Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение остаточного содержания трифлоксистробина и его метаболита в корнеплодах и ботве сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.13062—13

Издание официальное

Москва • 2013

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение остаточного содержания трифлоксистробина и его метаболита в корнеплодах и ботве сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3062—13

8.1.    Очистка органических растворителей и

приготовление растворов

8.1.1. Очистка ацетонитрила Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 ч, после чего перегоняют. Перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом натрия. Используют свежеприготовленным.

8.1.2. Очистка н-гексана Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом. Срок хранения - 1 неделя.

8.1.3. Очистка этилацетата и хлористого метилена Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5 %. Навеску (5 ±0,1) г натрия углекислого растворяют в конической колбе в 40—60 см³ бидистиллированной воды. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем раствора до метки бидистиллированной водой.

Срок хранения раствора - 1 неделя.

Каждый растворитель промываю! последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5 %, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют. Срок хранения - 1 неделя.

8.1.4. Очистка ацетона Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 дм³ ацетона 10 г КМп0₄ и К₂С0₃). Срок хранения - 1 неделя.

8.2.    Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 750 см³ ацетонитрила, 250 см³ бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр. Эту подвижную фазу используют при анализе трифлоксистробина.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 404 см³ бидистиллированной воды и 1 см³ ортофосфорной кислоты, перемешивают. Затем к раствору приливают 595 см³ ацетонитрила, перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр. Эту подвижную фазу используют при анализе метаболита ЦТА 321113.

8.3. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку соответствующей подвижной фазой, приготовленной по п. 8.2, при скорости подачи растворителя 0,5 см³/мин не менее 2 ч до установления стабильной базовой линии (дрейф базовой линии в течение 1 ч не более 5 %, а уровень шумов не более 2 % диапазона выходного сигнала на шкале измерений).

8.4. Приготовление градуировочных растворов

8.4.1. Исходный градуировочный раствор трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) с массовой концентрацией 100 мкг/см³

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,010 ± 0,0001) г трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113), растворяют в 40—50 см³ ацетонитрила, доводят объем раствора ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) хранят при температуре не выше -18 °С в течение одного месяца (трех месяцев).

8.4.2. Градуировочный раствор трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (раствор № I)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного градуировочного раствора трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) с массовой концентрацией 100 мкг/см³ (п. 8.4.1), разбавляют ацетонитрилом и доводят объем раствора до метки. Эти растворы используют для приготовления градуировочных растворов №2—5, а также для приготовления проб ботвы и корнеплодов с внесением при оценке полноты извлечения трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) из исследуемых образцов.

Градуировочные растворы № 1 трифлоксистробина и метаболита ЦГА 321113 хранят в при температуре не выше -18 °С в течение недели и месяца, соответственно.

8.4.3 Градуировочные растворы трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) с массовой концентрацией 0,05—0.5 мкг/см³ (растворы Ns 2—5)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 см³ градуировочного раствора трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (п. 8.4.2), доводят объем раствора до метки соответствующей подвижной фазой, приготовлешюй по п. 8.2, тщательно перемешивают, получают растворы № 2—5 с мас-

совой концентрацией трифлоксистробина (метаболита ЦГЛ 321113) 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 миг/см^-*, соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

8.5. Градуировка хроматографа

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ) от массовой концентрации трифлоксистробина (метаболита ЦГЛ 321113) в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют при условиях п. 7.2. Каждый раствор хроматографируют дважды. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости г.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

8.6. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазонов измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие (I)

„-Sj

———• 100 < К₉, где    (1)

Sum S,_r - значение площади пика трифлоксистробина (метаболита ЦТ А 321113) в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно, мВ;

Кгр - норматив контроля, К,р - 0,5 • 6‘ где

± S- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотрешшх методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

8.7 Подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего патрона для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8—10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля 1 степени активности в 20 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку, предназначенную для анализа трифлоксистро-бина, промывают 30 см³ этилацетата со скоростью 1—2 капли в секунду, затем 30 см³ смеси гексан-этилацстат (9 : 1, по объему), а колонку, используемую при анализе метаболита, последовательно промывают 25 см³ смеси этилацетат-метанол (1 : 1, по объему) и 30 см³ смеси этил-ацетат метанол (9 :1, по объему).

Концентрирующий патрон с привитыми окт ильными группами промывают последовательно с помощью медицинского шприца 5 см³ ацетонитрила и 4 см³ смеси ацетонитрил вода (3 : 7, по объему) со скоростью 5 см³/мин, не допуская высыхания поверхности патрона.

8.8. Определение объема элюенпиг, необходимого для полного вымывания трифлоксистробина и метаболита ЦГА 321113 из колонки с силикагелем

При отработке методики или поступлении новой партии силикагеля и растворителей проводят определение объёма элюеита, необходимого для полного вымывания трифлоксистробина и метаболита ЦГА 321113 из колонки с силикагелем.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,1 см³ градуировочного раствора трифлоксистробина с массовой концентрацией 10 мкг/см³ в ацетонитриле (п. 8.4.2) и отдувают растворитель током азота. Остаток растворяют в 0,3 см³ этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, добавляют 2,7 см³ гексана, перемешивают и вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 8.7 для анализа трифлоксистробина. Промывают колонку 50 см³ смеси гексан-этилацетат (9 : 1, по объему) со скоростью 1—2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 50 см³ смеси гексан-этилапетат (8 : 2, по объему), отбирая последовательно по 5 см³ элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С. Сухие остатки растворяют в 1 см³ ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, вносят 1 см³ подвижной фазы, подготовлен-

ной по п. 8.2. для анализа трифлоксистробина, перемешивают, а затем хроматографируют в соответствии с п. 7.2.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,1 см³ градуировочного раствора метаболита ЦГА 321113 с массовой концентрацией 10 мкг/см³ в ацетонитриле (и. 8.4.2) и отдувают растворитель током азота. Остаток растворяют в 2,7 см³ этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, добавляют 0,3 см³ метанола, перемешивают и вновь помещают в ультразвуковую ванну' на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 8.7 для анализа метаболита. Промывают колонку 30 см³ смеси этилацетат- метанол (9:1, по объему) со скоростью 1—2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 50 см³ смеси этилацетат-метанол (7 : 3, по объему), отбирая последовательно но 5 см³ элюата. Каждую фракцию упаривают досуха, остатки растворяют в 1 см³ ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на I мин, вносят 1 см³ подвижной фазы, подготовленной по п. 8.2 для анализа метаболита, перемешивают, а затем хроматографируют в соответствии с п. 7.2.

По результатам обнаружения трифлоксистробина и метаболита ЦГА 321113 в каждой из фракций определяют объем элюснтов, необходимый для полного вымывания трифлоксистробина и метаболита ЦГА 321113 из колонки.

9. Отбор и хранение проб

Отбор проб производят в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (ог 21.08.79 №2051—79) и правилами, определенными ГОСТ 17421—82 «Свекла сахарная для промышленнй переработки. Требования при заготовках» и ГОСТ Р 52647-2006 «Свела сахарная. ТУ».

Пробы ботвы и корнеплодов сахарной свеклы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 1 дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С. Перед проведением анализа ботву и корнеплоды измельчают.

10. Выполнение определения

10.1. Экстракция трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113)

Приготовление водного раствора ацетона с объемной долей 80 %

В мерную колбу вместимостью 500 см³ вносят 100 см³ бидистилли-рованной воды и доводят объем раствора до метки ацетоном.

Срок хранения - 1 неделя.

Навеску измельченной ботвы или корнеплодов сахарной свеклы массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см³, приливают 100 см³ водного раствора ацетона с объемной долей 80 % и гомогенизируют 3 мин при 10 000 об./мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 см³. Осадок переносят в коническую колбу вместимостью 250 см³, приливают 70 см³ водного раствора ацетона с объемной долей 80 %, перемешивают и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 5 мин. Суспензию фильтруют и остаток на фильтре промывают 50 см³ водного раствора ацетона с объемной долей 80 %. Экстракты и промывную жидкость переносят в химический стакан вместимостью 500 см³, перемешивают, измеряют объем раствора, /а его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и упаривают на роторном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С до водного остатка (7—10 cm^j). К водному остатку добавляют 20 см³ деионизоватюй воды и раствор переносят в химический стакан вместимостью 100 см³. Далее проводят очистку экстракта по п. 10.2.

10.2. Очистка экстрактов перераспределением в системе нссмешивающихся растворителей

Приготовление раствора гидроксида натрия с молярной концентрацией 1 моль/дм³.

Растворяют (4 ± 0,1) г гидроксида натрия в 50—70 см³ бидистилли-рованной воды, затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем раствора до метки бидистиллированной водой.

Срок хранения раствора - 1 неделя.

Приготовление раствора ортофосфорной кислоты с молярной концентрацией 5 моль/дм³

Растворяют (16,4 ± 0,1) г орго-фосфорной кислоты в 50—70 см^-" бидистиллированной воды, затем переносят раствор в мерную колбу вместимостью 100 м³ и доводят объем раствора до метки бидистиллированной водой.

Срок хранения раствора - 1 неделя.

Водную фракцию, полученную по п. 10.1 и помещенную в химический стакан, подщелачивают раствором гидроксида натрия с молярной концентрацией 1 моль/дм³ до pH 6, контролируя кислотность раствора с помощью иономера. Раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 см³, приливают 30 см³ гексана, и смесь интенсивно встряхи-

вают в течение 1 мин. После разделения фаз органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Экстракцию водной фазы повторяют еще два раза, используя 30 и 20 см³ гексана. Объединетптую гексановую фракцию, содержащую трифлоксистробин, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С.

Оставшуюся после экстракции гексаном водную фазу переносят в химический стакан и подкисляют раствором ортофосфорной кислоты с молярной концентрацией 5 моль/дм³ до pH 2, контролируя кислотность раствора с помощью иономера. Раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 см³, приливают 30 см³ дихлорметана и смесь интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После разделения фаз органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см'. Экстракцию водной фазы повторяют еще два раза, используя 30 и 20 см' дихлорметана. Объединенную дихлорметановую фракцию, содержащую метаболит ЦГА 321113, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С. Дальнейшую очистку экстрактов проводят по п. 10.3.

10.3. Очистка экстрактов на колонке с силикагелем

При анализе трифлоксистробина сухой остаток гексанового экстракта ботвы или корнеплодов, полученный по п. 10.2, растворяют в 0,3 см³ этил ацетата, помещая в ультразвуковую ванну' на 1 мин, добавляют 2,7 см³ гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванпу па 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 8.7 для анализа трифлоксистробина. Колбу обмывают 5 см³ смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 35 см³ смеси гексан-эгилацстат (9: 1, по объему) со скоростью 1—2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Трифлоксистробин элюируют с колонки 40 см³ смеси гексан-этилацетат (8 : 2, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодош1ую колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С.

Сухой остаток экстракта корнеплодов растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрил-вода (75 : 25, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и анализируют на содержание трифлоксистробина по п. 11. Экстракт ботвы дополнительно очищают с помощью концентрирующего патрона.

При анализе метаболита ЦТ А 321113 сухой остаток дихлорметано-вого экстракта ботвы или корнеплодов, полученный по п. 10.2, растворяют в 2,7 см³ этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, добавляют 0,3 см³ метанола, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 8.7 для анализа метаболита ЦГА 321113. Колбу обмывают 5 см³ смеси этилацетат-метанол (9:1, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 30 см³ смеси этилацетат-метанол (9 : 1, по объему) со скоростью 1—2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Метаболит ЦГА 321113 элюируют с колонки 40 см³ смеси этилацетат-метанол (7 : 3, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре нс выше 35 °С. Сухой остаток экстракта корнеплодов растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрил вода-ортофосфорная кислота (59,5:40,4:0,1, но объему), помещая в ультразвуковую ватту па 1 мин, и анализируют на содержание метаболита ЦГА 321113 по п. 11. Экстракт ботвы дополнительно очищают с помощью концентрирующего патрона.

10.4. Очистка экстракта на концентрирующем патроне

Сухой остаток экстракта ботвы, полученный по п. 10.3, растворяют с помощью ультразвуковой ванны в 2 cm^j смеси ацетонитрил-вода (3 : 7, по объему) и переносят в подготовленный по п. 8.7 концентрирующий патрон. Патрон промывают 2 см³ смеси ацетонитрил-вода (4 : 6, но объему), элюат отбрасывают. Трифлоксистробин и метаболит ЦГА 321113 элюируют 2 см³ смеси ацетонитрил-вода (9:1) в круглодонную колбу вместимостью 10 cm^j. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 35 °С. Остаток в колбе растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрил-вода (75 :25) при анализе на содержание трифлок-сисгробина или в 2 см³ смеси ацетонитрил вода ортофосфорная кислота (59,5 :40,4 : 0,1) при анализе на содержание метаболита ЦГА 321113 и хроматографируют в соответствии с п. 7.2.

Полнота извлечения компонентов при проведении всех операций подготовки пробы не менее 84 %.

11 Выполнение измерений

11.1. В инжектор хроматографа вводят 20 мм³ очищенного экстракта анализируемой пробы (пп. 10.1—10.4), анализируют при условиях п. 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

11.2. Для каждого образца корнеплодов повторяют операции по пп. 10.1—10.3,11.1, ботвы- по пп. 10.1—10.4,11.1.

12. Обработка результатов измерений

12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации «МультиХром для Windows», версия 1.5х.

Альтернативная обработка результатов.

Массовую долю трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) -V, мг/кг, в ботве и корнеплодах сахарной свеклы рассчитывают по формуле (2):

5, • А • V 0,84S₀m ⁹

Si - площадь пика трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) в образце, мВ;

S₀ - площадь ника трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) в градуировочном растворе, мВ;

А - массовая концентрация градуировочного раствора трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113), мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования,

см³;

т — масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне и последующего хроматографического определения, г;

0,84 - коэффициент извлечения трифлоксистробина (метаболита ЦГА 312113), учитывающий все процедуры подготовки пробы.

При расчете содержания метаболита ЦГА 321113 в эквивалентах трифлоксистробина полу ченное значение А^г умножают на 1,04.

12.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости (3):

А'/, Х₂ - результаты параллельных определений массовой доли трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113), мг/кг; г - значение предела повторяемости, % (табл.).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

12.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

X ± 0,01 • S- X, при Р = 0,95, где

X - среднее арифметическое значение результатов п определений, признанных приемлемыми, мг/кг,

± S - границы относительной погрешности измерений, % (табл.).

При необходимости результаты определения трифлоксистробина и метаболита ЦТ Л 321113 суммируют и сравнивают с утвержденными гигиеническими нормативами.

В случае если полученный результат измерений ниже нижней границы диапазона измерений, то результат анализа представляют в виде:

«массовая доля трифлоксистробина в корнеплодах, ботве сахарной свеклы менее 0,02 мг/кг»;

«массовая доля метаболита ЦТ4 321113 в корнеплодах, ботве сахарной свеклы менее 0,02 мг/кг».

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал трифлоксистробина (метаболита ЦГЛ 321113), превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочных растворов с массовой концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют соответствующей подвижной фазой и анализируют в соответствии с данной методикой.

13. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

13.1.    Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а)    при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б)    при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

13.2.    Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

ББК51.23

И37

И37 Измерение остаточного содержания трифлоксистробина и его метаболита в корнеплодах и ботве сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013.—20 с.

ISBN 978—5—7508—1189—2

1.    Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийский НИИ фитопатологии (Т. 11. Тал ал аки на, А. М. Макеев).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическом}' нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. № 1).

3.    У тверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 14 июля 2013 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.23

Редактор Н. Е. Акопова Верстка Е. В. Ломанова Технический редактор А. А. Григорьев

Подписано в печать 30.08.13 Формат 60x88/16    Печ. л. 1,25

Т ираж 200 эю.    Заказ 33

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994. Москва, Вадковский пер., д, 18, стр. 5, 7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом vcjvarrciibCKovo обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, телефакс (495)952-50-89

© Роспотребнадзор, 2013 © Федеральный центр гнгнены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013

13.3. Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разпые операторы, разные лаборатории), нс должно превышать предела воспроизводимости (R)

2|Х, — Х,|-100

(*,⁺ *,)

Х}> Х₂ - результаты измерений массовой доли трифлоксистробина (метаболита ЦГА 311213), выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости, % (при этом R = 2,77 • o_R).

Если предел воспроизводимости не превышен, то приемлемы все результаты измерений и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если предел воспроизводимости превышен, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6—2002 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.4).

14. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-02, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости но п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

14 июля 2013 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение остаточного содержания трифлоксистробина и его метаболита в корнеплодах и ботве сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостпой хроматографии

Методические указания МУК 4.13062—13

Свидетельство о метрологической аттестации от 14.12.2012 №01.00225/205-77-12.

1. Назначение и область применения

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций трифлоксистробина и его метаболита в ботве и корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне 0,02—0,20 мг/кг.

Методические указания посят рекомендательный характер.

Т рпфл оксистроби н

Метил (Е)-метоксиимино-{(Е)-а-[1-(а,а,а-трифтор-т-толил)этили-дснаминоокси]-о-толил } ацетат

Эмпирическая формула: C20H19F3N2O4. Молекулярная масса: 408,4.

Белый порошок без запаха. Температура плавления: 72,9 °С. Давление паров при 25 °С: 3,4 х 10"* Па. Коэффициент распределения н-октанол-вода:    logР = 4,5 (25 °С). Растворимость (г/дм³) при 25 °С:

ацетон, толуол, дихлорметан, этилацетат - все 500, метанол - 76, гексан -11, вода - 0,0006.

Вещество стабильно в воздухе и на свету, быстро гидролизуется в водном растворе при pH 9 (DT*) =1,1 дня).

В биологически активных почвах в анаэробных условиях трифлок-систробин быстро разрушается: DT50 = 0,3—1 дспь, Ш*» - 4—8 дней.

Трифлоксистробин при попадании в воду, почву и растительные объекты быстро гидролизуется с образованием довольно устойчивого метаболита - (Е,Е)-метоксиимино-{2-[1-(3~трифторметилфенил)-этил-иденамино-оксиметил]фенил}-уксусной кислоты (ЦТА 321113).

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD50) для крыс и мышей - более 5 000 мг/кп острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC50) для крыс - более 4 646 мг/м³ воздуха. Трифлоксистробин нс оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика. Фунгицид токсичен для дафний, рыб и водорослей в лабораторном эксперименте.

Основной метаболит трнфлоксистробина: ЦГА 321113.

(Е)-метоксиимино- {(Е)-а-[ 1-(а,сца-трифтор-т-тол1и1)этюгиденами-ноокси]-о-толил} ацетат.

Эмпирическая формула:

Молекулярная масса: 394,4.

Белый порошок без запаха. Другие физико-химические и токсикологические характеристики основного метаболита трнфлоксистробина отсутствуют.

В биологически активных почвах в аэробных условиях метаболит ЦГА 321113 весьма стабилен: DT₅₀ =110 дней, DT90 = 279 дней.

Область применения

Трифлоксистробин - синтетический фунгицид из класса стробилу-ринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenaccllus. Вещество эффективно против широкого круга грибных патогенов хлебных злаков.

овощных, кормовых, технических и плодовых культур. Обладает защитным, лечебным и профилактическим действием.

Применяется в России в яблоневых и грушевых садах в качестве средства борьбы с возбудителями мучнистой росы, парши, альтернариоза, пятнистостей и болезней при хранении с нормой расхода до 70 г д.в./га и двукратной обработкой за сезон с 10—14-дневным интервалом.

2. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл.

Таблица

Вещество/ анализируемый объект Диапазон измерений массовой доли, (мг/кг) Показатель точности (границы относительной погрешности) * 6, % при Р = 0,95 Показатель повторяемости (относительное сред-нсквалратиче-ское отклонение повторяемости), *о% Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), <тл % Предел повто ряемос ти, /*,%, Р - 0,95, п = 2 Трифлокси-сгробин в ботве сахарной свеклы От 0,020 до 0,10 вкл. 26 6 9 17 Св. 0,10 до 0.20 вкл. 20 4 6 11 Трифлокси-стробин в корнеплодах сахарной свеклы От 0,020 до 0,10 вкл. 24 6 9 17 Св. 0,10 до 0,20 вкл. 15 3 4,5 8 Метаболит ЦТА 321113 в ботве сахарной свеклы Ог 0,020 до 0,10 вкл. 24 6 9 17 Св. 0,10 до 0,20 вкл. 13 3 4,5 8 Метаболит ЦТА 321113 в корнеплодах сахарной свеклы От 0,020 до 0,10 вкл. 28 6 9 17 Св. 0,10 до 0,20 вкл. 17 3,5 5 10

3. Метод измерений

Метод основан на экстракции трифлоксистробииа и его метаболита из ботвы и корнеплодов сахарной свеклы водным раствором ацетона» последовательной очистке экстрактов от коэкстрактивных компонентов перераспределением в системе нссмешивающихся растворителей, на колонке с силикагелем и твердофазной экстракцией, разделении компонентов очищенных экстрактов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с последующим измерением содержания трифлоксистробииа и его метаболита с использованием ультрафиолетового дсгскгора и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.

4. Требования к средствам измерений, вспомогательным устройствам, реактивам и материалам

4.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны Весы лабораторные аналитические с пределом взвешивания до 110 г и допустимой погрешностью 0,0001 г

Весы лабораторные с пределом взвешивания до 160 г и допустимой погрешностью 0,005 г Колбы мерные вместимостью 2-100-2,2-1000-2 Пипетки градуированные 1-1-2-1; 1-1-2-2;

1-2-2-5; 1-2-2-10

Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой Г1-2-5-0.1; П-2-10-0,2 Цилиндры мерные 1-25; 1-50; 1-100; 1-500; 1-1000

Мономер универсальный

Шприц для ввода образцов для жидкостного

хроматографа вместимостью 50—100 мм³

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.2. Реактивы

Трифлоксистробнн, аналитический стандарт с содержанием основного вещества 99,7 %

Метаболит ЦГА 321113, аналитический стандарт с содержанием основного вещества 99,0 %

Ацетон, чистый для анализа Ацетонитрил для хроматографии, хч Вода для лабораторного анализа (деионизованная, бидистиллированная) н-Гексан, хч Калий углекислый, хч Калия перманганат, хч Кальция хлорид, хч

Кислота серная концентрированная, хч Кислота ортофосфорная, хч, 85,6 % Метиловый спирт (метанол), хч Метилен хлористый (дихлорметан), хч Натрия сульфат безводный, хч Натрия гидроксид, хч Натрий углекислый, хч Фосфор (V) оксид (пентоксид фосфора) Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), хч

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

4.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аналитическая колонка (150 х 4,6 мм), заполненная сорбентом с привитыми многофункциональными полярными группами С18 зернением 5 мкм

Ванна ультразвуковая с рабочей частотой 35 кГц Гомогенизатор с металлическим стаканом вместимостью не менее 500 см* и скоростью вращения ножа не менее 10 000 обУмин Воронка Бюхнера

Воронки делительные вместимостью 100 и 250 см³ Воронки лабораторные стеклянные Колба Бунзена

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10 и 100 см³

Колбы плоскодонные вместимостью 250 см³

Колонка хроматографическая стеклянная, длиной 25 см и внутренним диаметром 8—10 мм Патроны концентрирующие для твердофазной экстракции, 0,6 г гидрофобного сорбента с привитыми октальными группами (патрон № 1) Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар Силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц 0,063—0,200 мм и размером пор 60А

Стаканы химические вместимостью 100 и 500 см³ Стекловата

Установка для перегонкп растворителей с дефлегматором

Фильтры бумажные средней плотности Фильтры мембранные, диаметром 47 мм с размером пор 0,45 мкм Шприц медицинский инъекционный однократного применения вместимостью 10 см³

Примечание. Допускается использование других вспомогательных средств измерений и устройств аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают вышеуказанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений.

5. Требования безопасности, охраны окружающей среды

5.1.    При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами поГОСТ 12.1.007-76,12.1.005—£8.

5.2.    При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требова!шя противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91, В лаборатории должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Обучение работников правилам безопасности труда проводят согласно ГОСТ 12.0.004 —90.

5.3.    При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила элсктробезонасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019—79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4.    Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточновытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГП 2.2.5.1313—03 И2.2.5.2308—07.

6. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, прошедший обучение, имеющий опыт работы в лаборатории и владеющий техникой проведения хроматографического анализа, освоивший данную методику и подтвердивший соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7. Требования к условиям измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

7.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу

-    температура воздуха    (20 ± 5) °С;

- атмосферное давление    (84—106) кПа;

-    относительная влажность воздуха нс более 80 %.

7.2 Условия хроматографического анализа Температура колонки: комнатная.

Скорость потока элюента: 0,7 см³/мин.

Рабочая длина волны: 251 нм.

Чувствительность детектора: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Подвижная фаза для трифлоксистробина:    ацетонитрил-вода

(75 : 25, по объему).

Подвижная фаза для метаболита ЦТ А 321113: ацетонитрил-вода-ортофосфорная кислота (59,5 :40,4 : 0,1, по объему).

Линейный диапазон детектирования: (1—10) нг.

8. Подготовка к выполнению измерении

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, раствора внесения, подвижпой фазы для ВЭЯОС, кондиционирование хроматографической колопки, градуировка хроматографа, приготовление растворов, концентрирующих патронов, подготовка колонки с силикагелем, проверка поведения трифлоксистробина и его метаболита на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне.