МКС 65.140; 65.160 67.060; 67.080 67.100; 67.120 67.140; 67.140.30 67.160.20; 67.180.20 67.200.20; 67.220

67.230

ИЗМЕНЕНИЕ № 1 СТБ ГОСТ Р 52174-2005

Биологическая безопасность СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа

Б1ялапчная бяспека

СЫРАВ1НА I ПРАДУКТЫ ХАРЧОВЫЯ

Метад щэнтыфжацьи генетычна мадыфжаваных крынщ (ГМК) раслшнага паходжання з прымяненнем б1ялапчнага мжрачыпа

Введено в действие постановлением Госстандарта Республики Беларусь от 18.04.2018 № 27

Дата введения 2018-07-01

Раздел 1. Второй абзац. Заменить слова: «пяти» на «десяти», «10¹² г (1 пг)» на «10 ⁹ г (1 нг, ~10³ геном-эквивалентов тотальной растительной ДНК/1 мкл пробы)».

Раздел 2. Первый абзац изложить в новой редакции:

«В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие технические нормативные правовые акты в области технического нормирования и стандартизации (далее - ТИПА):»; дополнить ссылкой:

«ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия»; дополнить примечанием:

«Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ТИПА по каталогу, составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году.

Если ссылочные ТИПА заменены (изменены), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться действующими взамен ТИПА. Если ссылочные ТИПА отменены без замены, то положение, в котором дана ссылка на них, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.».

Пункты 4.1,4.2 изложить в новой редакции:

«4.1 Универсальный аппаратно-программный комплекс (УАПК) для анализа биологических микрочипов с компьютерной программой для анализа полученных результатов [1].

4.2 Хлороформ по ГОСТ 20015, х. ч.».

Пункт 4.3. Заменить ссылку: «[3]» на «[2]».

Пункт 4.4. Заменить ссылку: «[4]» на «[3]».

Пункт 4.8. Заменить ссылку: «[5]» на «[4]».

Пункт 4.9. Заменить ссылку: «[6]» на «[5]».

Пункт 4.10. Заменить ссылку: «[7]» на «[6]».

Пункт 4.13. Заменить ссылку: «[8]» на «[7]».

Пункт 4.14. Заменить ссылку: «[9]» на «[8]».

Пункт 4.24. Заменить ссылку: «[10]» на «[9]».

Пункт 4.25. Заменить ссылку: «[11]» на «[10]».

Пункт 4.28 изложить в новой редакции:

«4.28 Цетилтриметиламмоний бромид [11].».

Пункт 4.31 изложить в новой редакции:

«4.31 Фермент термостабильный HotTaq-полимераза для ПЦР с «горячим стартом», оптимум активности при температуре 70 °С - 72 °С [12].».

Пункты 4.33-4.36 изложить в новой редакции:

«4.33 Буфер гибридизационный [13].

4.34    Баня водяная [18].

4.35    Раствор водный дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: дАТФ, дГТФ, дУТФ, дЦТФ, с молярной концентрацией по 2 мМ каждого [14].

4.36    Раствор флуоресцентного субстрата ФС [15].».

(Продолжение изменения № 1 к СТБ ГОСТ Р 52174-2005)

Пункт 4.37. Заменить ссылку: «[17]» на «[16]».

Пункт 4.38. Заменить ссылку: «[18]» на «[17]».

Пункты 4.39, 4.40 изложить в новой редакции:

«4.39 Раствор водный праймеров ПР-1 для амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров [19]:

-    праймеры для амплификации фрагмента гена RBCL, кодирующего большую субъединицу ри-булозы-1,5-бифосфат карбоксилазы/оксигеназы (Асе. № Z95552, поз. 160-720);

-    праймеры для амплификации фрагмента гена лектина LEI (Асе. № К00821М30884, поз. 1080-1720); -праймеры для амплификации фрагмента гена IVR1, кодирующего бета-фруктозидазу

(Асе. № U16123, поз. 300-1090);

-праймеры для амплификации фрагмента 355-промотора вируса мозаики цветной капусты (Асе. № FM 177585, поз. 3560-3870);

-праймеры для амплификации фрагмента 355-терминатора вируса мозаики цветной капусты (Асе. № FM177585, поз. 1260-1590);

-праймеры для амплификации фрагмента 355-промотора каулимовируса мозаики норичника (FMV, Асе. № Х06166, поз. 6260-6630);

-праймеры для амплификации фрагмента терминатора гена белка теплового шока пшеницы (Асе. № Х58279, поз. 10-210);

-праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена BAR, определяющего устойчивость к фосфинотрицину (Асе. № AY310901, поз. 380-920);

-праймеры для амплификации фрагмента терминатора nos из агробактерии Agrobacterium tume-faciens (Асе. № FM177585, поз. 10-370).

4.40 Раствор водный праймеров ПР-2 для амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров [20]:

-    праймеры для амплификации фрагмента гена фосфорилазы УДФ-глюкозы (UDP-GP) (Асе. № D00667, поз. 50-310);

-праймеры для амплификации фрагмента гена фосфат-синтазы риса (SPS) (Асе. № U33175, поз. 5910-6250);

-    праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена nptll из транспозона Тп5 бактериального происхождения (Асе. № EU886197, поз. 9792-10145);

-    праймеры для амплификации фрагмента терминатора ocs из агробактерии Agrobacterium tume-faciens (Асе. № AJ311872, поз. 5050-5240);

-    праймеры для амплификации фрагмента терминатора гена RBCS гороха (Асе. № FM177582.1, поз. 5782-5920);

-праймеры для амплификации фрагмента промотора гена актина риса АСТ1 (Асе. № S44221, поз. 12-380);

-    праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена gus из бактерии Escherichia coli (Асе. № EU503042, поз. 2770-3140).».

Раздел 4 дополнить пунктом 4.41:

«4.41 Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами, назначение которых приведено в таблице 1 (название олигонуклеотида соответствует изображенному на рисунке 1) [21].

Таблица 1 - Обозначение и назначение олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на биологическом микрочипе

Наименование олигонуклеотида Детектируемая мишень Назначение олигонуклеотида pIDNA (rbcL) Ген RBCL Зонд для идентификации ДНК растительного происхождения в анализируемом материале GMZSTI(RBCL) Ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК сои и/или картофеля ZMI(RBCL) Ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК кукурузы OSI(RBCL) Ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК риса STb(RBCL) Ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК картофеля GM2(RBCL) Ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК сои ZM/OS2(RBCL) Ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК кукурузы и/или риса ST2(RBCL) Ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК картофеля

(Продолжение изменения № 1 к СТБ ГОСТ Р 52174-2005)

Таблица 2 - Трансгенные видоспецифичные последовательности

Последовательности Номер образца 6/кс 7/кс 8/кс 9/кс При наличии nptll - + - - 35S_p CAMV - + - + 35S_p FMV - - - - Act1_p - - - - Gus - - - - nos_t - - - + 35S_t CAMV - - - - rbcSt - - - - Ocs_t - - - - Bar - - - -

Результат анализа: В образцах 7/кс и 9/кс обнаружены следующие трансгенные компоненты: в образце 7/кс обнаружены гомолог гена nptll, промотор 35S СаМУ и терминатор nos, а в образце 9/кс - промотор 35S СаМУ и терминатор nos. В образцах 6/кс и 8/кс трансгенные компоненты не обнаружены. Маркировка на упаковке, информирующая о наличии в продукте ГМИ, в образце 7/кс отсутствует. а в образце 9/кс присутствует.

Вывод: Все образцы содержат растительную ДНК: образец 6/кс - нетрансгенную ДНК сои, образец 7/кс - трансгенную ДНК сои, образец 8/кс - нетрансгенную ДНК картофеля, образец 9/кс - трансгенную ДНК картофеля.

Исполнители:

Иванов И. И.

фамилия, инициалы

_ Петров    П. П.

подпись    фамилия,    инициалы

Руководитель испытательной лаборатории

подпись

М. П.    _

фамилия, инициалы

Заключение распространяется на образец, представленный на испытания.».

11

(Продолжение изменения № 1 к СТБ ГОСТ Р 52174-2005)

Приложение Д изложить в новой редакции:

«Приложение Д

(справочное)

Библиография

[1 ] ТУ 9443-004-02699501-2006 ООО «Биочип-ИМБ» [2]    ТУ 9642-001-4648062-98 [3]    ТУ 42-619-61 [4]    Корпорация «Эппендорф», кат. № 5425 000.014 [5]    Корпорация «Хеликон», кат. № MSH-300 [6]    Корпорация «Хеликон», кат. № CV-1500 [7]    Корпорация «Хеликон», кат. № RP-30 и RP-80 [8]    Корпорация «Хеликон», кат. № FA104; FA108; FA 111; FA 113N [9]    ТУ 6-09-11-1721-83 [10]    ТУ 6-09-4292-76 [11]    Корпорация «Хеликон», кат. № Ат-0833 [12]    Корпорация «Силекс», кат. № Е0320 [13]    ТУ 9398-003-02699501-2006 [14]    Корпорация «Силекс», кат. № N1101 [15]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) [16]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук (ИФР РАН) [17]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук (ИФР РАН) [18]    ТУ 46-22-603-75 [19]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН)

Универсальный аппаратно-программный комплекс для анализа биологических микрочипов (УАПК) Амплификатор «Терцик МС-2» Термостат суховоздушный ТВР-25 Микроцентрифуга настольная 5415С, 13000 мин1 Мешалка магнитная с подогревом Аппарат для встряхивания (центрифуга-вортекс) Штативы под микроцентрифужные пробирки Наконечники с фильтром для микропипеток Этилендиаминтетрауксусной кислоты натриевая соль дигидрат Трис(оксиметил)аминометан [ЫН2С(СН20Н)з] Цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) [Ci9H42NBr] Фермент HotTaq-полимераза 5 ед. акт. в мм3 Буфер гибридизационный Раствор смеси дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ, по 25 мМ каждого Флуоресцентный субстрат «ФС» Раствор заведомо трансгенной ДНК около 100 нг/мм3 или 106 копий/мм3 Раствор заведомо нетрансгенной ДНК около 100 нг/мм3 или 106 копий/мм3 Баня водяная с электрическим или огневым подогревом Раствор водный праймеров ПР-1

---

[20]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) [21]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) [22]    Государственный комитет Санэпиднадзора Российской Федерации; № 06-19/52-17 от 15.06.95 [23]    ЗАО «НПФ ДНК-Технология» [24]    ТУ 9443-005-46482062-2003 [25]    ООО «БИОМАСТЕР-ПРОМ»

Раствор водный праймеров ПР-2 Биологические микрочипы (биочипы) гелевые с иммобилизованными олигонуклеотидами Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения Компьютерная программа «Gene» для учета и интерпретации результатов, полученных при помощи ПЦР-детектора «Джин» ПЦР-детектор «Джин» Комплекты реагентов для ПЦР-амплификации ДНК «CKAH-35S», «СКАН-gus», «СКАН-nos» и «СКАН-лр/» (ИУ ТИПА № 3-2018) 13

---

МКС 65.140; 65.160; 67.060; 67.080; 67.100; 67.120; 67.140; 67.140.30; 67.160.20; 67.180.20; 67.200.20; 67.220;

67.230

к СТБ ГОСТ Р 52174-2005 Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа

В каком месте Напечатано Должно быть Раздел 5 Отбор проб проводят по национальным стандартам Отбор проб проводят по [25] Приложение Д [25] Методические указания МУ 2.3.2.1917-04 Пищевые продукты и пищевые добавки. Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги

(ИУ ТИПА № 2-2010)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

СТБ ГОСТ Р 52174-2005

---

Биологическая безопасность

СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа

Б1ялапчная бяспека

СЫРАВ1НА I ПРАДУКТЫ ХАРЧОВЫЯ

Метад щэнтыфшацьм генетычна мадыф1каваных крынщ (ГМК) раслшнага паходжання з прымяненнем б1ялапчнага мшрачыпа

(ГОСТ Р 52174-2003, ЮТ)

Издание официальное

Г осстандарт Минск

УДК 663/664.001.4:006.354    МКС 65.140; 65.160; 67.060;    КП    03    ЮТ

67.080; 67.100; 67.120;

67.140; 67.140.30;

67.160.20; 67.180.20;

67.200.20; 67.220;

67.230

Ключевые слова: генетически модифицированные источники, идентификация генетически модифицированных источников, сырье и продукты пищевые, ассиметричная мультикомплексная полимеразная цепная реакция, биологический микрочип, гибридизация, праймер, олигонуклеотиды, последовательность ДНК, нетрансгенная ДНК, трансгенная ДНК, интенсивность флуоресценции

Предисловие

Цели, основные принципы, положения по государственному регулированию и управлению в области технического нормирования и стандартизации установлены Законом Республики Беларусь «О техническом нормировании и стандартизации»

1    ПОДГОТОВЛЕН республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт метрологии» (БелГИМ)

ВНЕСЕН отделом стандартизации Госстандарта Республики Беларусь

2    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ постановлением Госстандарта Республики Беларусь от 24 июня 2005 г. № 28

3 Настоящий стандарт идентичен государственному стандарту Российской Федерации ГОСТ Р 52174-2003 «Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа».

Государственный стандарт Российской Федерации разработан ТК 447 «Биологическая безопасность пищевых продуктов, кормов и товаров народного потребления и методы ее контроля», Институтом физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН и Институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда РАН.

Официальные экземпляры государственных стандартов Российской Федерации, на основе которого подготовлен настоящий государственный стандарт и на который дана ссылка, имеются в БелГИСС.

Степень соответствия - идентичная (ЮТ)

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5    ПЕРЕИЗДАНИЕ (апрель 2007 г.)

Настоящий стандарт не может быть тиражирован и распространен без разрешения Госстандарта Республики Беларусь

Издан на русском языке

СТБ ГОСТ Р 52174-2005

Содержание

1    Область применения..............................................................................................................................1

2    Нормативные ссылки.............................................................................................................................1

3    Определения...........................................................................................................................................2

4    Аппаратура, материалы и реактивы.....................................................................................................2

5    Отбор проб..............................................................................................................................................4

6    Подготовка к проведению анализа.......................................................................................................5

7    Проведение анализа..............................................................................................................................7

8    Обработка результатов анализа...........................................................................................................8

9    Требования безопасности.....................................................................................................................8

Приложение А (справочное) Определение термина..............................................................................9

Приложение Б (справочное) Схема метода идентификации генетически модифицированных

источников растительного происхождения.................................................................10

nptll и промотор nos).....................................................................................................11

Приложение Г (рекомендуемое) Пример оформления протокола испытания..................................12

Приложение Д (справочное) Библиография.........................................................................................13

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Биологическая безопасность СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа

Ыялапчная бяспека СЫРАВ1НА I ПРАДУКТЫ ХАРЧОВЫЯ Метад щентыф1кацьм генетычна мадыф1каваных крынщ (ГМК) расл1ннага паходжання з прымяненнем б1ялапчнага м1крачыпа

Biological safety Raw and food-stuffs Method for the identification of genetically modified organisms (GMO) of plant origin by using biological microchip

Дата введения 2006-01-01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевое сырье (в том числе посевной и посадочный материал), пищевые продукты, цветы (далее - продукт) и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с использованием биологического микрочипа.

Метод основан на асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции (амПЦР) с последующей гибридизацией продуктов этой амПЦР на биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает наличие или отсутствие в анализируемой пробе не менее пяти различных трансгенных последовательностей ДНК. Чувствительность метода - не менее 10"¹² г (1 пг) ДНК.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3164-78 Масло вазелиновое медицинское. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

Издание официальное

ГОСТ 9805-84 Спирт изопропиловый. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 12738-77 Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия

ГОСТ 13646-68 Термометры стеклянные ртутные для точных измерений. Технические условия

ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

3    Определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1    биологическая безопасность: (См. приложение А).

3.2    генетически модифицированные источники: Сырье и пищевые продукты (ингредиенты), используемые человеком в натуральном или переработанном виде, полученные из генетически модифицированных организмов или содержащие их в своем составе.

3.3    генетически модифицированный организм: Организм, генетический материал которого изменен с применением методов генной инженерии.

3.4    генная инженерия: Совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных нуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.

3.5    биологический микрочип: Микроматрица с ячейками, в которых иммобилизован набор олигонуклеотидов.

3.6    праймер: Последовательность однотяжевой ДНК длиной до 25 нуклеотидов, применяемая для проведения асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции.

3.7    асимметричная мультиплексная полимеразная цепная реакция: Полимеразная цепная реакция, где в одной пробирке с участием нескольких пар праймеров одновременно амплифицируют-ся разные последовательности анализируемой ДНК, причем количество одного из праймеров каждой пары в несколько раз превышает количество другого праймера.

4    Аппаратура, материалы и реактивы

4.1    Компьютерная программа «Imageware» для анализа изображений, полученных с помощью «Чипдетектора-03» [1] или «Био-1» [23].

4.2    Комплекс аппаратно-программный для анализа флуоресценции биологических микрочипов типа «Чипдетектор-03» [2] или «Евробио-ВТО» [24].

4.3    Амплификатор ДНК типа «Терцик» под микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2; 0,5 см³ со скоростью нагрева/охпаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с [3].

4.4    Термостат суховоздушный типа ТВЗ-25 с рабочей температурой 37 °С, рабочий диапазон от 20 °С до 60 °С, точность поддержания температуры ± 1 °С [4].

4.5    Весы лабораторные по ГОСТ 24104 высокого класса точности (условное обозначение (П) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ± 0,0001 г.

4.6    Камера морозильная по ГОСТ 26678, обеспечивающая температуру минус 20 °С.

4.7    Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.

4.8    Микроцентрифуга настольная типа 5415С с частотой вращения не менее 13000 мин"¹ [5].

4.9    Мешалка магнитная с подогревом [6].

4.10    Аппарат для встряхивания типа СУ-1500 с частотой вращения не менее 1500 мин'¹ [7].

4.11    pH-метр с набором электродов, с погрешностью измерений + 0,1 pH.

4.12    Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5 - 10,0 мм³ (шаг 0,1 мм³, точность + 2,5 % - 10 %, воспроизводимость 3 % - 7 %); 5,0 - 50,0 мм³ (шаг 0,5 мм³, точность 2,0 % - 5,0 %, воспроизводимость 2,5 % - 5 %); 20,0 - 200,0 мм³ (шаг 1,0 мм³, точность + 1,5 % - 2,0 %, воспроизводимость 2 % - 3 %); 100 - 1000 мм³ (шаг 5 мм³, точность ± 1,0 % -1,5 %, воспроизводимость 1 % - 2 %).

СТБ ГОСТ Р 52174-2005

4.13    Штативы под микроцентрифужные пробирки типа RP-30 и RP-80 на 30 и 80 шт. [8].

4.14    Наконечники с фильтром для микродозаторов (микропипеток) с переменным объемом дозирования жидкостей до 10; 20; 200; 1000 мм¹ [9].

4.15    Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5 и 1,5 см³ стерильные.

4.16    Пестик или палочка стеклянные по ГОСТ 21400 для микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см¹.

4.17    Цилиндры стеклянные мерные лабораторные по ГОСТ 1770 на 25, 100, 250 и 1000 см³.

4.18    Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические по ГОСТ 25336 вместимостью 50 -1000 см¹.

4.19    Пипетки стеклянные градуированные по ГОСТ 29227.

4.20    Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

4.21    Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

4.22    Кислота соляная концентрированная по ГОСТ 3118, х.ч.

4.23    Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.

4.24    Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль дигидрат (ЭДТА) [10].

4.25    Трис(оксиметил)аминометан [11].

4.26    Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х.ч.

4.27    Спирт изопропиловый по ГОСТ 9805, х.ч.

4.28    Додецилсульфат натрия (SDS) [12].

4.29    Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

4.30    Вода особо чистая стерильная, не содержащая ДНК, РНК и дезоксирибонуклеаз.

4.31    Фермент термостабильный Taq-полимераза, оптимум активности при 70 °С - 72 °С [13].

4.32    ПЦР буфер десятикратный (10х; 12,1 г в 1 дм³ Трис-HCL, pH 8,8; 37,28 г в 1 дм¹ KCL, 5 % Твин-20, 50 % формамид; 142,83 мг в 1 дм¹ МдС1_₂).

4.33    Гуанидин тиоцианат [14].

4.34    Ы-[2-оксиэтил]пиперазин-Ы'-[2-этансульфоновая кислота] (HEPES) [15].

4.35    Масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164.

4.36    Раствор водный дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: дАТФ, дТТФ, дТТФ, дЦТФ с концентрацией 2 мМ каждого [16].

4.37    Раствор заведомо трансгенной ДНК (около 100 нг/мм³ или 10⁶ копий/мм¹) [17].

4.38    Раствор заведомо нетрансгенной ДНК (около 100 нг/мм¹ или 10⁶ копий/мм¹) [18].

4.39    Баня водяная [19].

4.40    Раствор водный праймеров «ПР-1» для амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров:

праймеры на промотор 35S вируса мозаики цветной капусты:

35S_n    5' ССТ ССТ CGG ATT CCA TTG ССС AG    (23 н.о.)

35Б_оф    5' GTC CAT СТТ TGG GAC САС TGT CGG    (24 н.о.)

праймеры на маркерный ген gus из бактерии Eschrichia соИ:

gus_n    5' AAG CCG GGC ААТ TGC TGT GCC А    (22 н.о.)

gus_оф    5' GAC CGC АТС GAA ACG CAG САС G    (22    н.о.)

праймеры на промотор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

nos_п    5' CGA TGA CGC GGG АСА AGC CGT    (21    и.о.)

nos_odp    5'GAC CTT AGG CGA CTT TTG AAC GCG С (25 н.о.)

праймеры на маркерный ген nptll из транспазона Тп5 бактериального происхождения:

npt_n    5' GTG ТТС CGG CTG ТСА GCG CAG G    (22    н.о.)

лр/_оф    5' CGC AAG GAA CGC CCG TCG TGG    (21    н.о.)

праймеры на терминатор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

ocs_n    5'GCG AGA CGC СТА TGA TCG CAT GAT    (24 н.о.)

осз_оф    5'GAA ACC GGC GGT AAG GAT CTG AGC    (24 н.о.)

Примечание - В обозначениях праймеров индекс «_п» означает «прямой», индекс «_оф» означает «обратный флуоресцентно меченый»; н.о. - нуклеотидные остатки [20].

Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами, приведенными в таблице 1 [21]:

Окончание таблицы 1

Наименование олигонуклеотида Детектируемая мишень Назначение олигонуклеотида Lel(Gm) Ген лектина (LEI) Специфичный зонд для идентификации ДНК сои Zein(Zm) Ген IVR1 Специфичный зонд для идентификации ДНК кукурузы UDP-GP(St) Ген фосфорилазы УДФ-глюкозы Специфичный зонд для идентификации ДНК картофеля SPS (Os) Ген фосфат-синтазы риса Специфичный зонд для идентификации ДНК риса nptll Ген npt Специфичный зонд для идентификации маркерного гена nptll из транспозона Тп5 35S_p CAMV Промотор 35S Специфичный зонд для идентификации 35S промотора вируса мозаики цветной капусты 35S_p FMV Промотор FMV Специфичный зонд для идентификации 35S FMV промотора каулимовируса мозаики норичника Act1_p Ген актина АСТ1 Специфичный зонд для идентификации промотора гена актина риса Gus Ген gus Специфичный зонд для идентификации маркерного гена gus nos_t Терминатор nos Специфичный зонд для идентификации терминатора nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens 35S_t CAMV Терминатор 35S Специфичный зонд для идентификации 35S терминатора вируса мозаики цветной капусты rbcSt Терминатор гена RBCS Специфичный зонд для идентификации терминатора гена RBCS гороха Ocs_t Терминатор Ocs Специфичный зонд для идентификации терминатора ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens Bar Ген BAR Специфичный зонд для идентификации маркерного гена BAR

Рисунок 1 - Схема биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения

Обозначение ячеек приведено в соответствии с назначением иммобилизованного в ней зонда, указанного в таблице 1.

Биологический микрочип представляет собой пластиковую подложку, выполненную в формате предметного стекла по ГОСТ 9284, на поверхности которой в определенном порядке расположена 31 ячейка полиакриламидного геля в форме полусферы диаметром 100 мкм (обозначены кружками на рисунке 1). 22 из них содержат индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид (перечень и назначение олигонуклеотидов приведены в таблице 1). Пять ячеек с индексом 0 не содержат перечисленных индивидуальных ковалентно иммобилизованных олигонуклеотидов и выполняют роль отрицательного контроля гибридизации. Четыре ячейки с индексом М содержат ковалентно связанный флуоресцентный краситель и предназначены для автоматического вычисления интенсив- ²

Таблица 1 - Олигонуклеотиды, иммобилизованные на биологическом микрочипе

Наименование олигонуклеотида Детектируемая мишень Последовательность лигонуклеотида 35S_n Промотор 35S 5' GCC АТС ATT GCG АТА AAG G gus_ и Ген gus 5' CTG GTA ТСА GCG CGA А nos_n Промкатор nos 5' GCT AAG САС АТА CGT CAG АА npt_v\ Ген nptll 5' GGC AGC GCG GCT АТС ocs_ и Терминатор ocs 5' ТТС TGT TGT GCA CGT TGT А Примечание - Индекс «_и» означает «иммобилизованный».

1 - предметное стекло;

2 - гелевые ячейки

Рисунок 1 - Схема биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения

Биологический микрочип представляет собой стандартное стекло предметное по ГОСТ 9284 для световой микроскопии, на поверхности которого в определенном порядке расположены 10 микроскопических ячеек (рисунок 1), заполненные полиакриламидным гелем. Каждая из пяти верхних ячеек содержит индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид (35S, gus, nos, npt или ocs). Три ячейки с индексом «НК» не содержат ранее перечисленных индивидуальных ковалентно иммобилизованных олигонуклеотидов и выполняют роль отрицательного контроля гибридизации. Две ячейки с индексом «М» содержат ковалентно связанный флуоресцентный краситель и предназначены для однозначной ориентации биологического микрочипа. Поверхность биологического микрочипа с ячейками должна быть закрыта пластиковой крышкой с отверстиями, которая вместе с предметным стеклом образует замкнутое пространство, предназначенное для проведения гибридизации анализируемой пробы.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

5 Отбор проб

Отбор проб проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевого сырья (в том числе посевного и посадочного материала), пищевых продуктов, цветов.

(Продолжение изменения № 1 к СТБ ГОСТ Р 52174-2005)

ности флуоресценции ячеек биологического микрочипа после гибридизации. Поверхность биологического микрочипа должна быть закрыта специальной составной крышкой с отверстиями, которая вместе с подложкой образует гибридизационную камеру, предназначенную для проведения реакции гибридизации анализируемых ПЦР-продуктов с иммобилизованными на биологическом микрочипе олигонуклеотидами и исключающую возможность испарения реакционной смеси в процессе гибридизации. Диагностическая специфичность при идентификации растительной ДНК сои, картофеля, кукурузы, риса составляет не менее 95 %.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не хуже вышеуказанных.».

Пункт 6.1.2. Заменить значения и слова: «186,12 г/дм³» на «74,4 г/дм³», «18,61 г» на «7,44 г», «гидроокиси натрия» на «ЫаОН».

Пункты 6.1.4-6.1.9 изложить в новой редакции:

«6.1.4 Приготовление раствора Трис-HCI массовой концентрации 242,2 г/дм³

В колбу вместимостью 100 см³ помещают 24,22 г трис(оксиметил)аминометана по 4.25 [10] и растворяют приблизительно в 80 см³ особо чистой стерильной воды. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят pH раствора до 7,5 ед. pH, а объем - до 100 см³ особо чистой стерильной водой.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 6 мес.

6.1.5    Приготовление раствора NaCI массовой концентрации 146,2 г/дм³

В плоскодонную колбу вместимостью 100 см³ помещают 14,62 г хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в 70-80 см³ особо чистой стерильной воды, затем полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и особо чистой стерильной водой доводят объем раствора до метки.

Срок хранения при комнатной температуре - не более одного года.

6.1.6    Приготовление ЦТАБ-буфера

В стеклянную колбу вместимостью 100 см³ помещают 2,0 г сухого цетилтриметиламмония бромида по 4.28 [11], далее добавляют 5 см³ раствора Трис-HCI, приготовленного по 6.1, 4,56 см³ раствора NaCI, приготовленного по 6.1.5, и 10 см³ раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.2. Объем раствора доводят до 100 см³ особо чистой стерильной водой. Перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения соли.

Срок хранения при комнатной температуре - не более одного года.

6.1.7    Приготовление ЦТАБ-раствора

В стеклянную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,5 г сухого цетилтриметиламмония бромида по 4.28 [11] и добавляют 1,6 см³ раствора NaCI, приготовленного по 6.1.5. Объем раствора доводят до 100 см³ особо чистой стерильной водой.

Срок хранения при температуре 4 °С - 5 °С - не более месяца, в морозильной камере по ГОСТ 26678 при температуре минус 20 °С - до одного года.

6.1.8    Приготовление разведенного раствора NaCI

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 48 см³ раствора NaCI, приготовленного по 6.1.5, и особо чистой стерильной водой доводят объем раствора до метки.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 6 мес.

6.1.9    Раствор Taq-полимеразы по 4.31 хранят при температуре минус 20 °С не более шести месяцев. Не допускается хранение раствора Taq-полимеразы ниже температуры минус 23 °С.».

Пункты 6.2.1-6.2.6 изложить в новой редакции:

«6.2.1 Две параллельные пробы анализируемого продукта массой около 100 мг каждая помещают в две чистые стерильные микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см³ по 4.15, добавляют по 500 мм³ ЦТАБ-буфера, приготовленного по 6.1.6, перемешивают на аппарате для встряхивания по 4.10 [6] в течение 2 мин и выдерживают 15-20 мин при температуре 65 °С в термостате для микропробирок.

6.2.2    Микроцентрифужные пробирки со смесью, приготовленной по 6.2.1, центрифугируют при комнатной температуре в настольной центрифуге по 4.8 [4] при частоте вращения 13 000 мин^-1 в течение 10 мин.

6.2.3    Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.2, отбирают микродозатором (обычно по 500 мм³) и переносят в чистые микроцентрифужные пробирки, добавляют равный объем хлороформа по ГОСТ 20015. Содержимое перемешивают на аппарате для встряхивания в течение 2 мин и центрифугируют 10 мин при частоте вращения 13 000 мин¹.

6.2.4Верхнюю жидкую фазу из смеси, полученной по 6.2.3, аккуратно отбирают микродозатором в чистые микроцентрифужные пробирки, не захватывая промежуточную или нижнюю фазу. В пробир-

4

(Продолжение изменения № 1 к СТБ ГОСТ Р 52174-2005)

ки добавляют два объема ЦТАБ-раствора, приготовленного по 6.1.7, аккуратно перемешивают, переворачивая пробирки вручную, и выдерживают 60 мин при комнатной температуре.

6.2.5    Смесь, полученную по 6.2.4, центрифугируют 5 мин при частоте вращения 13 000 мин^-1. Надосадочную жидкость тщательно удаляют микродозатором, а осадок растворяют в 350-600 мм³ (в зависимости от объема осадка) разведенного раствора NaCI, приготовленного по 6.1.8, добавляют равный объем хлороформа по ГОСТ 20015, перемешивают на аппарате для встряхивания в течение 30 с и центрифугируют 10 мин при частоте вращения 13 000 мин^-1.

6.2.6    Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.5, отбирают микродозатором и переносят в чистые микроцентрифужные пробирки, добавляют равный объем изопропилового спирта по 4.27, аккуратно перемешивают содержимое пробирок вручную и выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре.».

Подраздел 6.2 дополнить пунктами 6.2.7-6.2.9:

«6.2.7 Смесь, полученную по 6.2.6, центрифугируют 10 мин при частоте вращения 13 000 мин¹, надосадочную жидкость аккуратно сливают, а к осадку ДНК добавляют 1 см³ 70%-ного этилового спирта, приготовленного по 6.1.3 и охлажденного до температуры 0 °С - 4 °С, перемешивают и центрифугируют 5 мин при частоте вращения 13 000 мин^-1.

6.2.8    Полученную надосадочную жидкость вновь тщательно удаляют, а осадок ДНК подсушивают при комнатной температуре до полного удаления этилового спирта, но не более 30 мин.

6.2.9    Осадок ДНК, полученный по 6.2.8, перерастворяют в 40-50 мм³ особо чистой стерильной воды. Полученный раствор ДНК используют для проведения амПЦР.

Срок хранения раствора ДНК при температуре минус 20 °С - до одного года.».

Пункт 6.3.1.1 изложить в новой редакции:

«6.3.1.1 Готовят две микроцентрифужные пробирки вместимостью по 1,5 см³ и маркируют ихМ1 и

М2.

В пробирку М1 микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 2,5 мм³ десятикратного буфера реакционного для ПЦР по 4.32; 2,5 мм³ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфа-тов по 4.35 [14], 2 мм³ фермента Taq-полимеразы по 4.31 [12] (концентрацией 5 ед. акт./мм³) *, 1 мм³ флуоресцентного субстрата ФС по 4.36 [15], а также 1 мм³ водного раствора праймеров ПР-1 по 4.40 [19].

В пробирку М2 микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 2,5 мм³ десятикратного буфера реакционного для ПЦР по 4.32; 2,5 мм³ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфа-тов по 4.35 [14], 2 мм³ фермента Taq-полимеразы по 4.31 [12] (концентрацией 5 ед. акт./мм³) *, 1 мм³ флуоресцентного субстрата ФС по 4.36 [15], а также 1 мм³ водного раствора праймеров ПР-2 по 4.41 [20].

Смесь разбавляют особо чистой стерильной водой до объема 20 мм³ (из расчета на одну анализируемую пробу) и осторожно перемешивают в течение 3-5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены. Общий объем реакционных смесей в микропробирках М1 и М2 для амПЦР готовят с учетом числа анализируемых проб и двух контрольных проб: положительный контроль (заведомо трансгенная ДНК по 4.37) и отрицательный контроль (заведомо нетрансгенная ДНК по 4.38).».

Пункты 7.1.1-7.1.4 изложить в новой редакции:

«7.1.1 Для каждой анализируемой пробы готовят две чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2 или 0,5 см³, маркируя их Ni и N2, где N - номер анализируемой пробы.

7.1.2    Реакционные смеси для амПЦР М1 и М2, полученные по 6.3.1.1-6.3.1.2, микродозатором вносят в микроцентрифужные пробирки по 20 мм³ в каждую таким образом, чтобы смесь М1 была распределена по пробиркам с индексом N1, а смесь М2 - по пробиркам с индексом N2.

7.1.3    Анализируемую ДНК пробы N, выделенную по 6.2, вносят микродозатором по 5 мм³ в микроцентрифужные пробирки с реакционной смесью для амПЦР по 7.1.2, маркированные N1 и N2 соответственно. При использовании амплификатора ДНК [2] без подогрева крышки в каждую микроцентри-фужную пробирку с реакционной смесью вносят по 30 мм³ вазелинового масла по ГОСТ 3164 для предохранения реакционной смеси от испарения водной фазы при амПЦР. В этом случае анализируемую ДНК вносят под слой масла, в результате чего образуются водная и масляная фазы.

7.1.4    В две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 5 мм³ раствора заведомо трансгенной ДНК (положительный контроль).».

Подраздел 7.1 дополнить пунктами 7.1.5, 7.1.6:

7.1.5    Затем еще в две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 5 мм³ раствора заведомо нетрансгенной ДНК (отрицательный контроль).

7.1.6    Все микроцентрифужные пробирки со смесями, подготовленными по 7.1.3-7.1.5, помещают в амплификатор ДНК и проводят амПЦР по программе, указанной в таблице 2.

* Срокхранения Taq-полимеразы после разведения при температуре от 2 °С до 8 °С - не более 2 ч.

5

Таблица 2 - Программа проведения амПЦР

Шаг программы Температура, °С Время инкубации Число циклов 1 95 12 мин 1 2 95 30 с 55 51 30 с 72 30 с 3 72 10 мин 1».

Подраздел 7.2 изложить в новой редакции:

«7.2 Гибридизация на биологическом микрочипе

7.2.1    Для проведения этапа гибридизации готовят N + 2 микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,5 или 1,5 см³ (N - количество анализируемых проб, две другие пробирки нужны для анализа положительного и отрицательного контроля).

7.2.2    В необходимое количество микроцентрифужных пробирок микродозатором вносят по 18 мм³ гибридизационного буфера по 4.33 [13]. К гибридизационному буферу в пробирку N добавляют по 9 мм³ водной фазы ПЦР-смесей из пробирок Ni и N2, полученных в результате проведения амПЦР по 7.1.6, и перемешивают в течение 20-30 с на аппарате для встряхивания по 4.10 с частотой вращения не менее 1 500 мин^-1 для получения гибридизационной смеси.

7.2.3    Из каждой микроцентрифужной пробирки микродозатором отбирают по 34 мм³ гибридизационной смеси (для каждого биологического микрочипа), полученной по 7.2.2. Смесь вносят через любое из двух отверстий гибридизационной камеры, после чего оба отверстия закрывают крышкой. Гибридизацию проводят в термостате по 4.4 [3] при температуре 37 °С. Минимальное время гибридизации составляет 3 ч. Допускается гибридизация в течение ночи, но не более 16-18 ч.

7.2.4    После окончания гибридизации крышку реакционной камеры открывают и микродозатором отбирают гибридизационную смесь из камеры микрочипа. В любое из двух отверстий камеры вносят 34 мм³ дистиллированной воды по ГОСТ 6709, предварительно прогретой до температуры 37 °С. Воду выдерживают в реакционной камере биологического микрочипа в течение 1 мин, затем отбирают. Процедуру повторяют, после чего составную крышку отсоединяют от подложки. Подложку последовательно промывают дистиллированной водой по ГОСТ 6709, этиловым спиртом по 4.26, дистиллированной водой по ГОСТ 6709 и высушивают при комнатной температуре.

Схема метода идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения приведена в приложении Б.».

Раздел 8 изложить в новой редакции:

«8 Обработка и интерпретация результатов анализа

8.1    Результаты гибридизации регистрируют с помощью УАПК [1]. Инсталляция и эксплуатация комплекса осуществляется в соответствии с руководством по эксплуатации УАПК.

8.2    Производят запуск программного обеспечения, поставляемого вместе с комплексом (файл imageware.exe). При запуске на мониторе появляется схема биочипа с указанием отдельных ячеек и обозначением находящихся в них зондов. Названия зондов соответствуют указанным в таблице 1 и на рисунке 1.

8.3    Биологический микрочип после проведения гибридизации, промывки, удаления гибридизационной камеры, ополаскивания и высушивания помещают в держатель УАПК лицевой стороной (содержащей гелевые ячейки) вверх.

8.4    Нажимают пиктограмму с надписью «Пуск» в верхней части диалогового окна «Снимок». При этом происходит возбуждение флуоресценции ячеек биочипа лазерами с длиной волны 640 нм, захват флуоресцентного изображения, его обработка и выдача отчета о присутствии в исследуемом образце ДНК растительного происхождения, идентификации видоспецифичной ДНК (соя, кукуруза, картофель, рис) и наличии/отсутствии генетических элементов, используемых как детерминанты трансгенности. Применение УАПК для анализа биологических микрочипов [1] позволяет автоматизировать все этапы регистрации и интерпретации результатов и получать заключение о наличии/отсутствии ДНК растительного происхождения в исследуемом образце, а также о наличии/отсутствии генетических детерминант трансгенности.

8.5    Анализ биологических микрочипов с прогибридизованными ПЦР-продуктами, полученными при амплификации ДНК, выделенной из различных образцов, начинают с регистрации и интерпретации гибридизационных картин положительного (заведомо трансгенной ДНК) и отрицательного контроля (заведомо нетрансгенной ДНК).

6

8.6    Результат анализа ДНК сои, содержащей трансгенные элементы, с использованием гибридизации на биочипе, представлен в приложении В.

8.7    В случае если при использовании заведомо нетрансгенной ДНК регистрируют сигнал в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям фрагментов векторных конструкций и маркерных генов, это свидетельствует о получении ложноположительного результата. При этом результаты анализа остальных исследуемых образцов не учитываются. Причиной может быть загрязнение (контаминация) ГМИ реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором соляной кислоты по ГОСТ 3118 (0,1 моль/дм³), заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. В случае отсутствия сигналов в ячейках, содержащих зонды, специфичные к различным генетическим детерминантам трансгенности, при использовании заведомо нетрансгенной ДНК делают заключение об отсутствии контаминации и проводят анализ образцов ДНК согласно протоколу.

8.8    Отсутствие флуоресцентных сигналов в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к гену RBCL, при использовании нетрансгенной растительной ДНК свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. При этом результаты анализа остальных исследуемых образцов не учитываются. Причиной может быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР или несоблюдение условий проведения амПЦР и (или) гибридизации на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. Наличие сигнала в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к ДНК растительного происхождения, при использовании заведомо нетрансгенной ДНК свидетельствует об эффективно проведенной амПЦР и гибридизации на биочипе. При этом анализ образцов ДНК проводят далее согласно протоколу.».

7

(Продолжение изменения № 1 к СТБ ГОСТ Р 52174-2005)

Приложение В изложить в новой редакции:

«Приложение В

(обязательное)

Результат анализа ДНК сои, содержащей трансгенные элементы, с использованием гибридизации на биологическом микрочипе (флуоресцентная картина гибридизации, полученная в результате анализа ДНК генетически модифицированной сои, и распределение нормированных сигналов ячеек биологического микрочипа)

м		0 0.38		M
pIDNA	Gm/Stl	Zml	Osl	Stl
(rbcL)	(rbcL)	(rbcL)	(rbcL)	(rbcL)
8,43	10.31	1.87	0.35	0.37
pIDNA	Gm2	Zm'OsZ	St2	n
(rbcL)	(rbcL)	(rbcL)	(rbcL)	и
8,50	9.73	0.43	0,28	0,33
	Lei	Zetn	UDP-GP	SPS
u	(Gw)	iZm)	(St)	(Os)
0.24	6.72	0.51	0,49	0.46
nptli	35S p	35S p	Acff j>	Gus
	CaMV	FMV
0 54	7.88	0,51	0,43	0,53
nos I	35S f	0	rtxSl	Ocs 1
	CaMV
5.50	0.61	0.42	0.48	0.59
M		Bar		M
		0.39

A - схема биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированного источника

растительного происхождения;

Б - гибридизационная картина на биологическом микрочипе флуоресцентных продуктов амПЦР анализируемой ДНК сои, содержащей ЭбБ-промотор, терминатор nos. Стрелками обозначены ячейки, в которых образовались совершенные гибридизационные дуплексы;

В - распределение нормированных сигналов ячеек биологического микрочипа. Жирным шрифтом выделены ячейки, в которых образовались совершенные гибридизационные дуплексы

Рисунок В.1».

9

Приложение Г изложить в новой редакции:

«Приложение Г

(рекомендуемое)

Пример оформления протокола испытаний

наименование организации (испытательная лаборатория)

ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ

№_от    «_»_20_г.

Дата поступления на испытания «_»_20_г.

Дата окончания испытаний «_»_20_г.

Продукция: Котлеты «Московские»

Производитель сырья или продукции: ООО «Вымпел»

Предъявитель сырья или продукции: Орган сертификации «Биотест-М»

Отбор проб произведен по ГОСТ 11856-89

в соответствии с нормативным документом на соответствующую однородную группу сырья или продукции Акт отбора проб и техническое задание на испытания № 118 от 08.02.2013 Испытания проведены на основании требований ГОСТ Р 52174-2003 Номер образца: 6/кс, 7/кс, 8/кс и 9/кс

Характеристика испытуемого образца (маркировка, вид и состояние упаковки, этикетки, штриховка): Маркировка на упаковке, информирующая о наличии в продукте ГМИ, в образцах № 6/кс, 7/кс и 8/кс отсутствует, а в образце N° 9/кс присутствует.

Маркировка:_

Годен до: _-_ Штриховой    код: _-_

Результаты испытаний

Таблица 1 - Нетрансгенные видоспецифичные последовательности

Последовательности Номер образца 6/кс 7/кс 8/кс 9/кс При наличии Ген RBCL + + + + GM/STKRBCL) + + + + ZMKRBCL) - - - - OSKRBCL) - - - - STb(RBCL) + + - - GM2(RBCL) - - + + ZM/OS2(RBCL) - - - - ST2(RBCL) + + - - Le1(Gm) - - + + Zein(Zm) - - - - UDP-GP (St) + + - - SPS (Os) - - - -

Результат анализа: В образцах 7/кс и 9/кс обнаружены следующие растительные компоненты: в образцах 6/кс и 7/кс обнаружено присутствие ДНК сои, а в образцах 8/кс и 9/кс - присутствие ДНК картофеля.

1

2