Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств касугамицина в капусте, томатах и томатном соке, плодах и соке яблок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием

Методические указания МУК 4.1.3514—17

Издание официальное

Москва *2018

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств касугамицина в капусте, томатах и томатном соке, плодах и соке яблок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием

Методические указания МУК 4.1.3514—17

ботки данных определяют соотношение площадей пиков для касугами-цина, соответствующих MRM (380—► 112) и MRM (380—>70) (S112/S70).

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика-концентрация касугамицина в растворе) в хроматограф вводят по 3 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади лика от концентрации касугамицина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С= КS, где

S- площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

IC-CJ ^--100 £ А»»,. > где

С - аттестованное значение массовой концентрации касугамицина в градуировочном растворе;

С_к - результат контрольного измерения массовой конценпрации касугамицина в градуировочном растворе;

Контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (Контр. * 10 % при /> = 0,95).

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб проводится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№2051—79 от 21.08.79). Пробы капусты отбирают в соответствии с ГОСТ 1724-85 «Капуста белокочанная свежая, заготовляемая и поставляемая. Технические условия (с Изменениями № 1— 4)»; томатов - в соответсгвии с ГОСТ 1725-85 «Томаты свежие. Технические условия»; яблок - в соответствии с ГОСТ 27572-87 «Яблоки

свежие для промышленной переработки». Пробы капусты, томатов и томатного сока, яблок и яблочного сока хранят до анализа в герметичной таре в морозильной камере при температуре не выше -18 °С, сок хранят в холодильнике при температуре 0—4 °С в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

9. Проведение определении

9. /. Определение касугалшцина в капусте, томатах и томатном соке, плодах и соке яблок Навеску измельченной матрицы или сока 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ и добавляют 40 см³ 1%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. Измеряют объем полученного экстракта с помощью мерного цилиндра (V_0Kcmp). От верхнего слоя отбирают 1 см³ и переносят в градуированные пробирки вместимостью 10 см³. Добавляют 1%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле до объема (100/К*^), соответствующего содержанию матрицы 0,1 г в 1 см³, и фильтруют через фильтр в виалы для хроматографирования. Виалы помещают в автосамплер хроматографа для анализа методом ВЭЖХ-МС по п. 9.2.

9.2. Условия хроматографирования

9.2.1. Хроматографические условия измерений Хромато-масс-спектрометр, состоящий из высокоэффективного жидкостного хроматографа и масс-спектрометра с тройным квадрупо-лсм.

Аналитическая колонка с обращенной фазой, ионными группами и длинной гидрофобной цепью (150 х 2,1 мм), 5 мкм. Температура колонки (45 ± 1) °С. Скорость потока элюента 0,2 см³/мин. Объем вводимой пробы 3 мм³. Время удерживания касугамицина - (6,9 ± 0,2) мин.

Режим элюирования - градиентный:    _

9.2.2. Масс-спектрометрические условия измерений

Тип ионного источника HES1 (электроспрей) Режим сканирования Мониторинг заданных реакций (MRM) 380—*200 (количественный) 380-*112 (подтверждающий) 380—>70 (подтверждающий) Параметры работы ионного источника Напряжение на источнике, V 3 500, положительная полярность Температура конуса, °С 250 Скорость потока газа из конуса, дм3/мин 20 Скорость потока распыляющего газа, дм3/мин 30 Температура осушающего i-аза, °С 300 Скорость потока осушающего газа, дм3/мин 30

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание касугамицина в пробе (Х> мг/кг) вычисляют по формуле:

Р

S_x - площадь пика касугамицина на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

/-полнота извлечения касугамицина, приведенная в табл. 2, %;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³ (1 см³);

Р - навеска анализируемого образца, г (аликвота, равная 0,1 г).

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор касугамицина с концентрацией 0,05 мкг/см³, разбавляют 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

Х_/у Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг; г - значение предела повторяемости (г = 2,8 х а_г).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X ± А) мг/кг при вероятности Р = 0,95, где X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

А - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

S - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат аначиза представляют в виде:

«содержание вещества с пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,05 мг/кг*, где * - 0,05 мг/кг - предел определения касугамицина в капусте).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1.    Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2.    Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода «добавок».

Величина добавки Q должна удовлетворять условию:

±Д_лЛ. (±Д_л<г,) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

А_л = ± 0,84 А, где А - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

S - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к=Х'-Х-С_д, где

X*у Ху Сд - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

А' = 7д^,+д^

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

\К\ <Ку    (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (/?):

Определение остаточных количеств касугамицина в капусте, томатах и томатном соке, плодах и соке яблок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-снсктрометрическим детектированием

Методические указания МУК 4.1.3514—17

Редактор Л. С. Кучурова Компьютерная верстка Е. В. Ломановой

Подписано в печать 02.11.18 Формат 60x88/16    Печ.    л.    1,0

Т ираж 150 экз.    Заказ    54

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Банковский пер., д. 18, стр. 5,7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован Федеральным центром гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Реализация печатных изданий, телефакс: 8 (495) 952-50-89

ББК51.23

0-60

0-60 Определение остаточных количеств касугамицина в капусте, томатах и томатном соке, плодах и соке яблок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием: Методические указания.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2018.—15 с.

ISBN 978-5-7508-1645-3

1.    Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» (В. И. Долженко, А. С. Комарова) и ООО «Инновационный центр защиты растений» (И. А. Цибульская, Т. Д. Черменская), Санкт-Петербург, Пушкин.

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и блаюполучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. № I).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 29 декабря 2017 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.23

ISBN 978-5-7508-1645-3

© Роспотребнадзор, 2018

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

29 декабря 2017 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств касугамицина в капусте, томатах и томатном соке, плодах и соке яблок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием

Методические указания __МУК    4.13514—17_

Свидетельство об аттестации методики (метода) измерений № 88-16207-035-RA.RU.310657-2017.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием для определения массовой концентрации касугамицина в капусте, томатах и томатном соке, плодах и соке яблок в диапазоне концентраций 0,05—0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Касугамицин гидрохлорид

[5-амино-2-метил-6-(23.4,5,6-петагидроксициклогексилокси)тетра-гидропиран-3-ил]амино-а-иминоуксусная кислота гидрохлорид (ШРАС).

Структурная формула:

NH

^HV" NH

Эмпирическая формула: C14H25N3O9X HC1.

Молекулярная масса: 415,8.

Химически чистое вещество представляет сталлическое вещество. Температура плавления: 202—-204 °С. Давление пара при 25 °С: < 1,3 х 10'² МПа.

Растворимость (в г/дм³ при 25 °С): вода - 125, метанол - 0,003, в ацетоне и ксилоле < 0,001.

Стабилен при комнатной температуре. Стабилен в слабых кислотах и нестабилен в сильных кислотах и щелочах. DT₅₀ (50 °С): 47 дней (pH 5), 14 дней (pH 9).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс более 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD50 для кроликов более 2 000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенными и тератогенными свойствами, не влияет на репродукцию крыс.

Область применения препарата. Системный фунгицид и бактерицид, получаемый ферментацией Streptomyces kasugaensis. Используется для контроля грибных и бактериальных заболеваний на рисе, овощных и плодовых культурах. Не фитотоксичен для риса, томатов, сахарной свеклы, картофеля и др.

В России для касугамицина гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1 Метрологические параметры

Анализи руемый объект Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Показатель точности* (границы относительной погрешности (Р = 0,95), ± £ % Показатель повторяемости (относительное средне-квадратическое отклонение повторяемости), <х„ % Показатель воспроизводимости (относительное средне-квадратическое отклонение воспроизводимости), о*, % Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), г, % Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях), /?,% (Р = 0,95) Капуста 0,05—0,5 25 10 12,5 28 36 Томаты 0,05—0,5 25 10 12,5 28 36 Томатный сок 0,05—0,5 25 10 12,5 28 36 Яблоки 0,05—0,5 25 10 12,5 28 36 Яблочный сок 0,05—0,5 25 10 12,5 28 36 * Соответствует расширенной неопределенности U„„K (в относительных единицах) при коэффициенте охвата к- 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (п = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения касугамицина, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для п = 20, Р- 0,95

Анализи руемый объект	Предел определения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/дм3)	Полнота извлечения, %	Стандартное отклонение, S	Доверительный интервал среднего результата, ± %
Капуста	0,05	0,05—0,5	91,3	8,21	3,59
Томаты	0,05	0,05—0,5	94,7	6,54	2,87
Томатный сок	0,05	0,05—0,5	94,6	7,24	3,17
Яблоки	0,05	0,05—0,5	94,9	5,64	2,47
Яблочный сок	0,05	0,05—0,5	90,2	6,07	2,66

2. Метод измерений

Метод основан на определении касугамицина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием масс-спектрометрического детектора после извлечения из образцов подкисленным метанолом.

Идентификация касугамицина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства н материалы

3.1. Средства измерений Хромато-масс-спектрометр, состоящий из:

-    высокоэффективного жидкостного хроматографа;

-    масс-спектрометра с тройным квадруполем Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 150 г, предел допустимой погрешности 5 мг Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 81/210 г, предел допустимой погрешности 0,1/0,3 мг Дозаторы пипеточные переменного объема от 10 до 100 мм³ и от 100 до 1 000 мм³ Колбы мерные на 100, 500 и 1 000 см³ Цилиндры мерные на 50 и 100 см³

Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы Ацетонитрил для масс-спектрометрии Вода для лабораторного анализа (бидистил-

лированная деионизованная)    ГОСТ    Р    52501—05

Кислота муравьиная для масс-спектрометрии Кислота муравьиная, хч    ГОСТ 5848-73

Касугамицин гидрохлорид, аналитический стандарт с содержанием д.в. 98,2 %

Метанол, хч

Примечание. Допускается использование других реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очист ки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы Аналитическая колонка с обращенной фазой, ионными группами и длинной гидрофобной цепью (150 х 2,1 мм), зернением 5 мкм Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 см³

Пробирки градуированные объемом 10 см³    ГОСТ 19808-86

Устройство перемешивающее (50—200 колебаний в минуту)    ТУ 4389-007-44330709—11

Фильтры мембранные для фильтрации проб с помощью шприца, диаметр 25 мм, размер пор 0,2 мкм

Центрифуга со скоростью вращения 4 000 об./мин

Шприцы медицинские одноразовые вместимостью 5 см³

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2.    Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточновытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313—03 и ГН 2.2.5.2308—07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3.    При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности «Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых

используется оборудование, работающее под избыточным давлением» (утв. приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 №116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

-    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

-    выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,2—0,3 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1.    Приготовление компонентов подвижной фазы для ВЭЖХ

Компонент А - раствор 0,5%-й (по объему) муравьиной кислоты в

воде. В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 300—400 см³ бидистиллированной воды, вносят 5,0 см³ муравьиной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

Компонент В - раствор 0,5%-й (по объему) муравьиной кислоты в метаноле. В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 300— 400 см³ метанола, вносят 5,0 см³ муравьиной кислоты, доводят метанолом до метки, перемешивают.

7.2.2.    Раствор для экстракции и приготовления растворов - 1%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле: 10 см³ муравьиной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³ и доводят объем до метки метанолом.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1.    Основной раствор касугамицина с концентрацией 0,5 мг/см³\ точную навеску касугамицина гидрохлорида (55 ± 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в метаноле и доводят объем до метки метанолом.

7.3.2.    Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями касугамицина 0,002;

0,005; 0,01; 0,02 и 0,05 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя 1%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.1.    Раствор № 1 с концентрацией 1,0мкг/см*\ в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.2.    Раствор № 2 с концентрацией 0,05 мкг/см'³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора № 1 и доводят до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.3.    Раствор М 3 с концентрацией 0,02 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,2 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.4.    Раствор № 4 с концентрацией 0,01 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,1 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в меганоле.

7.3.2.5.    Раствор №5 с концентрацией 0,005мкг/см³: в мерную колбу вместимостью J0 см³ помещают 1,0 см³ раствора № 2 и доводят объем до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.6.    Раствор № 6 с концентрацией 0,002 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора № 3 и доводят объем до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

Основной раствор касугамицина можно хранить в холодильнике при температуре 0—4 °С в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения касугамицина используют ме-танольные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему метанолом.

7.4. Построение градуировочного графика

Для каждого из градуировочных растворов регистрируют хроматограммы в условиях, указанных в п. 9.2, и определяют абсолютное время удерживания и площадь пика касугамицина (в уел. ед.), соответствующего MRM (380—^200). Одновременно в режиме автоматической обра-