Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методы ускоренного определения бактерий рода Campylobacter в пищевой продукции и оценка их антибиотикорезистентности

Методические указания МУ 4.2.3545—18

Издание официальное

Москва • 2019

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методы ускоренного определения бактерий рода Campylobacter в пищевой продукции и оценка их антибиотикорезистентности

Методические указания МУ 4.2.3545—18

Пипетки градуированные вместимостью 1,2,

5 и 10 см³

Пробирки типа эппендорф вместимостью 0,5 см^ и 1,5 см³

Пробки силиконовые, целлюлозные, ватно-марлевые для стеклянных колб, флаконов, пробирок

Планшеты иммунологические 96-луночные стерильные

Пробирки центрифужные конические стерильные вместимостью 15 см³ и 50 см³ Пробирки стеклянные типов П1, П2 Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С (цена деления шкалы 1 °С) Термоконтейнер (сумка-холодильник)

Флаконы и колбы стеклянные вместимостью 250 см³, 500 см³, 1000 см³,2000 см³ Халаты, шапочки, маски, бахилы одноразовые, перчатки резиновые или латексные неопудрнные Чашки биологические (Петри) стеклянные или одноразовые из полимерных материалов диаметром 90 мм или 100 мм

3.3. Реактивы, питательные среды, дезинфицирующие средства

3.3.1. Реагенты для ПЦР и иммуноанализа Иммунохроматофафические тесты для выявления Campylobacter spp. Комплекты реагентов (наборы) для выделения ДНК/РНК из нишевой продукции

Комплекты реагентов для роботизированных систем экстракции ДНК/PI 1К (силика магнитная, буфер лизирующий, буферы для экстракции) Комплекты реагентов (наборы) для проведения ПЦР с гибридиза-ционно-флуоресцентной детекцией, обеспечивающие аналитическую чувствительность на уровне 1 х 10³ ГЭ/см³ в отношении выявляемых фрагментов ДНК бактерий Campylobacter spp., содержащие: смеси оли-гонуклеотидных праймеров на участки ДНК бактерий и флуоресцентномеченых олигонуклеотидных зондов, комплементарных участкам ам-плифицируемых ДНК-мишеней; полимеразу (TaqF), смесь буфера и нук-леозидтрифосфагов, ДНК-буфер, положительные контрольные образцы этапа ПЦР со специфическими фрагментами ДНК искомых микроорганизмов и внутренним контрольным образцом, отрицательный контроль-

ный образец и внутренний неконкурентный контрольный образец этапа выделения, минеральное масло для ПЦР

Наборы реагентов для определения бактерий рода Campylobacter методом фермент-связаниого флуоресцентного иммуноанализа по методическим указаниям¹.

3.3.2. Реактивы, питательные среды для селективного обогащения микроорганизмов и их компоненты

Агар микробиологический Агар Мюллера-Хинтона Амфотерицин Ацетон

Добавка ростовая аэротолсрантная на основе натрия пировинограднокислого, железа (II) сернокислого, натрия метабисульфита для кампилобактерий в соответствии с методическими указаниями Бульон Престона для накопления кампилобактерий Бульон для бруцелл Вода дистиллированная Гидролизаг казеина ферментативный Диски с антибиотиками: эритромицином, гентамицином, ципрофлоксацином, налидиксовой кислотой, амикацином, тетрациклином, доксициклином, клиндамицином, хлорамфениколом (при необходимости могут быть использованы диски с другими антибиотиками) Добавки селективные антибиотиков для кампилобактерий, модифицированные Железо (II) сернокислое Калий фосфорнокислый однозамещенный Камиилобакагар Кислота соляная

Колумбийский кровяной агар (основа)

Кристалвиолет

Кровь дсфибринированная для питательных сред,стерильная

Мульти микротесты для биохимической идентификации Campylobacter spp.

Набор реагентов для окраски по Граму Натрий хлористый

Натрий фосфорнокислый однозамещенный безводный

Натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный

Натрия гидросульфит Натрия гидроокись Натрий метабисульфит Пейтон мясной ферментативный Пептон соевый Полимиксин В сульфат Рифампицин Сафранин

Стандарт мутности МакФарланда 0,5 ед.

Тест-системы для определения минимальных ингибирующих концентраций антибиотика² (например, Е-тесты, MIC Tests, Sensititre Cam ру и)

Транспортная среда Кэрри - Блера Трафарет для отбора смывов площадью 100 см² Трехсахарный железосодержащий агар (на основе сред № 13, Клиглера, Олькеницкого)

Экстракт дрожжевой сухой L-цистеина гидрохлорид

Приготовление и контроль качества питательных сред осуществляют в соответствии с ГОСТ ISO 11133-2016.

3.3.3. Тест-штаммы Контрольные тест-штаммы бактерий Campylobacter jejuni, С. coli, С. lari, типичные по культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам

Тест-штаммы должны быть снабжены «Паспортом штамма», выданным национальной или международной коллекцией микроорганизмов, видовая принадлежность контрольных штаммов должна быть подтверждена с использованием биохимических и генотипических методов.

Тесг-штаммы необходимо сохранять в лиофильно высушенном виде. При регулярном использовании допускается сохранять в полужидком агаре для бруцелл или в полужидкой среде по п. 4.3.12, в пробирках с плотно притертыми пробками, в защищенном от света месте, при температуре (5 ± 1) °С с еженедельным пересевом, или замораживать при температуре (-70 ± 2) °С, хранение в течение 2—3 мес.

3.3.4. Дезинфицирующие средства Спирт этиловый ректификованный    ГОСТ 5962-2013

Средства дезинфицирующие на основе трихлоризоциануровой кислоты, натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты.

Допускается использование других средств измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных в настоящем стандарте. Допускается использование других реактивов по качеству и чистоте не ниже вышеуказанных.

IV. Подготовка к проведению испытаний

4.1. Приготовление растворов и реактивов

4.1.1.    Изотонический 0,85 % водный раствор натрия хлорида готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1-84.

4.1.2.    Растворы и реактивы для окраски микроскопических препаратов по Граму, растворы гидроокиси натрия и соляной кислоты готовят в соответствии с инструкциями изготовителя или но ГОСТ 10444.1-84.

4.1.3.    Фосфатно-буферный раствор (далее - ФБР).

Приготовление концентрированного раствора: (34 ± 0,4) г одиоза-

мещенного фосфорнокислого калия (КН₂Р0₄) растворяют в 500,0— 700,0 см³ дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1 000 см³ по ГОСТ 1770-74. Активную кислотность раствора (7,2 ±0,1) ед. pH устанавливают добавлением 1 Н раствора гидроокиси натрия и доводят дистиллированной водой до 1 000,0 см . Полученный раствор хранят в емкости, укупоренной резиновой пробкой, в условиях холодильника не более 30 сут.

Приготовление разбавленного раствора: 1,25 см³ концентрированного раствора вносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 1 000 см³ по ГОСТ 1770—74 и доводят объем дистиллированной водой до метки, проверяют активную кислотность, которая должна составлять (7,1 ± 0,1) ед. pH.

ФБР разливают по 9,0 см³ в пробирки, по 90,0 см³ в колбы вместимостью 250 см³ по ГОСТ 1770, и по 900,0 см³ в колбы вместимостью 2 000 см³ по ГОСТ 1770, закрывают ватными пробками. Стерилизуют в автоклаве при (121 ± I) °С в течение (20 ± 1) мин.

4.1.4.    При добавлении к 1 дм^ ФБР натрия хлорида в количестве 9 г до стерилизации получают фосфатный буферный 0,9 % раствор NaCl.

4.1.5.    Аэротолерантная (ростовая) добавка.

Аэротолерантную добавку готовят по следующему порядку:

-    натрий пировинограднокислый - 6,25 г;

-    железо (II) сернокислое - 6,25 г;

-    натрий метабисульфит - 6,25 г;

-    стерильная дистиллированная вода - 100 см³.

Натрий пировинограднокислый растворяют в 10—-20 см³ стерильной дистиллированной воды, добавляют железо (II) сернокислое и натрия метабисульфит, доводят объем раствора до 100 см³. Разливают в пробирки по 4 см³. Хранят в защищенном от света месте при температуре минус 20 °С не более 1 мес. Раствор чрезвычайно чувствителен к воздействию света, после его добавления к питательным средам их необходимо сохранять в защищенном от света месте.

4.2. Подготовка посуды и материалов

Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при (160 ± 5) °С в течение 2 ч или в паровом стерилизаторе (автоклаве) при (121 ± 1)°С в течение (30 ± 1)мин с последующим подсушиванием в стерилизационном сушильном шкафу.

Чашки Петри и пипетки стерилизуют завернутыми в плотную оберточную бумагу или в пеналах. В верхнюю часть пинетки предварительно вкладывают кусочек ваты.

Пробирки, флаконы, бутылки, колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробки (кроме пробирок) надевают бумажный колпачок, который обвязывают вокруг горлышка ниткой или закрепляют резиновым колечком.

Каучуковые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют в автоклаве упакованными в бумагу.

Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками. Срок хранения стерильной посуды - не более 30 суток при ненарушенной упаковке или в невскрытых пеналах.

Перед применением одноразовых наконечников с фильтром для дозаторов и чашек Петри одноразовых необходимо проверить герхметич-ность их упаковки.

4.3. Приготовление питательных сред

4.3.1.    Приготовление и контроль качества питательных сред осуществляют в соответствии с ГОСТ ISO 11133-2016 согласно инструкции изготовителя. Допускается применение сред лабораторного приготовления из отдельных компонентов.

4.3.2.    Селективный бульон Престона готовят в соответствии с порядком, изложенным в МУК 4.2.2321—08.

4.3.3.    Жидкая селективная среда для накопления кампилобактерий.

Жидкую селективную среду для накопления кампилобактерий готовят в соответствии со следующим порядком:

Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,4

Компоненты среды растворяют в 1 000 см³ дистиллированной воды, при наличии осадка фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH (7,0 ± 0,1); разливают в пробирки, флаконы или другие емкости, стерилизуют автоклавированием 15 мин при 121 °С. Стерильную основу среды охлаждают до температуры 45—50 °С и асептически вносят в нее кровь стерильную дефибринированную в количестве 50 см³, антибиотики - полимиксин В сульфат (5000Е), рифампицин (10 мг) и амфогерицин (10 мг).

Готовая среда должна быть прозрачной, светло-соломенного цвета, после добавления крови - темно-красного цвета. Готовую к применению питательную среду хранят при 2—8 °С не более5 дней.

4.3.4.    Селективный агар Престона готовят в соответствии с порядком, изложенным в МУК 4.2.2321—08.

4.3.5.    Дифференциально-диагностический агар для выделения и количественного учета Campylobacter spp. (далее - ДДА Campy).

Среду ДДА Campy готовят в соответствии со следующим порядком:

Основа среды (г/дм³):

Пептон мясной ферментативный 15,0

Пептон соевый ферментативный	8,0
D-глюкоза	5,0
Агар микробиологический	15,0
Натрия хлорид	5,0
Натрий пировинограднокислый	0,25
Натрия метабисульфит	0,25
Железо сернокислое (II)	0,25
Натрий углекислый	0,5
Аскорбиновая кислота	0,75
Компоненты среды растворяют в	1 000 см3 дистиллированной во-

ды, нагревают до полного расплавления агара, при наличии осадка фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH (7,0 ±0,1); разливают в пробирки, флаконы или другие емкости, стерилизуют автоклавированием 15 мин при 121 °С. В стерильную основу среды, охлажденную до температуры 45—50 °С, вносят асептически кровь стерильную дефибринированную в количестве 50 см³, антибиотики - нолимик-сина В сульфат (5000Е), рифамгшцин (10 мг) и амфотерицин (10 мг).

4.3.6.    Кампилобакагар.

Кампилобакагар готовят из сухой среды в соответствии с инструкцией изготовителя.

4.3.7.    Колумбийский кровяной агар.

Колумбийский кровяной агар готовят из сухой среды в соответствии с инструкцией изготовителя. К охлажденной до 45—50 °С стерилизованной среде асептически добавляют 70 см³ стерильной дефибрини-рованной крови, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри слоем толщиной 5 см.

4.3.8.    Бульон для бруцелл.

Бульон для бруцелл готовят из сухой среды в соответствии с инструкцией изготовителя.

4.3.9.    Транспортная среда Кэрри - Блера. Используют готовую жидкую среду в пробирках промышленного производства, или готовят из сухой среды в соответствии с инструкцией изготовителя.

4.3.10.    Агар Мюллера - Хинтона.

Агар Мюллера - Хинтона готовят из сухой среды в соответствии с инструкцией изготовителя. К охлажденной до 45—50 °С стерилизованной среде асептически добавляют 70 см³ стерильной дефибринирован-ной крови, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри слоем толщиной 5 см.

4.3.11.    Трехсахарный железосодержащий агар (на основе сред №13, Клиглера, Олькеницкого).

Готовят из соответствующих сред промышленного изготовления согласно инструкций изготовителя.

4.3.12. Полужидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp.

Полужидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp. готовят в соответствии со следующим порядком:

Компоненты среды растворяют в 1 000 см³ дистиллированной воды, нагревают до полного расплавления агара, при наличии осадка фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH (7,0 ±0,1); разливают в пробирки, флаконы или другие емкости, стерилизуют автоклавированием 15 мин при 121 °С. Стерильную среду инокулируют культурой Campylobacter spp, инкубируют посевы в течение (48 ±2)чв микроаэрофильных условиях (N2 - 85 %, СО2 - 10 %, 0₂ - 5 %) при температуре (41,5 ± 0,5) °С, после чего к инокулированной среде добавляют стерильный глицерин в соотношении 15 : 85, перемешивают и хранят в холодильнике или замораживают при температуре (-70 ± 2) °С.

V. Создание микроаэрофильных условий культивирования

5.1. Оптимальная газовая среда для культивирования бактерий рода Campylobacter имеет состав: двуокись углерода (С0₂) -10%, кислород (0₂) - 5 %, азот (N₂) - 85 %.

Посевы помещают в контейнеры для анаэробного культивирования определенного объема, в анаэростат или в стерильные газонепроницаемые пакеты, куда вкладывают газогенераторные пакеты для кампило-бактерий. Газогенераторные пакеты рассчитаны на определенный объем анаэростата (газонепроницаемых систем настольных), что необходимо учитывать при их применении. Инкубирование посевов проводят при температуре (42,0 ± 0,5) °С.

Культивирование посевов допускается осуществлять непосредственно в анаэробном инкубаторе или СОг-инкубаторс, позволяющем поддерживать температуру (42 ± 1) °С и оптимальный состав газовой среды.

VI. Отбор и подготовка проб для анализа 6.1. Отбор и подготовка проб пищевой продукции для анализа

Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с МУК 4.2.2321—08, ГОСТ 31904-2012, ГОСТ 26669-85, ГОСТ ISO 7218—2015, ГОСТ Р 50396.0-2013, ГОСТ Р 51447-99.

Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования и минимально вдвое превышать размер анали-тического(их) образца(ов).

Учитывая, что кампилобактерии очень чувствительны к воздействию факторов окружающей среды, таких как воздействие кислорода, высушивание, снижение pH, нагревание, УФ-излучение и длительное хранение в аэробных условиях, при отборе проб пищевых продуктов на наличие бактерий рода Campylobacter необходимо соблюдать следующие правила:

-    отбор проб и их доставку в лабораторию для исследования проводят в максимально короткие сроки, по возможности не более 1 часа;

-отбор проб твердых пищевых продуктов осуществляют в стерильные газонепроницаемые пакеты, удаляют избыток воздуха, герметизируют путем перекручивания свободных краев пакета и фиксации при помощи обхвата, пробы жидких продуктов отбирают в герметично закрывающуюся стерильную стеклянную посуду;

-отбор проб расфасованной пищевой продукции осуществляют в оригинальной упаковке, не допуская нарушений ее целостности;

-    доставку проб в лабораторию осуществляют в термоконтейнере с охлаждающими вкладышами (в сумке-холодильнике);

-до проведения анализа пробы сохраняют в защищенном от света месте, при температуре (5 ± 1) °С, пробы замороженных продуктов размораживают в защищенном от света месте при температуре (5 ± 1) °С в течение нс более 18 часов или в течение 1 часа при температуре (19±1)°С;

-    после вскрытия упаковки пробы подвергают исследованию немедленно, приготовление объединенной пробы, навесок продукта и посев осуществляют в максимально короткие сроки. Для приготовления объединенной пробы продукт измельчают, не допуская активного перемешивания пробы во избежание воздействия кислорода.

6.2. Взятие смывов

6.2.1.    При проведении контроля на загрязненность возбудителями кампилобактериоза проводят отбор и анализ смывов с поверхностей оборудования, инвентаря, рук и одежды персонала.

6.2.2.    Производственный контроль эффективности мер, направленных на предотвращение перекрестной контаминации кампилобактерия-ми на предприятиях птицеперерабатывающей промышленности, осуществляется в соответствии с законодательством в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения³, с учетом порядка и периодичности контроля санитарного состояния предприятий на патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы.

Требования к организации работ по производственному контролю в целях профилактики кампилобактериоза установлены в санитарно-эпидемиологическими правилами⁴.

Ориентировочная частота проведения анализа смывов на наличие кампилобактерий для оценки санитарного состояния конкретного предприятия представлена в табл. 1.

Отбор смывов производится после санитарной обработки, перед началом работы оборудования. При обнаружении бактерий рода Campylobacter в смывах периодичность контроля на соответствующем участке увеличивают в 2 раза.

ББК51.23

M54

M54 Методы ускоренного определения бактерий рода Campylobacter в пищевой продукции и оценка их антибиотикорези-стснтности: Методические указания— М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2019.—32 с.

ISBN 978 5-7508-1699-6

1.    Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (С. А. Шевелева, Н. Р. Нфимочкина, Л. II. Минаева,

В. В. Стеценко, И. Б. Быкова, Т. В. Пичугина, Ю. М. Маркова, Ю. В. Ко-роткевич, А. С. Полянина, А. И. Алешкина).

2.    Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации A. IO. Поповой 25 декабря 2018 г.

3.    Введены впервые.

ББК 51.23

Компьютерная верстка Е. В. Ломановой

Подписано в печать 9.09.19 Формат 60x84/16    Псч.    л.    2,0

Тираж 100 экз.    Заказ

Федеральная служба по надзору в сфере защиты нрав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18, стр. 5,7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован ФБУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а

Реализация печатных изданий, тсл./факс: 8 (495) 952-50-89

© Роспотребнадзор, 2019

Таблица 1 Рекомендуемый порядок взятия смывов на предприятиях птицеперерабатывающей промышленности

Объекты контроля Периодичность контроля Цеха убоя, первичной переработки мяса и птицы Крупное оборудование, включая конвейеры, поверхности столов, ванны охлаждения Не реже 1 раза в две недели, не менее 5 проб Мелкое оборудование и инвентарь (выборочно, с чередованием единиц оборудования Нс реже 1 раза в две недели, не менее 5 проб Цеха производства сырых по-луфабрикатов из мяса и птицы Крупное оборудование Не реже 1 раза в месяц, не менее 3 проб Мелкое оборудование и инвентарь (выборочно, с чередованием единиц оборудования Нс реже 2 раз в месяц, не менее 3 проб Цеха упаковки Тара, упаковочное оборудование, поверхности, контактирующие с продукцией Не реже 2 раз в квартал, не менее 3 проб Руки персонала, одежда у работников, соприкасающихся с продукцией, в середине и в конце смены Нс реже 2 раз в квартал, не менее 5 проб

6.2.3.    При обнаружении термофильных кампилобактерий в смывах с технологического оборудования, инвентаря убойных, яйцеобрабатывающих цехов проводят внеочередную тщательную механическую и санитарную обработку, дезинфекцию оборудования, включая холодильные камеры. При последующем контроле за проведенными мероприятиями термофильные кампилобактерий в смывах не должны обнаруживаться.

6.2.4.    Для взятия смывов используют зонд-гампоны стерильные в комплекте с пробирками. Предварительно в промаркированные пробирки асептически вносят по 5 см³ стерильных жидких сред по п. 4.3 -бульон Престона с кровью, бульон для бруцелл, среду Кэрри - Блера.

Пробы смывов в исследуемой зоне отбирают трижды, с участка площадью 100 см² для каждого тампона, используя стерильный трафарет из металла 10 * 10 см. Трафарет фламбируют перед каждым употреблением. Смывы с мелкого оборудования берут со всей поверхности. После взятия смыва каждый зонд-тампон быстро погружают в пробирку с соответствующей средой, избегая встряхивания. Полученные пробы помещают в стерильный газонепроницаемый пакет, вкладывают газогенераторный пакет для кампилобактерий и герметично запаковывают. Доставку проб в лабораторию для исследования проводят в максимально короткие сроки.

Содержание

I.    Общие положения и область применения.............................................................4

II.    Основные методы...................................................................................................5

III.    Средства измерения, оборудование и реактивы.................................................7

IV.    Подготовка к проведению испытаний..............................................................13

V.    Создание микроаэрофильных условий культивирования................................17

VI.    Отбор и подготовка проб для анализа..............................................................18

VII.    Проведение анализа..........................................................................................21

VIII.    Учет результатов..............................................................................................25

DC. Оценка чувствительности выделенных штаммов кампилобактерий

к антимикробным препаратам...........................................................................25

X.    Требования безопасности и квалификации операторов...................................28

XI.    Условия выполнения измерений.......................................................................29

Нормативные и методические документы..............................................................31

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

25 декабря 2018 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методы ускоренного определения бактерий рода Campylobacter в пищевой продукции и оценка их антибиотикорезистентности

Методические указании _МУ    4.2.3545—18_

I. Общие положения и область применении

1.1.    Настоящие методические указания по методам контроля (далее - МУК) устанавливают ускоренные методы определения термофильных бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах и смывах с объектов окружающей среды, а также порядок проведения микробиологического контроля на наличие бактерий рода Campylobacter на предприятиях птицеперерабатывающей промышленности.

МУК носят рекомендательный характер.

1.2.    В группу термофильных бактерий рода Campylobacter с оптимальной температурой роста +42 °С входят возбудители кампилобакте-риоза С. jejuni ssp. jejuni, С. jejuni ssp. doylei, C. coli, C. lari, C. upsaliensis и C. helveticus, обладающие способностью инфицировать человека и теплокровных животных. Наибольшую эпидемиологическую значимость представляют С. jejuni, которые обусловливают основную часть случаев камиилобактериоза.

1.3.    МУК устанавливают методы оценки чувствительности к антимикробным препаратам термофильных бактерий рода Campylobacter, выделенных из пищевой продукции и смывов с объектов окружающей среды предприятий птицеперерабатывающей промышленности, для це-

лей мониторинга антибиотикорезистентных возбудителей кампилобак-териоза и разработки мер ограничения их циркуляции.

1.4.    МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль безопасности пищевой продукции, в том числе импортируемой в Российскую Федерацию, для проведения производственного контроля на предприятиях птицеперерабатывающей промышленности, для лабораторной диагностики зараженности кампи-лобактериями пищевой продукции при расследовании вспышек заболеваний с пищевым путем передачи, а также могут использоваться другими лабораторными центрами (лабораториями), осуществляющими производственный контроль основною и вспомогательного сырья, производственных процессов, контроль безопасности пищевой продукции в соответствии с законодательством в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения⁵.

1.5.    МУК распространяются на пищевую продукцию и смывы с объектов окружающей среды на предприятиях птицеперерабатывающей промышленности, подлежащие исследованиям на наличие термофильных бактерий рода Campylobacter, для оценки санитарно-гигиенического состояния производства и эффективности проводимых санитарнопротивоэпидемических (профилактических) мероприятий, а также в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора (контроля) - для целей мониторинга заболеваемости населения кампилобактериозом с пищевым путем передачи.

1.6.    МУК применяются для исследования продуктов убоя птицы, продукции ее переработки, полуфабрикатов из птицы; смывов с оборудования и инвентаря, контрактных поверхностей в производственных, складских, моечных помещениях, с рук и санитарной одежды персонала, с тары и упаковки для пищевой продукции.

II. Основные методы

2.1. МУК устанавливают ускоренные методы определения термофильных бактерий рода Campylobacter в пищевой продукции и смывах на основе:

-    бактериологического анализа (качественного и количественного, с идентификацией до рода);

-    фермент-связанного флуоресцентного иммуноанализа (качественного недифференцированного суммарного определения бактерий видов С. jejuni, С. coliy С. lari');

-    ПЦР-анализа с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

Применение указанных МУК позволяет сократить время анализа в

сравнении со стандартными методами на 3—4 суток.

2.2.    Бактериологический (культуральный) метод определения бактерий рода Campylobacter в пищевой продукции предусматривает посев определенных количеств продукта в жидкие селективные среды, содержащие антибиотики и аэротолерантные добавки, с последующим пересевом на поверхность агаризованных селективных сред, инкубирование посевов, выявление в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры. Все этапы инкубации посевов осуществляются в микроаэрофильных условиях. Идентификация чистых культур проводится по совокупности культуральных, морфологических и биохимических признаков, определяющих принадлежность к бактериям рода Campylobacter.

2.3.    Бактериологический (культуральный) метод определения бактерий рода Campylobacter в смывах с объектов окружающей среды предусматривает комплексный анализ трех проб в исследуемой зоне (3 х 100 см²) с применением трех видов сред для накопления и транспортирования, с последующими пересевами на поверхность агаровых дифференциально-диагностических сред.

2.4.    Метод фермент-связанного флуоресцентного иммуноанализа бактерий рода Campylobacter основан на связывании бактериальных антигенов, находящихся в бульоне обогащения, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), последующем удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, меченых щелочной фосфатазой, к адсорбированному комплексу антиген-антитело и флуоресцентно-меченого субстрата, и измерении флуоресценции продукта гидролиза флуоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата), который катализируется щелочной фосфатазой. Интенсивность флуоресценции измеряется при длине волны 450 нм.

2.5.    Метод детекции термофильных бактерий рода Campylobacter на основе ПЦР предусматривает высев определенных количеств исследуемых проб пищевых продуктов или смывов в селективные питатель-

ные среды, инкубирование посевов, экстракцию ДНК из культуральной жидкости, амплификацию участка ДНК со специфичными праймерами и постановку ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией амнли-конов в режиме реального времени.

2.6. Оценку антибиотикочувствительности штаммов термофильных кампилобактерий, выделенных из пищевой продукции или объектов окружающей среды, проводят диско-диффузионным методом, с использованием дисков с антибиотиками и измерением зон ингибирования роста исследуемой культуры. При необходимости определяют минимальную концентрацию антибиотика, подавляющую рост штамма (МИК, минимальная ингибирующая концентрация) методом серийных разведений в планшете или с применением Е-тестов, представляющих собой модифицированный вариант диффузионного метода тестирования с применением полосок, пропитанных убывающими концентрациями антибиотиков.

III. Средства измерения, оборудование и реактивы

3.1. Оборудование и средства измерений Анализатор потенциометрический с диапазоном измерения pH от 3,0 до 8,0 с точностью ± 0,01 ед. pH при температуре +25 °С    ГОСТ    27987

Баня водяная с терморегулятором, позволяющая поддерживать температуру от 0 до 100 °С Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс) или ламинарный шкаф класса биологической безопасности II тип А

Весы лабораторные общего назначения, 2 класса

точности, с наибольшим пределом взвешивания

1 000 г    ГОСТ    Р    53228

Встряхиватель вибрационный типа «Вортекс»

со скоростью вращения до 3 000 об./мин

Денситометр для бактериальных суспензий,

калиброванный по стандартам мутности

МакФарланда

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды, соответствующей ГОСТ 6709

Дозаторы иипеточные автоматические с переменным объемом дозирования от 0,1 мм³ до 1 000 мм³ с точностью ± 0,8 %

Гомогенизатор бактериологический перистальтического типа

Инкубаторы-анаэростаты, С0₂-инкубаторы или другие устройства, создающие анаэробные/мик-роаэрофильные условия культивирования Микроскоп биологический бинокулярный с увеличением 900х—ЮООх с иммерсионной системой

Микроцентрифуга настольная типа эппендорф (частота вращения не менее 13 ООО мин'¹) Камера морозильная, обеспечивающая температуру не выше минус 20 °С Камера морозильная, обеспечивающая температуру не выше минус 70 °С, для хранения выделенных культур кампилобактерий Насос вакуумный (водоструйный)

Облучатель бактерицидный настенный с мощностью бактерицидных ламп 30 Вт и производительностью (95 % обеззараживания) не менее 300 м³/ч. Автоматический ИФА-анализатор для фермент-связанного флуоресцентного иммуноанализа Амплификатор программируемый для проведения качественного и количественного анализа ДНК методом полимеразной реакции в режиме «реального времени» и «но конечной точке», с использованием различных комбинаций реагентов - флуорофоров и с возможностью регистрации флуоресцентного сигнала не менее чем по четырем каналам

Системы экстракции ДНК/РНК роботизированные Стерилизатор паровой медицинский (автоклав)

Термостат твердотельный для пробирок тина эппендорф вместимостью 1,5 см³, диапазон температур от 25 до 100 °С Термостат электрический суховоздушный с диапазоном рабочих температур от 20 до 60 °С и отклонением от заданной температуры не более ± 1 °С

Холодильник с температурой от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С для хранения выделенных проб ДНК Часы механические сигнальные Шкаф сушильно-стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру в диапазоне от 50 до 200 °С с погрешностью ±2°С

3.2. Лабораторная посуда и материалы Бумага фильтровальная лабораторная Вага медицинская гигроскопическая Зонд-тампоны для отбора, транспортировки и хранения биологических проб в комплекте с пробиркой стерильные Колбы стеклянные плоскодонные конические или круглые различной вместимости Контейнеры стерильные из полимерных материалов с крышками для отбора проб Марля медицинская Микропробирки для Г1ЦР стерильные тонкостенные 0,2 см³ (плоская крышка, коническое дно) - для амнлификаторов с детекцией через дно пробирки; 0,2 см³ (куполообразная крышка) - для амплификаторов с детекцией через крышку Наконечники одноразовые с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования от 0,1 мм³ до 1 000 мм³

Ножницы медицинские    ГОСТ 21239

Оптические стандарты МакФарланда j4« 1,2, 3

Пакеты полимерные для стерилизации

лабораторных принадлежностей и

обеззараживания отходов

Пакеты бумажные для стерилизации

лабораторных принадлежностей

Пакеты газогенераторные для кампилобактерий

Пакеты полимерные    ГОСТ    12302

Петли бактериологические калиброванные

на 1 мм³

Пергамент    ГОСТ 1341

1

МУК 4.2.2321—08 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах», утвержденные Роспотребнадзором 24.01.2008, с изменениями МУК 4.2.2878—II «Дополнения и изменения № 1 к МУК 4.2.2321—08 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах», утвержденным Роспотребнадзором 24.06.2011 (далее - МУК 4.2.2321—08).

2

Примечание: Допускается использование тест-систем с аналогичными или лучшими характеристи кам и.

3

   Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения»; санитарные правила СП 1.1.1058—01 «Организация и проведение производственного контроля за соблюдением Санитарных правил и выполнением санитарнопротивоэпидемических (профилактических) мероприятий», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 13.07.2001 № 18 (зарегистрировано Минюстом России 30.10.2001, регистрационный номер 3000), с изменениями, внесенными постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 27.03.2007 № 13 (зарегистрировано Минюстом России 26.04.2007, регистрационный номер 9357); санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.7.2816——10 «Профилактика кампилобактериоза среди людей», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от

29.12.2010    № 188 (зарегистрировано Минюстом России 14.03.2011, регистрационный номер 20085) (далее - СП 3.1.7.2816—10 от 29.12.2010 X® 188).

4

   Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.7.2816—10 «Профилактика кампилобактериоза среди людей», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.12.2010 № 188 (зарегистрировано Минюстом России 14.03.2011, регистрационный номер 20085) (далее - СП 3.1.7.2816—10 от

29.12.2010    № 188).

5

Статья 40 Федерального закона от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения»; постановление Правительства Российской Федерации от 16.04.2012 № 317 «О лицензировании деятельности в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных (за исключением случая, если указанная деятельность осуществляется в медицинских целях) и генно-ннженерно-модифицирован-ных организмов Ш и IV степеней потенциальной опасности, осуществляемой в замкнутых системах».