Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

16 страниц

304.00 ₽

Купить ГОСТ Р 52174-2003 — официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на продовольственное сырье (в том числе посевной и посадочный материал), пищевые продукты, цветы и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения с использованием биологического микрочипа.

Метод основан на асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции (амПЦР) с последующей гибридизацией продуктов этой амПЦР на биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает наличие или отсутствие в анализируемой пробе не менее пяти различных трансгенных последовательностей ДНК

  Скачать PDF

Издание (июнь 2005 г.) с Поправкой (ИУС 9-2005)

Рекомендуется использовать ГОСТ 34150-2017

Оглавление

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

3 Определения

4 Аппаратура, материалы и реактивы

5 Отбор проб

6 Подготовка к проведению анализа

6.1 Приготовление растворов

6.2 Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК)

6.3 Подготовка асимметричной мультиплексной ПЦР

7 Проведение анализа

7.1 Проведение ассиметричной мультиплексной ПЦР

7.2 Гибридизация на биологическом микрочипе

8 Обработка результатов анализа

9 Требования безопасности

Приложение А (справочное) Определение термина

Приложение Б (справочное) Схема метода идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения

Приложение В (обязательное) Пример гибридизационной картины на биологическом микрочипе флуоресцентных продуктов амПЦР

Приложение Г (рекомендуемое) Пример оформления протокола испытания

Приложение Д (справочное) Библиография

Показать даты введения Admin

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Биологическая безопасность

СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа

Ихтание официальное

ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Институтом физиологии растений им. К.АЛГимирязева РАН и Институтом молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

ВНЕСЕН Техническим комитетом но стандартизации ТК 447 «Биологическая безопасность нишевых продуктов, кормов и товаров народного потребления и методы ее контроля*

2    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 декабря 2003 г. N? 403-ст

3    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4    ИЗДАНИЕ (нюнь 2005 г.) с Поправкой (ИУС 9—2005)

© ИПК И здатсльство стандартов. 2004 © Стандартинформ. 2005

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта России

II

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Биологическая безопасность

СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метол идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительною происхождения с применением биологического микрочипа

Biological safety. Raw and food-stufls. Method for the identification of genetically modified organisms (GMO)

of plant origin by using biological microchip

Дата введения 2004—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевое сырье (в том числе посевной и посадочный материал), пищевые продукты, цветы (далее — продукт) и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с использованием биологического микрочипа.

Метод основан на асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции (далее — амПЦР) с последующей гибридизацией продуктов этой амПЦР на биологическом микрочине. Метод одновременно устанавливает наличие или отсутствие в анализируемой пробе не менее пяти различных трансгенных последовательностей ДНК. Чувствительность метода — не менее 10“12 г (1 пг) ДНК.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте исtюльзованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труд;!. Общие санитарно-гигиенические требования к 1юздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификации и общие грсбовании безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требовании

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3164-78 Масло вазелиновое медицинское. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9805-84 Спирт изопропиловый. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

Издание официальное

ГОСТ 12738-77 Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия

ГОСТ 13646-68 Термометры стеклянные ртутные для точных измерений. Технические условия

ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 24104— 2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Тины, основные параметры и размеры

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуирован-ные. Часть I. Общие требования

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

3    Определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1    биологическая безопасность: В соответствии с приложением А.

3.2    генетически модифицированные источники: Сырье и пищевые продукты (компоненты), используемые человеком в натуральном или переработанном виде, полученные из генетически модифицированных организмов или содержащие их в своем составе.

3.3    генетически модифицированный организм: Организм, генетический материал которого изменен с применением методов генной инженерии.

3.4    генная инженерия: Совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных нуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.

3.5    биологический микрочии: Микроматрица с ячейками, в которых иммобилизован набор олигонуклеотидов.

3.6    праймер: Последовательность однотяжевой ДНК длиной до 25 нуклеотидов, применяемая для проведения асимметричной мультиплексной полимеразной ценной реакции.

3.7    асимметричная мультиплексная полимеразная ценная реакция: Полимеразная ценная реакция, где в одной пробирке с участием нескольких пар праймеров одновременно амплифицируются разные последовательности анализируемой ДНК. причем количество одного из праймеров каждой пары в несколько раз превышает количество другого праймера.

4    Аппаратура, материалы и реактивы

4.1    Компьютерная программа «Imageware* для анализа изображений, полученных с помощью «Чипдетектора-03* |1| или «Био-1* |23).

4.2    Комплекс аппаратно-программный для анализа флуоресценции биологических микрочинов типа «Чиидетектор-03» |2| или «Евробио-ВТО* |24|.

4.1. 4.2 (Поправка).

4.3    Амплификатор ДНК типа «Терцнк» под микроцентрпфужные пробирки вместимостью 0.2, 0.5 см3 со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1.5 *С/с |3|.

4.4    Термостат суховоздушный типа ТВЗ-25 с рабочей температурой 37 *С. рабочий диапазон от 20 'С до 60 ’С. точность поддержания температуры ±1 *С |4|.

4.5    Весы лабораторные общею назначения но ГОСТ 24104 высокою класса точности (условное обозначение П ) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0.0001 г.

4.6    Камер;» морозильная по ГОСТ 26678. обеспечивающая температуру минус 20 *С.

4.7    Холодильник бытовой электрический но ГОСТ 26678.

4.8    Микроцентрифуга настольная типа 5415С с частотой вращения не менее 13000 мин-1 |5|.

4.9    Мешалка магнитная с подогревом |6|.

4.10    Аппарат для встряхивания типа CV-I500c частотой вращения не менее 1500 мин-1 |7|.

4.11    pH-метр с набором электродов, с погрешностью измерений ±0.1 pH.

4.12    Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0.5—10.0 мм' (шаг — 0.1 мм3, точность ±2.5 % — 10.0 %. воспроизводимость 3 %—7 %); 5.0—50.0 мм3 (шаг — 0.5 мм3, точность ±2.0 %—5.0 %. воспроизводимость 2.5 %—5 %); 20.0—200.0 мм' (шаг — 1.0 мм3, точность ±1.5 %—

2

ГОСТ Р 52174-2003

2.0 %. воспроизводимость 2 %—3 %); 100—1000 мм' (шаг — 5 мм’, точность ±1.0 %—1.5 %. воспроизводимость 1 %—2 %).

4.13    Штативы под микроцентрифужные пробирки типа RP-30 и RP-80 на 30 и 80 шт. |8|.

4.14    Наконечники с фильтром дли микродозаторов (микронииеток) с переменным объемом дозирования жидкостей до 10; 20; 200; 1000 мм ' |9|.

4.15    Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0.5 и 1.5 см' стерильные.

4.16    Пестик или палочка стеклянные по ГОСТ 21400 для микроцснтрифужных пробирок вместимостью 1.5 см1.

4.17    Цилиндры стеклянные мерные лабораторные по ГОСТ 1770 на 25. 100. 250 и 1000 см'.

4.18    Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические по ГОСТ 25336 вместимостью 50-1000 см1.

4.19    Пипетки стеклянные градуированные по ГОСТ 29227.

4.20    Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

4.21    Натрия шдроокись по ГОСТ 4328.

4.22    Кислота соляная концентрированная по ГОСТ 3118. х.ч.

4.23    Натрий хлористый но ГОСТ 4233, х.ч.

4.24    Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль дигидрат (ЭДТА) |10|.

4.25    Трис(оксиметил)аминометан |П|.

4.26    Спирт этиловый ректификованный но ГОСТ Р 51652. х.ч.

4.27    Спирт изопропиловый по ГОСТ 9805. х.ч.

4.28    Додец ил сульфат натрия (SDS) |12|.

4.29    Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

4.30    Вода особо чистая стерильная, не содержащая ДНК. РНК и дезоксирибонуклеаз.

4.31    Фермент термостабильный Taq-полимераза, оптимум активности при 70 *С—72 *С |13|.

4.32    ПЦР буфер десятикратный (10х; 12.1 г в 1 дм' Трис-НС1. pH 8,8; 37,28 г в 1 дм' KCI. 5 % Твин-20. 50 % фор мам ид; 142.83 мг в 1 дм' MgCU).

4.33    Гуанидин тиоцианат |14|.

4.34    N-|2-OKCHJT»u|nnncpa3HH-N'-|2-3raHcyjiw|)OHOBiiB кислота] (HEPES) |15|.

4.35    Масло вазелиновое медицинское по ГОСГ 3164.

4.36    Раствор водный деюксирибонуклеозидтрифосфатон: дА'ГФ. дГТФ. дТТФ. дЦТФ с концентрацией 2 мМ каждою |16|.

4.37    Раствор заведомо трансгенной ДНК (около 100 нг/мм' или 106 копий/мм') [17].

4.38    Раствор заведомо нетрансгенной ДНК (окаю 100 нг/мм' или 10* копий/мм ) |18|.

4.39    Баня >юдяиая |19|.

4.40    Раствор водный праймеров «ПР-1» ддя амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров:

праймеры на промотор 35.5 вируса мозаики цветной капусты:

35S_п    5' ССТ ССТ CGG ATT CCA TTG ССС AG    (23 н о.)

J55_o<|)    5' GTC CAT CTT TGG GAC CAC TGT CGG    (24 н о.)

праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:

gus_п    5' AAG CCG GGC AAT TGC TGT GCC A    (22 н о.)

£и.*_оф    5' GAC CGC АТС GAA ACG CAG CAC G    (22 н о.)

праймеры на промотор nos из а1робактерии Agrohacterium lumefaciens:

nos_и    5' CGA TGA CGC    GGG АСА AGC CGT    (21    h.o.)

nos_оф    5' GAC CTT AGG CGA CTT TTG AAC GCG C (25 h.o.)

праймеры на маркерный ген nptH из транспазона Тп5 бактериального происхождения:

npi_n    5' GTG ТТС CGG    CTG ТСА GCG CAG G    (22 н о.)

npt_0ф    5' CGC AAG GAA    CGC CCG TCG TGG    (21    н.о.)

праймеры на терминатор ocs из а1робактерии Agrohaderium lumefaciens:

ofjji    5' GCG AGA CGC    СТА TGA TCG CAT GAT    (24 h.o.)

«С5_оф    5' GAA ACC GGC    GGT AAG GAT CTG AGC    (24 h.o.)

Примечание — В обозначениях праймеров индекс « и* означает «прямой», индекс « оф» означает •обрагный флуоресцентномеченый»; н.о. — нуклеотидные остатки |20|.

4.41    Биологический микрочин с иммобилизованными олигонуклеотидами, приведенными в таблице I |21|:

Таблица 1 — Олигонуклеотиды, иммобилизованные на биологическом микрочипе

Наименование олиюнуклсотмда

Детектируемая мишень

Последовательность олигонуклеотида

Jttjl

Промотор 3SS

5' GCC АТС ATT GCG АТА AAG G

gUSM

Ген gus

5' CTG GTA ТСА GCG CGA А

H0SH

Промотор nos

5' GCT AAG САС АТА CGT CAG АА

npt_\и

Ген nptH

5' GGC AGC GCG GCT АТС

ости

Терминатор ocs

5' ТТС TGT TGT GCA CGT TGT А

Примечание — Индекс «_и* означает «иммобилизованный».


I — предметное стекло; 2— гелевые ячейки

Рисунок 1 — Схема биологического микрочипа для иле1гтификации гене тически модифицированных источников растительного происхождении

4


ГОСТ Р 52174-2003

Биологический микрочип представляет собой стандартное предметное стекло по ГОСТ 9284 для световой микроскопии, на поверхности которого в определенном порядке расположены 10 микроскопических ячеек (рисунок 1), заполненные полиакриламидным гелем. Каждая из пяти верхних ячеек содержит индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид (35S. gus. nos. npi или ocs). Три ячейки с индексом «НК* не содержат ранее перечисленных индивидуальных ковалентно иммобилизованных олигонуклеотидов и выполняют роль отрицательного контроля гибридизации. Две ячейки с индексом «М» содержат ковалентно связанный флуоресцентный краситель и предназначены для однозначной ориентации биологического микрочипа. Поверхность биологического микрочипа с ячейками должна быть закрыта пластиковой крышкой с отверстиями, которая вместе с предметным стеклом образует замкнутое пространство, предназначенное для проведения гибридизации анализируемой пробы.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

(Поправка).

5    Отбор проб

Отбор проб проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп нишевого сырья (в том числе посевного и посадочного материала), нишевых продуктов, цветов.

6    Подготовка к проведению анализа

6.1    Приготовление растворов

6.1.1    Приготовление раствора NaOH концентрации 40 г/дм1

В стеклянную плоскодонную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 100 см ' помещают 4.0 г сухой гидроокиси натрия но ГОСТ 4328 и растворяют в 100 см' особо чистой стерильной воды по 4.30. После охлаждения раствора до комнатной температуры его переливают в специальную щелочеустойчивую пластиковую плотно закрывающуюся емкость. Срок хранения при комнатной температуре — не более одного года.

6.1.2    Приготовление раствор;! ЭДТЛ концентрации 186.12 г/дм1

В стеклянную плоскодонную колбу вместимостью 100 см1 помещают 18,61 г ЭДТЛ по 4.24. растворяют в 80 см' особо чистой стерильной воды при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке |6|. Затем раствором гидроокиси натрия по 6.1.1 доводят pH раствора до 8.0. Полученный раствор переливают в мерную колбу по ГОСТ 12738 вместимостью 100 см’ и особо чистой стерильной водой доводят объем этого раствора до метки. Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678 при температуре 4 ’С—5 ’С — нс более 6 мес.

6.1.3    Приготовление 70 %-ного раствора этилового спирта

В мерную колбу вместимостью 200 см’ по ГОСТ 12738 вносят 140 см' 96 %-ного этилового спирта высокой степени очистки по ГОСТ 1* 51652. добавляют 52 см' особо чистой стерильной воды и перемешивают. Срок хранения при температуре 4 *С—5 *С — не более 6 мес.

6.1.4    Приготовление гибридизационного буфера

В стеклянный стакан или плоскодонную колбу вместимостью 300—500 см’ помещают точно отмеренные количества: 44.33 (±0.01) г гуанидин тиоцианата — по 4.33 114|. 4.88 (±0.01) г N-|2-nu-роксиэтил|пинеразин-М'-|2-'этансульфоновой кислоты| натриевой соли (HEPES) по 4.34 II5|. Затем стеклянной пипеткой по ГОСТ 29227 вместимостью 5 см’ приливают 3.75 (±0.05) см' раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.2. и цилиндром вместимостью 250 см’ добавляют 200 см’ особо чистой стерильной воды. Стакан с раствором помещают на магнитную мешалку по 4.9 |6| и перемешивают до полного растворения компонентов. Доводят значение pH буфера до 7.5 (±0,1) добавлением раствора гидроокиси натрия, приготовленного по 6.1.1. Полученный раствор из стакана переносят в мерную колбу вместимостью 250 см’, доводят объем до метки «кобо чистой стерильной водой и разливают по 50 см1 в плоскодонные колбы с притертыми пробками. Срок хранения при температуре 2 *С—8 °С — не более 12 мес.

6.1.5    Приготовление раствора Трнс-НО концентрации 242.2 г/дм1

В колбу вместимостью 100 см’ помешают 24.22 г Трнс (оксиметил) аминометана по 4.25 |11| и растворяют приблизительно в 80 см’ особо чистой стерильной волы. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят pH раствора до 7,5. а объем — до 100 см1 «кобо чистой стерильной водой. Срок хранения при комнатной температуре — не более 6 мес.

6.1.6    Приготовление раствора NaCI концентрации 146.2 г/дм’

В плоскодонную колбу вместимостью 100 см’ помещают 14.62 г хлористого натрия по

5

ГОСТ 4233, растворяют в 70—80 см' особо чистой стерильной воды, затем полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см' и особо чистой стерильной водой доводят до метки. Срок хранения при комнатной температуре — не более одного год;!.

6.1.7    Приготовление раствора 20 %-ного додеиилсульфата натрия (SDS) (121

В стеклянную колбу вместимостью 100 см' помешают 20 г сухого додеиилсульфата натрия по 4.27 и добавляют 80 см' особо чистой стерильной воды. Растворяют при плавном перемешивании на магнитной мешалке и одновременном шпревании до температуры 40 ’С—50 ’С до полного растворения. Срок хранения при комнатной температуре — не более одного года.

6.1.8    Приготовление буфера экстракции

В мерной колбе вместимостью 50 см' смешивают 5 см' раствора Трис-HCl, приготовленного но 6.1.5, 5 см' раствора NaCI, приготовленного по 6.1.6. 1.25 см' раствора 20 %-ного SDS, приготовленного по 6.1.7. и 2.5 см3 раствора ЭДТА. приготовленного по 6.1.2; каждый раствор отбирают отдельной стеклянной пипеткой. Объем раствора доводят до 50 см' особо чистой стерильной водой. Срок хранения при температуре 4 °С—5 2 3С — не более двух недель, в морозильной камере по ГОСТ 26678 при температуре минус 20 2С — нс более одного года.

6.1.9    Раствор Taq-полимеразы но 4.31 хранят при температуре минус 20 2С не более одного год;». Не допускается хранение раствора Taq-полимеразы ниже температуры минус 23 ’С.

6.2 Приготовление пробы для а нал та (выделение ДНК)

6.2.1    Две навески каждого анализируемого продукта массой 60—80 мг помешают в две чистые стерильные микроцентрифужные пробирки по 4.15 вместимостью 1.5 см', в течение 15—20 с доводят до состояния однородной смеси пестиком по ГОСТ 21400 при комнатной температуре и сразу микродозатором добавляют по 400 мм' буфера экстракции, приготовленного по 6.1.8.

6.2.2    Микроцентрифужные пробирки со смесью, приготовленной но 6.2.1. интенсивно встряхивают в течение 5 с на аппарате для встряхивания по 4.10 |7|. быстро нагревают на водяной бане |19| до температуры 65 2С и выдерживают при этой температуре 15—20 мин. периодически осторожно перемешивая содержимое.

6.2.3    Микроцентрифужные пробирки со смесью, приготовленной по 6.2.2. центрифугируют при комнатной температуре в настольной центрифуге по 4.8 |5| при частоте вращения 13000 мин-1 в течение 5 мин.

6.2.4    Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.3, отбирают но 300 мм' и переносят в чистые микроцентрифужные пробирки, содержащие по 300 мм' изопропилового спирта но ГОСТ 9805. Содержимое перемешивают, выдерживаю! 5 мин при комнатной температуре и центрифугируют 5 мин при частоте вращения 13000 мин-1.

6.2.5    Надосадочную жидкость по 6.2.4 тщательно удаляют микродозатором, а осадок ДНК. полученный по 6.2.4. промывают I см' 70 %-ного этилового спирта, приготовленного по 6.1.3 и охлажденного до температуры 0 ’С—4 ’С. центрифугируют аналогично 6.2.4. Полученную надосадочную жидкость вновь тщательно удаляют, а осадок ДНК подсушивают при комнатной температуре до полного удаления этилового спирта, но не более 30 мин.

6.2.6    Осадок ДНК. полученный по 6.2.5, перерастая ют в 40—50 мм' особо чистой стерильной воды. Полученный раствор ДНК используют для проведения амПЦР. Срок хранения раствора ДНК при температуре минус 20 "С — нс более одного года.

6.3 Подготовка асимметричной мультиплексной ПНР

6.3.1    Приготовление реакционной смеси для амПЦР2

6.3.1.1    В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1.5 см' микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 3 мм' 10х буфера реакционного для ПНР но 4.32; 3 мм' смеси дсзоксирибонуклеозидтри<|юсфатов но 4.36 1161. 2.5 мм' фермента Taq-полимеразы по 4.31 |13| (концентрацией 5 Ед. акт/мм V2. а также водный раствор праймеров по 4.40 |20| в следующих ко н цс нтран и я х (нг/дм'):

35S_n/35Sjx\> - 15,32/81.02;

gusu/gusofy — 3.75/37.59;

nos_11/жи_оф — 3.61 /84.74;

пр1_п/пр!_оф — 7.51/36.01:

ocs_u/ocs_oQ — 8.18/41.41.

ГОСТ Р 52174-2003

Смесь разбавляют «кобо чистой стерильной водой ло объема 27 мм’ (из расчета на одну анализируемую пробу) и осторожно перемешивают в течение 3—5 с на аппарате дли встряхивания, не допуская образования пены. Общий объем реакционной смеси для амПЦР готовят с учетом числа анализируемых проб и двух контрольных проб: положительный контроль (заведомо трансгенная ДНК по 4.37) и отрицательный контроль (заведомо нетрансгенная ДНК по 4.38).

6.3.1.2    Реакционную смесь для амПЦР. полученную по 6.3.1.1. осаждают кратковременным (10—15 с) центрифугированием на настольной центрифуге при частоте вращения 1500—3000 мин-1 и сразу же используют для проведения анализа.

6.3.2    Все этапы амПЦР должен проводить квалифицированный, специально обученный персонал в соответствии с требованиями (22). Для проведения амПЦР допускается использовать только стерильную лабораторную посуду и новые стерильные микроцентрифужные пробирки. При проведении амПЦР каждую микроцентрнфужную пробирку открывают только перед отбором или внесением анализируемой пробы, а по окончании манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микроцентрифужных пробирок с анализируемыми пробами и оставлять их открытыми длительное время. Каждую анализируемую пробу отбирают микродозатором с новым стерильным наконечником с фильтром.

7 Проведение анализа

7.1    Проведение асимметричной мультиплексной ПЦР

7.1.1    Реакционную смесь для амПЦР, полученную по 6.3.1.2, микродозатором вносят в чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 0.2 или 0.5 см3 по 27 мм3 в каждую.

7.1.2    Анализируемую ДНК. выделенную по 6.2. вносят микродозатором поЗ мм3 в микроцентрифужные пробирки с реакционной смесью для амПЦР по 7.1.1. При использовании амплифккатора ДНК по 4.3 |3| без подогрева крышки в каждую микроцентрифужную пробирку с реакционной смесью вносят по 30 мм ' вазелинового масла по ГОСТ 3164 для предохранения реакционной смеси от испарения водной (разы при амПЦР. В этом случае анализируемую ДНК вносят под слой масла, в результате чего образуются водная и масляная фазы.

7.1.3    В две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 3 мм3 раствора заведомо трансгенной ДНК (положительный контроль) и раствора заведомо нетрансгенной ДНК (отрицательный контроль).

7.1.4    Все микроцентрифужные пробирки со смесями, полученными по 7.1.2. и растворами, подготовленными по 7.1.3. помешают в амплификатор ДНК и проводят амПЦР по программе, указанной в таблице 2.

Табл и ц а 2 — Программа проведении амПЦР

Шаг программы

Температура. *С

Время инк)бапии

Чисто циклов

1

95

5 мин

1

2

95

30 с

37

62

30 с

72

30 с

3

72

5 мин

1

7.2 Гибридизация на биологическом микрочипе

7.2.1    В необходимое количество микроцентрифужных пробирок микродозатором вносят по 24 мм3 гибридизационного буфера, приготовленного по 6.1.4. Затем к гибридизационному бу«|)еру добавляют но 12 мм3 водной фазы ПЦР-смеси. полученной в результате проведения амПЦР по 7.1.4. и перемешивают в течение 20—30 с на аппарате для встряхивания по 4.10 с частотой вращения не менее 1500 мин"1 для получения гибрид и зацион ной смеси.

7.2.2    Из каждой микроцентрифужной пробирки микродозатором отбирают по 28 мм' гибри-дизационной смеси (для каждого биологического микрочипа), полученной по 7.2.1, и всю смесь помешают на поверхность биологического микрочина через отверстие в пластиковой крышке. Гибридизацию проводят в термостате |4| при температуре 37 *С в течение IX ч.

7

7.2.3 После окончания гибридизации пластиковые крышки снимают, каждый биологический микрочип трижды промывают дистиллированной водой по ГОСТ 6709 при температуре 25 *С и высушивают при комнатной температуре.

Схема метода идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения приведена в приложении Б.

8    Обработка результатов анализа

8.1    Визуализацию гибридизационной картины на биологическом микрочипе для анализируемой пробы осуществляют с помощью аппаратно-программного комплекса для анализа флуоресценции биологических микрочипов «Чиидстсктор-03* |2| и компьютерной программы «Imageware» |1| или «Био-1» |23|.

(Поправка).

8.2    Полученную на экране компьютер;! гибриди защитную картину для анализируемой пробы сравнивают с гибридизационной картиной для положительного контроля (заведомо трансгенной ДНК) и гибридизационной картиной для отрицательного контроля (заведомо нетрансгенной ДНК). Пример гибридизационной картины флуоресцентных продуктов амПЦР в голевых ячейках биоло-шчеекого микрочипа приведен в приложении В. Наличие высокого уровня специфического флуоресцентного сигнала в голевых ячейках биологического микрочипа, содержащих иммобилизационные олигонуклеотиды (для промоторов 35S и nos. терминатора ocs. гонов gns или npt/f). свидетельствует о присутствии конкретных чужеродных последовательностей ДНК в анализируемой пробе, т. е. о трансгенности анализируемой ДНК. Низкий уровень флуоресцентных сигналов в гелевых ячейках биологического микрочипа посте гибридизации, сравнимый с уровнем <|юновой флуоресценции отрицательного контроля, но не выше установленного порога чувствительности в программе Imageware. указывает на отсутствие конкретных чужеродных последовательностей ДНК в анализируемой пробе, т. е. о нетрансгенности анализируемой ДНК.

8.3    Интерпретация результатов

8.3.1    Высокий уровень флуоресценции одной, нескольких или всех пяти голевых ячеек биологического микрочипа, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, превышающий заданный в программе Imageware 111 порог чувствительности, свидетельствует о наличии генетически модифицированных источников (ГМИ) в анализируемом продукте.

8.3.2    Низкий уровень флуоресценции всех пяти голевых ячеек биологического микрочипа, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, близкий к фоновой флуоресценции отрицательных контроле)! и не достигающий заданного в программе «Imageware* порога чувствительности, свидетельствует об отсутствии генетически модифицированных источников (ГМ И) в анализируемом продукте.

8.3.3    Высокий уровень флуоресценции гелевых ячеек при использовании заведомо нетрансгенной ДНК свидетельствует о получении ложноположигольного результата. Причиной может быть загрязнение ГМ И реактивов н/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором соляной кислоты (I моль/дм’). заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. Полученный при повторном анализе низкий уровень флуоресценции гелевых ячеек при использовании заведомо нетрансгенной ДНК свидетельствует о достоверном результате, который является окончательным.

8.3.4    Низкий уровень (отсутствие) флуоресцентного сигнала при использовании заведомо трансгенной ДНК свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР или несоблюдение условий проведения амПЦР и/ил и гибридизации на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. Полученный при повторном анализе высокий уровень флуоресценции гелевых ячеек при использовании заведомо трансгенной ДНК свидетельствует о достоверном результате, который валяется окончательным.

9    Требования безопасности

9.1    При выполнении всех работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.

9.2    Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано обшей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

9.3    При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

1

2

Реакционную смесь для амПЦР готовят непосредственно перед анализом при температуре не выше

20 2С.

3

Срок хранения Taq-полимеразы после разведения при температуре от 2 2С до 8 2С — нс более 2 ч.

6