МУК 4.1.2063-06
Методические указания по определению остаточных количеств триасульфурона в зерне хлебных злаков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ
КОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ
В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ,
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОМ СЫРЬЕ
И ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Сборник методических указаний
МУК 4.1.2062 - 4.1.2074-06

Москва, 2009

1. Сборник подготовлен Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Разработчики методов указаны в каждом из них.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Содержание

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТРИАСУЛЬФУРОНА
В ЗЕРНЕ ХЛЕБНЫХ ЗЛАКОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ
ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Вводная часть

Торговое наименование: Дукат.

Фирма регистрант: ООО НПП «Агрусхим».

Действующее вещество: триасульфурон.

Структурная формула:

1-[2-(2-хлорэтокси)фенилсульфонил]-3-(6-метил-4-метокси-1,3,5-триазин-2-ил)мочевина (IUPAC).

2-(2-хлорэтокси)-[[(6-метил-4-метокси-1,3,5-триазин-2-ил)амино]карбонил]бензолсульфонамид (СА).

Мол. масса: 401,8.

Брутто формула: C₁₄H₁₆ClN₅O₅S.

Химически чистый триасульфурон представляет собой белый порошок с температурой плавления 178,1 °С, давлением паров < 2×10^-3 мРа (25 °С).

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_owlgP = 1,1 (pH 5), -0,59 (pH 7), -1,8 (pH 9) (25 °С).

Растворимость (г/дм³): в воде 0,032 (pH 5), 0,815 (pH 7), 13,5 (pH 8,4) при 25 °С; дихлорметане - 36, ацетоне - 14, этилацетате - 4,3, этаноле - 0,42, толуоле - 0,3, н-октаноле - 0,13, гексане - 0,00004 (25 °С).

Стабилен на воздухе до 140 °С, в нейтральных и щелочных растворах при 25 °С.

Группа токсичности по ЕПА - IV, ВОЗ - U; Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс и мышей > 5000 мг/кг. Дермальная токсичность для крыс > 2000 мг/кг.

Область применения: селективный гербицид, адсорбируется листьями, корнями и быстро попадает в меристему. Используется для контроля широколиственных сорняков на зерновых. Гигиенические нормативы для триасульфурона в России: МДУ в зерне хлебных злаков - 0,1 мг/кг.

2. Методика определения триасульфурона в зерне хлебных злаков методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Область применения и принцип метода

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств триасульфурона в пробах зерна хлебных злаков в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методика основана на определении триасульфурона методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Диапазон определяемых концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

Нижний предел определения триасульфурона в зерне 0,01 мг/кг.

Полнота определения 80 % (коэффициент извлечения K = 0,8),

Границы суммарной относительной погрешности результата измерений ∆ ± 12 % при доверительной вероятности Р = 0,95 (n = 20).

Полнота определения триасульфурона в зерне зерновых колосовых культур (N = 5 для каждой концентрации):

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, осч, ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-230НМ» или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры «красная лента», ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калий фосфорнокислый 2-замещенный, 3-водный, чда, ГОСТ 2493-75.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота ортофосфорная, имп. (Ferak, Германия) или хч, ГОСТ 6552-80; 2М и 0,005М водные растворы.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Трибенурон-метил, аналитический стандарт с содержанием д.в. 98,2 % (Sigma-Aldrich).

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, хч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - 0,01М Н₃РО₄ (35:65, по объему).

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 - 0,063 mm) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат (50:50, по объему).

Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат (10:90, по объему).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф LC-10A фирмы Shimadzu с УФ детектором (SPD-10A) или другой с аналогичными характеристиками.

Аналитическая колонка Supelcosil С-18 (150×4,6) мм, 5 мкм (Sigma-Aldrich).

Предколонка Supelcosil С-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001 или аналогичные.

Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.

Мельница лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный.

Бидистиллятор.

РН-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.

Насос водоструйный, МРТУ 42861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 см³, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 см³, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 см³, ГОСТ 22292-74.

Колонки стеклянные (25×1) см.

Допускается применять другие вспомогательное оборудование, материалы и реактивы с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

2.4. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна». Пробы зерна для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Перед анализом зерно доводят до стандартной влажности и измельчают на лабораторной мельнице.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 см³ растворителя упаривают в ротационном испарителе при температуре 40 °С до объема 1,0 см³ и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2 %-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 дм³ ацетона 10 г KМnO₄ и 2 г K₂СО₃). Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Этилацетат промывают равным объёмом 5 %-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Supelcosil С-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 см³/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 2М раствора ортофосфорной кислоты 200 г 98 % (или 225 г 87 %) кристаллической Н₃РО₄ помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в 600 см³ дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Для приготовления 0,01М раствора ортофосфорной кислоты 5,0 см³ 2М раствора Н₃РО₄ вносят в мерную колбу на 1 дм³ и доводят до метки деионизированным бидистиллятом.

Для приготовления 0,2М раствора K₂НРО₄ 45,6 г кристаллического калия фосфорнокислого двузамещенного трехводного помещают в мерную колбу на 1 дм³, растворяют при перемешивании в 600 см³ дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

Для получения 50 %-го водного ацетона в колбе емкостью 1 дм³ смешивают 500 см³ ацетона с 500 см³ дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,01М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента № 1 в колбе на 1000 см³ смешивают 500 см³ н-гексана и 500 см³ этилацетата. Для приготовления элюента № 2 в колбе на 1000 см³ смешивают 100 см³ н-гексана и 900 см³ этилацетата.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску триасульфурона (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 см³, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/см³). Градуировочные растворы с концентрациями 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы - смесь ацетонитрил - 0,01М ортофосфорная кислота (35:65, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения триасульфурона используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,2 и 2,0 мкг/см³ готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/см³ методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация триасульфурона в растворе) в хроматограф вводят по 20 мм³ градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации триасульфурона в градуировочном растворе (мкг/см³).

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 см³ смеси гексан - этилацетат (50:50, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 см³ элюента № 2 и 50 см³ элюента № 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения триасульфурона на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 0,1 см³ стандартного раствора триасульфурона с концентрацией 10 мкг/см³. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °С), остаток растворяют в 5 см³ элюента № 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 см³ элюента № 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 50 см³ элюента № 1, затем 100 см³ элюента № 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 см³ каждая, упаривают, остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание триасульфурона по п. 2.6.3.

Фракции, содержащие триасульфурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.3. Рассчитывают содержание триасульфурона в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания триасульфурона и сопутствующих коэкстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Определение триасульфурона в зерне

Навеску размолотого на лабораторной мельнице зерна массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 см³ и экстрагируют триасульфурон 50 см³ смеси ацетон-вода (1:1, по объёму) на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют дважды порциями по 50 см³, выдерживая в ультразвуковой ванне каждый раз в течение 15 мин. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Объём водного остатка доводят до 100 см³ дистиллированной водой, добавляют к нему 50 см³ 0,2М раствора K₂НРО₄.

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

Объединённый водный экстракт промывают в делительной воронке объёмом 500 см³ дважды гексаном порциями по 50 см³ (верхний органический слой отбрасывают) и дважды этилацетатом порциями по 50 см³ (верхний органический слой отбрасывают), встряхивая каждый раз делительную воронку в течение 2 - 3 мин. Водную фазу подкисляют 2М ортофосфорной кислотой до pH 3 и триасульфурон экстрагируют этилацетатом трижды по 30 см³, встряхивая воронку каждый раз по 2 - 3 мин*. Нижний водный слой отбрасывают. Объединенную органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 см³ этилацетата. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.2**.

__________

* В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку: на стадии промывки экстрактов гексаном - небольшое количество (до 10 см³) этилового спирта.

** В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб (п. 2.6.1) дает удовлетворительные результаты дополнительную очистку на колонке с силикагелем можно исключить.

2.6.2. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.п. 2.6.1 экстрактов зерна, количественно переносят двумя порциями по 5 см³ смеси гексан - этилацетат (50:50, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 50 см³ элюента № 1, которые отбрасывают. Триасульфурон элюируют 80 см³ элюента № 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 см³. Раствор выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мм³ раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф LC-10A фирмы Shimadzu с УФ детектором (SPD-10A) или другой с аналогичными характеристиками.

Рабочая длина волны 223 нм.

Колонка Supelcosil С-18 (150×4,6) мм, 5 мкм (Sigma-Aldrich).

Предколонка Waters Symmetry С-18 для защиты аналитической колонки.

Температура колонки 30 ± 1 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,01М раствор Н₃РО₄ в соотношении 35:65 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 см³/мин.

Время удерживания триасульфурона 8,3 ± 0,1 мин.

2.6.4. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание триасульфурона в образце зерна (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где S₁ - площадь пика триасульфурона в стандартном растворе, мм;

S₂ - площадь пика триасульфурона в анализируемой пробе, мм;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация стандартного раствора триасульфурона, мкг/см³;

K - коэффициент извлечения, определяемый в эксперименте по внесению стандартного раствора триасульфурона в контрольный образец зерна.

Содержание остаточных количеств триасульфурона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор триасульфурона 2 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

3. Оформление результатов измерений

Результаты измерений содержания триасульфурона в образцах зерна представляют в виде:

(X ± ∆) мг/кг,

где ∆ - показатель точности результатов анализа (границы, в которых погрешность любого из совокупности результатов анализа, полученных при реализации методики, находится с принятой вероятностью Р = 0,95).

4. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

5. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.

6. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

7. Разработчики

Долженко В.И., Цибульская И.А., Юзихин О.С. (ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург).