дм3.

Величину pH проверяют на приборе. В случае отклонения pH от требуемого составляющими растворами доводят его до нормы.

3.3.3.    Приготовление раствора железистосинеродистого калия с массовой долей /% (раствора А)

0,05 г железистосинеродистого калия количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 и объем доводят дистиллированной водой до метки.

Раствор готовят непосредственно перед определением.

3.3.4.    Приготовление раствора глюкозооксидазы (раствора Б)

5.00    (6,00) мг глюкозооксидазы растворяют фосфатным буферным раствором с pH 7,5 в мерной колбе вместимостью 50 см3 и затем добавляют 2,0 мг пероксидазы. Объем доводят до метки фосфатным буферным раствором.

Если активность глюкозооксидазы отличается от требуемой (100000 ед/г), то навеску берут с таким расчетом, чтобы в 50 смраствора содержалось 500—600 ед активности.

3.3.5.    Приготовление рабочего раствора С

Рабочий раствор С готовят смешиванием равных объемов растворов А и Б.

Полученный раствор хранят в темной склянке в холодильнике в течение 2—3 сут.

3.3.6.    Приготовление насыщенной бензойной кислоты

2,70 г бензойной кислоты количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3 и доводят до метки дистиллированной водой.

3.3.7.    Приготовление стандартных растворов глюкозы

Для приготовления стандартных растворов глюкозы пользуются перекристаллизованной из спирта безводной глюкозой, которую хранят в эксикаторе над хлористым кальцием.

100.00    мг глюкозы растворяют в 100 см3 насыщенного раствора бензойной кислоты. Из этого раствора отбирают поочередно 5, 10 и 15 см3 в мерной колбе вместимостью 100 см3 и доводят объем до метки бензойной кислотой. Полученные растворы соответствуют содержанию 50, 100 и 150 мкг глюкозы в 1 см3.

ГОСТ 2UU.4—М С. 9

Этими растворами пользуются для построения градуировочного графика.

3.3.8.    Приготовление основного и рабочего растворов очищенных ферментных препаратов

Основной раствор очищенных ферментных препаратов готовят по п. 2.3.5.

Рабочий раствор готовят из основного раствора, разбавляя его дистиллированной водой в зависимости от предполагаемой активности препарата.

3.3.9.    Приготовление основного и рабочего растворов из воздушно-сухой культуры гриба

1)00—5,00 г исследуемой воздушно-сухой культуры гриба (в-зависимости от активности) предварительно растертой в ступке,, переносят в коническую колбу вместимостью 250 см3, добавляют 100 см3 дистиллированной воды, смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, периодически перемешивая, а затем фильтруют.

Основной раствор хранят в течение суток при температуре от 2 до 6°С.

Рабочий раствор готовят из основного, разбавляя его дистиллированной водой в зависимости от предполагаемой активности.

3.3.10.    Приготовление рабочего раствора из культуральной-жидкости

Отфильтрованную культуральную жидкость разбавляют дистиллированной водой в 1000 и более раз в зависимости от предполагаемой активности.

3.3.11.    Построение градуировочного графика

В пробирки приливают по 1 см3 стандартных растворов глюкозы, добавляют по 3 см3 рабочего раствора С. В контрольную пробу (контроль на реактив С) вместо раствора глюкозы приливают 1 см3 дистиллированной воды. Оставляют пробирки на 45 ми» при комнатной температуре для развития окраски. Затем измеряют интенсивность окраски раствора глюкозы в диапазоне дли» волн 390—415 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм против контрольной пробы на реактив С.

По полученным значениям строится градуировочный график, имеющий линейную зависимость.

Рабочая зона градуировочного графика лежит в области 50— 150 мкг.

Оптическая плотность раствора должна быть близка к значениям 0,1 ±0,01; 0,2±0,01; 0,3±0,01.

Если оптическая плотность отличается от этих значений, то навеску глюкозооюсидазы увеличивают,

3.4. Проведение анализа