Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

15 страниц

304.00 ₽

Купить ГОСТ Р 52173-2003 — официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Настоящий стандарт распространяется на пищевое сырье и продукты и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения.

Метод основан на полимеразной цепной реакции с соответствующими праймерами

  Скачать PDF

Оглавление

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

3 Определения

4 Аппаратура, материалы и реактивы

5 Отбор проб

6 Подготовка к проведению анализа

7 Проведение анализа

8 Обработка результатов анализа

9 Контроль результатов идентификации

10 Требования безопасности

Приложение А Пример фотографии результата электрофореза для идентификации генетически модифицированных источников: рекомбинантная ДНК (промотор 35S)

Приложение Б Пример фотографии результата электрофореза для идентификации генетически модифицированных источников: рекомбинантная ДНК (промотор nos)

Приложение В Библиография

Показать даты введения Admin

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ


СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод идентификации генетически модифицированных источников (гми) растительного происхождения


Издание официальное


I—2002/139


2


ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва


Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Научно-исследовательским институтом питания РАМН (ГУ НИИ питания РАМН), Центром «Биоинженерия* РАН

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность*

2    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 декабря 2003 г. № 402-ст

3    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

© ИПК Издательство стандартов, 2004

Настоящий стандарт нс может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта России

II

ГОСТ Р 52173-2003

Содержание

1    Область применения......................................... 1

2    I (ормативные ссылки......................................... 1

3    Определения.............................................. 2

4    Аппаратура, материалы и реактивы................................. 2

50гбор проб............................................... 3

6    Подготовка к проведению анализа................................. 4

7    Проведение анализа.......................................... 6

8    Обработка результатов анализа................................... 7

9    Контроль результатов идентификации............................... 8

10 Требования безопасности...................................... 8

Приложение А Пример фотографии результата электрофореза для идентификации генетически

модифицированных источников: рекомбинантная ДН К (промотор 35S)..... 9

Приложение Б Пример фотографии результата электрофореза для идентификации генетически

модифицированных источников: рекомбинантная ДНК (терминатор nos) . . .    10

Приложение В Библиография.................................... II

III

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метол идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного

происхождения

Raw material and food-stuff's. Method for the identification of genetically modified organisms

(GMO) of plant origin

Дата введения 2005-01-01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые сырье и продукты (далее — продукт) и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения.

Метод основан на полимеразной цепной реакции (ПЦР) с соответствующими праймерами.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вс1гтилляционныс. Общие требования

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3164-78 Масло вазелиновое медицинское. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9656-75 Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 12738-77 Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия

1

Издание официальное

2-725

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электро шкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия.

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посула и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

3    Определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1    генетически модифицированные источники пищи: Продукты (компоненты), используемые человеком в пищу в натуральном или переработанном виде, полученные из генетически модифицированных организмов.

3.2    генетически модифицированный организм: Организм или несколько организмов, любые пекл сточные, одноклеточные или многоклеточные образования, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии или содержащие генно-инженерный материал, в том числе гены, их фрагменты или комбинацию генов.

3.3    генная инженерия: Совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.

4    Аппаратура, материалы и реактивы

4.1    Лмплификатор типа «Тсрцик МС-2* под микроцс1гтрифужныс пробирки типа Эппсндорф вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 см3 со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента нс менее

1,5 ‘С/с (1).

4.2    Прибор для горизонтального электрофореза типа «Mini-Sub Cell GT System* с комплектом кювет и гребенок |2].

4.3    Источник напряжения типа «Power Рас 300* с диапазоном регулируемого напряжения 50-300 В [3].

4.4    Видеосистема типа «Gel Doc 2000™*, предназначенная для ввода в компьютер, анализа и документирования изображений люминисцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием: диапазон излучения 300—400 нм, чувствительность — нс менее 10 нг ДНК (по бромистому этидию) (4).

4.5    Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.

4.6    Камера морозильная, обеспечивающая температуру минус 20 *С.

4.7    Микроцентрифуга настольная типа Эппсндорф (частота вращения не менее 12000 мин ')

15].

4.8    Термостат типа «TERMO 24-15* под микроцентрифужные пробирки типа Эппсндорф вместимостью 0,5 и 1,5 см3, диапазон температур от 15 *С до 120 *С, количество гнезд — нс менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры — 0,2 *С, разность температур между соседними ячейками — не более 0,5 *С (6).

4.9    Аппарат для встряхивания типа «Вортекс*, скорость вращения 250—3000 мин '.

4.10    Печь микроволновая (мощностью нс менее 400 Вт).

4.11    Весы лабораторные общего назначения высокого класса точности (условное обозначение (П)) с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

4.12    Баня водяная [7].

4.13    pH-метр с набором электродов, с погрешностью ±0,1 pH.

4.14    Дозаторы с переменным объемом дозирования:

0,2—2,0 мм3, шагом 0,01 мм3, точностью ±1,2 %;

ГОСТ P 52173-2003

0,5—10,0 мм3, шагом 0,01 мм3, точностью ±0,8 %;

2—20 мм3, шагом 0,01 мм3, точностью ±0,8 %;

20—200 мм3, шагом 0,1 мм3, точностью ±0,6 %;

100—1000 мм3, шагом 1 мм3, точностью ±3 %;

2—10 см3, шагом 0,1 см3, точностью ±0,5 %.

4.15    Пробирки микроцснтрифужныс типа Эппсндорф вместимостью 0,2; 0,5 и 1,5 см3.

4.16    Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000 мм3; 10 см3.

4.17    Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические вместимостью 25; 50; 100; 200; 1000 см3 по ГОСТ 12738.

4.18    Цилиндры стеклянные мерные лабораторные на 25; 100; 1000 см3 по ГОСТ 1770.

4.19    Пестик тефлоновый или стеклянная палочка по ГОСТ 21400 под размер микроцентри-фужной пробирки вместимостью 1,5 см3.

4.20    Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

4.21    Кислота соляная по ГОСТ 3118, х. ч.

4.22    Кислота борная по ГОСТ 9656, х. ч.

4.23    Этилсндиаминтстрауксусная кислота (ЭДТЛ), х. ч. |8|.

4.24    Гексадсцилтри метилам мои иум бромид [9).

4.25    Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч.

4.26    Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х. ч.

4.27    Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х. ч.

4.28    Спирт изопропиловый, х. ч. [ 10].

4.29    Масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164.

4.30    Хлороформ по ГОСТ 20015, х. ч.

4.31    Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

4.32    Вода деионизированная (II).

4.33    Трис (оксимстил) аминометан, х. ч. (12).

4.34    2-мсркаптоэтанол, х. ч. (13).

4.35    Этидий бромистый, х. ч. (14).

4.36    Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА) (15).

4.37    Термостабильный фермент Taq-полимераза, огтгимум работы в области 70 *С — 72 *С (16).

4.38    ПНР буфер (17).

4.39    Агароза для электрофореза (тип II) (18).

4.40    Маркер молекулярной массы ДНК (19).

4.41    Стандартный образец состава генетически не модифицированного источника пиши растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-0) (20).

4.42    Стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM JV& 4I0R SB-5) (21).

4.43    Нуклеотиды:

2'-дезоксиаденозин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ) (22); 2,-дезоксицитидин-5’ трифосфорной кислоты тетранатрисвая соль, тригидрат (ЦТФ) (23); 2'-дезоксигуанозин-5' трифосфорной кислоты тетранатрисвая соль, тригидрат (ГТФ) (24); 2'-дезокситимидин-5’ трифосфорной кислоты тетранатрисвая соль, тригидрат (ТТФ) (25);

4.44    Праймеры на промотор J5S(26):

J5S-1 5'GCT ССТ АСА ААТ GCC АТС А 3’;

35S-2 5 GAT AGT GGG ATT GTG CGT СА 3\

4.45    Праймеры на терминатор nos (27):

nos-1 5'GAA ТСС TGT TGC CGG TCT TG 3’; nos-2 5TTA TCC TAG TTT GCG CGC ТА 3*.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

5 Отбор проб

3

Отбор проб проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевого сырья и пищевых продуктов.

2*

6 Подготовка к проведению анализа

6.1    Приготовление растворов

6.1.1    Приготовление раствора концентрацией с (Трис-НС1)=1 моль/дм’

В мерную колбу по ГОСТ 12738 вместимостью 100 ем* помешают 12,11 г Трис (оксиметил) аминометана по 4.33, (12) растворяют в приблизительно 80 ем* деионизированной воды по 4.32, (II). Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят pH раствора до 7,5, затем доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678 при температуре от 4 *С до 5 ’С — нс более 6 мсс.

6.1.2    Приготовление раствора концентрацией с (NaCl) = 5 моль/дм’

В мерную колбу вместимостью 100 см’ помещают 29,22 г хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в приблизительно 80 см’ деионизированной воды, доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 *С до 5 *С — не более 6 мес.

6.1.3    Приготовление раствора концентрацией с (NaOH) = 30 %

В колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 50 см’ помешают 3 г гидроокиси натрия по ГОСТ 4328, растворяют в 7 см’ деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 *С до 5 *С — не более 6 мсс.

6.1.4    Приготоалснис раствора концентрацией с (ЭДТА) = 0,5 моль/дм’

В мерную колбу вместимостью 100 см’ помещают 14,62 г этилсндиаминтстрауксусной кислоты по 4.23, (8), растворяют в приблизительно 80 см’ деионизированной воды. Раствором гидроокиси натрия, приготоаленным по 6.1.3, доводят pH раствора до 8,0, деионизированной водой доводят до метки и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 *С до 5 *С — не более 6 мес.

6.1.5    Приготоалснис лизирующего буфера

В мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 25 см’ помещают 0,5 г бромида гсксадсцилтриме-тиламмония, растворяют в 10 см’деионизированной воды, добавляют автоматическим микродозатором 2,5 см’ раствора Трис-ИС1, приготовленного по 6.1.1, 7 см’ раствора хлористого натрия, приготовленного по 6.1.2, I см’ раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.4, доводят деионизированной водой до метки, перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 *С до 5 *С — не более 6 мсс. В случае выпадения осадка при хранении раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате по 4.8, (6) при температуре 65 *С до полного растворения.

Непосредственно перед использованием в приготовленный раствор добавляют автоматическим микродозатором меркаптоэтанол по 4.34, (13) из расчета 4 мм’ на 1 см’ лизирующего буфера и перемешивают.

6.1.6    Приготовление хлороформа, насыщенного водой

В колбу вместимостью 200 см’вносят цилиндром по ГОСТ 1770 100 см’ хлороформа по ГОСТ 20015, добавляют 20 см’деионизированной воды по ГОСТ 6709, тщательно перемешивают и оставляют на 24 ч для насыщения.

Срок хранения при температуре от 4 *С до 5 *С — не более 6 мес.

6.1.7    Приготовление 70 %-ного раствора этилового ректификованного спирта

В колбу вместимостью 200 см’ вносят цилиндром 70 см’ 96 %-ного этилового ректификованного спирта по ГОСТ Р 51652, добавляют 26 см’деионизированной воды и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 *С до 5 *С — нс более 6 мсс.

6.1.8    Приготовление раствора концентрацией с (БСА) = 20 мкг/см’

В пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см’ помещают 0,002 г сухого БСА по 4.36, (15), добавляют I см’деионизированной воды, перемешивают до полного растворения. Отбирают 10 мм’ приготовленного раствора и переносят в пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см’, добавляют I см’ деионизированной воды и перемешивают.

Срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20 *С — не более 1 мес.

6.1.9    Приготовление смеси нуклеотидов концентрацией с = 4 ммоль/дм’

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 0,2 ем’ вносят 96 мм’ деионизированной воды, 1мм’АТФ (концентрацией 100 ммоль/дм’) по 4.43, (22), 1мм’ ГТФ (концентрацией 100 ммоль/дм’) по 4.43, [24], 1 мм’ ЦТФ (концентрацией 100 ммоль/дм’) по 4.43, [231, I мм’ ТТФ (концентрацией 100 ммоль/дм5) по 4.43, (25), смесь перемешивают.

Срок хранения при температуре минус 20 *С — нс более одного года.

ГОСТ Р 52173-2003

6.1.10    Приготовление 1 ТВЕ буфера для электрофореза

В мерную колбу вместимостью 1000 см1 вносят 10,8 г Трис (оксиметил) амипометана, 5,5 г борной кислоты по ГОСТ 9656 и 0,92 г этилендиами1ггетрауксусной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают до полного растворения.

Срок хранения при комнатной температуре — не более 1 мес.

6.1.11    Приготовление раствора концентрацией с (C^H^NjBr) = 10 мг/см3

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 1 г бромистого этидия по 4.35, [14], растворяют и доводят до метки дистиллированной водой.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 *С — нс более 12 мес.

6.1.12    Приготовление 2 %-ного агарозного геля

6.1.12.1    В плоскодонную стеклянную колбу вместимостью не менее 200 см1 помещают I г агарозы по 4.39, [18], добааляют 50 см' буфера 1 ТВЕ, приготовленного по 6.1.10, тщательно перемешивают взбалтыванием. Колбу со смесью нагревают в микроволновой печи по 4.10 или на водяной бане при температуре 100 *С и кипятят до полного расплавления агарозы.

6.1.12.2    Расплавленную агарозу, приготовленную по 6.1.12.1, охлаждают при комнатной температуре до 50 *С, автоматическим микродозатором добавляют 5 мм3 раствора бромистого этидия, приготовленного по 6.1.11, тщательно перемешивают круговыми движениями.

6.1.12.3    Однородную смесь, полученную по 6.1.12.2, разливают в кюветы для электрофореза и с помощью гребенки формируют карманы. Через 15—30 мин после остывания геля гребенку удаляют.

Допускается хранение геля в I ТВЕ буфере для электрофореза, приготовленного по 6.1.10, в холодильнике при температуре от 4 *С до 5 *С — нс более 7 сут.

6.2 Подготовка пробы

6.2.1    Две навески анализируемого продукта, навеску стандартного образца состава генетически нс модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-0) no 4.41, [20] и навеску стандартного образца состава генетически модифицированного источника пиши растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM .N? 4I0R SB-5) no 4.42, [21] массой от 70 до 80 мг каждая помешают в четыре микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 1,5 см3. С помощью дозатора добавляют в каждую по 200 мм3 лизирующего буфера с меркаптоэтанолом по 6.1.5 и немедленно тефлоновым пестиком растирают смесь до получения однородной массы. В каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 600 мм3 лизирующего буфера с меркаптоэтанолом. Смесь тщательно перемешивают тефлоновым пестиком, нс допуская образования комков. Затем смесь перемешивают в течение 30 с на аппарате для встряхивания типа «Вортекс*.

6.2.2    Приготовленные по 6.2.1 смеси помещают в термостат, инкубируют при температуре 65 *С 40—60 мин, после чего повторно перемешивают 30 с на аппарате для встряхивания и центри-фугируют 7 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф по 4.7, [5] при частоте вращения 12000-13000 мин Л

6.2.3    Надосадочную жидкость приготовленных по 6.2.2 смесей переносят в четыре чистые микро центрифужныс пробирки вместимостью 1,5 см3, нс захватывая частицы суспензии из осадка. Затем в каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 400 мм3 хлороформа, приготоаленного по 6.1.6, перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с до образования суспензии. Полученные суспензии центрифугируют 7 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения 12000 мин 1 при комнатной температуре.

6.2.4    Верхние слои (водные фазы), приготоаленные по 6.2.3, из четырех пробирок переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см3, нс захватывая слой хлороформа. Экстракцию хлороформом и центрифугирование по 6.2.3 повторяют дважды.

6.2.5    Верхние слои (водные фазы), приготоаленные по 6.2.4, переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см3, добааляют в каждую из них по 600 мм3 изопропилового спирта по 4.28, [10], предварительно охлажденного в морозильной камере до температуры минус 20 *С, и перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с.

Полученные смеси помешают в морозильную камеру температурой минус 20 *С не менее чем на 30 мин для образования осадка дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

На данном этапе допускается хранение полученных смесей до 12 ч в морозильной камере при температуре минус 20 *С.

6.2.6    Смеси, приготовленные по 6.2.5, центрифугируют 6 мин при частоте вращения 12000 мин-1 при комнатной температуре. Аккуратно удаляют надосадочную жидкость. Каждый осадок 2—3 раза промывают 200 мм3 70 %-ного этилового ректификованного спирта, приготовлен-ного по 6.1.7, каждый раз перемешивая осадки на аппарате для встряхивания 15—20 с и центрифугируя их на микронентрифуге 6 мин при частоте вращения 12000 мин Тщательно Сдо последней капли) удаляют надосадочную жидкость.

6.2.7    Осадки, приготовленные по 6.2.6, растворяют в 50—100 мм5 деионизированной воды и получают раствор ДНК.

Растворы ДНК, приготовленные по 6.2.7, непосредственно используют для проведения ПНР или хранят при температуре мшгус 20 *С сроком до одного года в морозильной камере.

6.3 Приготовление реакционных смесей № 1 и № 2

6.3.1    Приготовление реакционной смеси № I на пять проб

В микроиентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см3, помещенную в кювету со льдом, вносят 312,5 мм3 деионизированной воды, 52,5 мм3 10 буфера для ПЦР с хлоридом магния по 4.38, (171, 26 мм3 смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 мм3 праймера на промотор 35S-1 (концентрацией 20 мкмоль/дм3) по 4.44, (26), 13 мм3 праймера на промотор 35S-2 (концентрацией 20 мкмоль/дм3) по 4.44, (26), 2,5 мм3 фермента Taq-полимсразы (концентрацией 5 сд/мм3) по 4.37, (16), 52,5 мм3 раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.

6.3.2    Приготовление реакционной смеси № 2 на пять проб

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см3, помещенную в кювету со льдом, вносят 312,5 мм3 деионизированной воды, 52,5 мм3 10 буфера для ПЦР с хлоридом магния, 26 мм3 смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 мм3 праймера на терминатор жи-1 (концентрацией 20 мкмоль/дм3) по 4.45, (27), 13 мм3 праймера на терминатор жи-2 (концентрацией 20 мкмоль/дм3) по 4.45, (27), 2,5 мм3 фермента Taq-полимсразы (концентрацией 5 сд/мм3), 52,5 ммраствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.

6.3.3    Реакционные смеси № 1 и N? 2, приготовленные по 6.3.1 и 6.3.2, центрифугируют на настольной микроцентрифуге 30 с при частоте вращения 3000 мин Реакционную смесь № I разливают по 90 мм3 в пять микроцентрифужных пробирок вместимостью 0,2 см3 (или 0,5 см3 в зависимости от типа используемого амплификатора) для проведения ПЦР. Реакционную смесь № 2 разливают по 90 мм3 в пять других микроцентрифужных пробирок вместимостью 0,2 см3 (или 0,5 см3 в зависимости от типа используемого амплификатора) для проведения ПЦР. Реакционные смеси № 1 и № 2 готовят непосредственно перед проведением ПЦР.

7 Проведение анализа

7.1    В первые две пробирки с реакционной смесью № I и в первые две пробирки с реакционной смесью .N9 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из анализируемого продукта, приготовленный по 6.2.1.1—6.2.1.7, по 2 мм3 в каждую.

В третью пробирку с реакционной смесью № I и в третью пробирку с реакционной смесью № 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически нс модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 4I0R SB-0), no 2 мм3 в каждую.

В четвертую пробирку с реакционной смесью N? I и в четвертую пробирку с реакционной смесью № 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-5), no 2 мм3 в каждую.

В пят>ло пробирку с реакционной смесью № 1 и в пятую пробирку с реакционной смесью № 2 автоматическим микродозатором добавляют деионизированную воду по 2 мм3 в каждую — холостой опыт.

7.2    В каждую пробирку со смесью по 7.1 добавляют, нс перемешивая, по одной капле (20—40 мм3) вазелинового масла по ГОСТ 3164.

7.3    Пробирки со смесями, подготовленными по 7.2, помещают в амалификатор для проведения ПЦР. Программа амплификации для праймеров на промотор 35S приведена в таблице 1, на терминатор nos — в таблице 2.

6

ГОСТ P 52173-2003

Таблица I — Условия амплификации для 3SS промотора

Стадия

Тип амплификатора

Crocodile II

Gene Amp 2400

Progcnc

Trio

Терцик

МС-2

Денатурация

2 мин/98 *С

3 мин/94 'С

3 мин/95 'С

2 мин/% 'С

3 мин/94 'С

Амплификация

8 с/95'С

20 с/94 'С

36 с/95 'С

30 с/95 *С

20 с/94 'С

30 с/54 'С

40 с/54 'С

72 с/54 'С

40 с/54 'С

40 с/54 'С

40 с/72 'С

60 с/72 *С

84 с/72 'С

40 с/72 'С

60 с/72 *С

Количество циклов

40

40

40

40

40

Конечное удлинение

3 мин/72 *С

3 мин/72 'С

3 мин/72 'С

3 мин/72 'С

3 мин/72 'С

Фаза остывания

1 мин/30 'С

1 мин/4 *С

1 мин/4 'С

1 мин/4'С

1 мин/4 'С

Скорость нагрева

1 'С/с

0.77 *С/с

1.5 'С/с

1 'С/с

0,77 'С/с

Скорость остывания

1 *С/с

3,15 'С/с

1,5 *С/с

1 'С/с

3,15'С/с

Таблица 2 — Условия амплификации для терминатора nos

Стадия

Тип амплификатора

Crocodile II

Gene Amp 2400

Progene

Trio

Терцик

МС-2

Денатурация

3 мин/95 'С

3 мин/94 'С

3 мин/95 'С

2 мин/98'С

3 мин/94 'С

Амплификация

20 с/95 'С

20 с/94 'С

36 с/95 'С

30 с/95 'С

20 с/94 'С

40 с/54 'С

40 с/54 *С

72 с/54 'С

40 с/54 'С

40 с/54 'С

40 с/72 'С

60 с/72 'С

84 с/72 'С

40 с/72 'С

60 с/72 'С

Количество ЦИКЛОВ

40

40

40

40

40

Конечное удлинение

3 мин/72 'С

3 мин/72 'С

3 мин/72'С

3 мин/72 'С

3 мин/72 'С

Фаза остывания

1 мин/30 'С

1 мин/4 'С

1 мин/4 'С

1 мин/4'С

1 мин/4 'С

Скорость нагрева

1 'С/с

0,77 'С/с

1,5 'С/с

1 'С/с

0,77 'С/с

Скорость остывания

1 'С/с

3,15 'С/с

1,5 *С/с

1 'С/с

3,15'С/с

7.4    По окончании ПЦР из каждой микроцентрифужной пробирки осторожно из-под слоя вазелинового масла отбирают по 8 мм3 смеси и переносят в отдельный карман геля, приготовленного по 6.1.12.

7.5    В отдельный карман геля вносят 8 мм3 маркера молекулярной массы ДНК по 4.40, [19].

7.6    Гель помешают в камеру прибора по 4.2, [2) для проведения горизонтального электрофореза, заполненную буфером 1-ТБЕ.

Электрофорез проводят при напряженности электрического поля 6 В/см геля в условиях стабилизации напряжения в течение 65 мин.

7.7    Визуализацию продуктов ПЦР после электрофореза осуществляют с помощью видеосистемы по 4.4, [4].

7.8    Результат идентификации в виде файл-паспорта сохраняется на жестком магнитном носителе и может быть выведен на видеомонитор или принтер. Примеры изображений приведены в приложениях Л и Б.

8 Обработка результатов анализа

8.1 В пробе со стандартом ГМ И [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 4I0R SB-5), содержащего промотор J55] должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофоре грамме, составляет 195 пар

7

1