«УТВЕРЖДАЮ»

Главный Государственный санитарный врач Российской Федерации Первый заместитель Министра Здравоохранения 1 Гсийской Федерации

Онищенко 2004 г.

МУК 4.1J£k$~&

Дата введения - < 4

Методические указания по определению остаточных количеств феноксапроп-Р-этила и феноксапропа-Р в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1. Вводная часть.

Фирма производитель: ЗАО Фирма «Август» (Россия) Торговое название: Ластик

Действующее вещество: Феноксапроп-Р-этил Этиловый эфир (К)-2-[[4-(6-хлор-2бензоксазолил)окси]фенокси] пропионовой кислоты (IUPAC)

Эмпирическая формула: CigH^ClNOs

Молекулярная масса: 361.8

Бесцветное кристаллическое вещество без запаха

Температура плавления: 89-9ГС.

Давление паров при 20°С: 5.3-1 О*⁷ Па

Коэффициент распределения в системе н-октанол/вода: IogKov^.SS

Растворимость (в г/л растворителя) при 20°С: ацетон-200; толуол - 200; этилацетат - более 200; этанол - 24; вода - 7-ЮЛ

Вещество стабильно в течение 90 дней при 50°С, не разрушается на свету. Нейтральные и, особенно, щелочные растворы нестабильны: DT₅₀ составляет 1000 дней при pH 5; 100 дней при pH 7 и 2,4 дня при pH 9.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 3150-4000 мг/кг, для мышей - более 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2000 мг/кг; острая

Калия перманганат марки “хч” по ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид марки “хч” по ГОСТ 4161-77.

Кислота ортофосфорная марки “хч” по ГОСТ 6552-80.

Кислота серная марки “хч” по ГОСТ 4204-77.

Кислота хлористоводородная марки “хч” по ГОСТ 3118-77.

Гидроксид натрия марки “хч” по ГОСТ 4328-77.

Сульфат натрия безводный марки “хч” по ГОСТ 4166-76.

Карбонат натрия марки “хч” по ГОСТ 83-63.

Метанол марки “хч” по ГОСТ 6995.

Этилацетат марки “хч” по ГОСТ 22300-76.

Эфир диэтиловый медицинский по ГОСТ 6265-74.

Азот сжатый балонный марки “осч” по ГОСТ 9293-74.

Оксид алюминия для хроматографии нейтральный со средним размером частиц 70 мкм.

Силикагель для хроматографии фирмы Merck (grade 60, 70 -230 mesh, 60 А).

Элюент I для препаративной колоночной хроматографии: смесь этилацетата и гексана (3:97 по объему).

Элюент II для препаративной колоночной хроматографии: смесь этилацетата и гексана . (1:4 по объему).

Элюент III для препаративной колоночной хроматографии: смесь этилацетата и метанола (7:3 по объему).

Подвижная фаза № 1 для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и воды в объемном соотношении 3:2.

Подвижная фаза № 2 для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила, воды и ортофосфорной кислоты в объемном соотношении 49.5:50:0.5.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с “Унифицированными    правилами    отбора    проб

сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов” (№-2051-79 от 21.08.79).

Пробы подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при температуре не выше 4°С не более 3 месяцев; перед анализом образцы размалывают на мельнице.

2.5. Подготовка к анализу

2.5.1. Подготовка и очистка растворителей и реактивов

Органические растворители перед началом работы очищают в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают в делительной воронке с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения визуально наблюдаемого окрашивания свежей порции кислоты. Затем гексан последовательно промывают водой, 2 %-ным водным раствором гидроксида натрия, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Этилацетат встряхивают в делительной воронке с равным объемом 5 %-ного раствора карбоната натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют над свежепрокаленным при 150°С оксидом алюминия.

Диэтиловый эфир (1 дм³) последовательно встряхивают в делительной воронке с 20 см³ свежеприготовленного подкисленного раствора железного купороса (30 г сульфата железа и 1.54 г концентрированной серной кислоты в 55 см³ воды), затем с 50 см³ 0.5 %-ного раствора перманганата калия, затем с 50 см³ 5 %-ного раствора гидроксида натрия и, наконец, с 50 см³ воды, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют над свежепрокаленным при 150°С оксидом алюминия.

Оксид алюминия для хроматографии очищают многократной промывкой водой, отжимают на фильтре Шотта, трижды промывают метанолом и высушивают при 140°С в течение 15 часов.

Силикагель для хроматографии трижды промывают метанолом на фильтре Шотта и высушивают при 140°С в течение 15 часов.

2.5.2. Приготовление подвижных Фаз для ВЭЖХ

Подвижная фаза № 1 для ВЭЖХ (для определения феноксапроп-Р-этила).

Отдельно фильтруют ацетонитрил и чистую дистиллированную деионизированную воду.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 600 см³ ацетонитрила и доводят объем до метки дистиллированной деионизированной водой. Содержимое колбы тщательно перемешивают.

Подвижная фаза № 2 для ВЭЖХ (для определения феноксапропа-Р).

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 0.5 см³ ортофосфорной кислоты, прибавляют 500 см³ отфильтрованной дистиллированной деионизированной воды и доводят объем до

метки ацетонитрилом. Содержимое колбы тщательно перемешивают.

2.5.3.    Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ

Колонку промывают 25 см³ ацетонитрила, затем подвижной фазой в течение 25 минут при скорости подачи элюента 1 см³ / мин. Включают детектор и продолжают прокачивать элюент до стабилизации нулевой линии.

2.5.4.    Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор феноксапроп-Р-этила с концентрацией 100 - 150 мкг/см³ готовят растворением 10 - 15 мг стандартного образца феноксапроп-Р-этила с содержанием основного вещества 98.4 мае. % в ацетонитриле в мерной колбе вместимостью 100 см³ . Раствор хранят в холодильнике при температуре не выше -12°С не более 15 суток.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0.05, 0.1, 0.15 и 0.25 мкг/см³ готовят из основного стандартного раствора феноксапроп-Р-этила соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой №1 для ВЭЖХ (п. 2.5.2).Растворы хранят в холодильнике не более суток.

Основной стандартный раствор феноксапропа-Р с концентрацией 100 - 150 мкг/см³ готовят растворением 10 - 15 мг стандартного образца феноксапропа-Р с содержанием основного вещества 99.1 мае. % в ацетонитриле в мерной колбе вместимостью 100 см³. Раствор хранят в холодильнике при температуре не выше -12°С не более 15 суток.

SO

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0.04, 0.1, 0.15 и 0.25 мкг/см³ готовят из основного стандартного раствора феноксапропа-Р соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой №2 для ВЭЖХ (п. 2.5.2).Растворы хранят в холодильнике не более суток.

2.5.5.    Построение калибровочных графиков

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 50 мкл рабочего стандартного раствора феноксапроп-Р-этила с концентрацией 0.05, 0.1, 0.15 и 0.25 мкг/см³ или рабочего стандартного раствора феноксапропа-Р с концентрацией 0.04, 0.1, 0.15 и 0.25 мкг/см³. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений для каждой концентрации каждого вещества. Для каждого вещества строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика в относительных единицах от концентрации вещества в растворе в мкг/см³.

2.5.6.    Подготовка препаративной колонки с оксидом алюминия для очистки сконцентрированного экстракта феноксапроп-Р-этила

В нижнюю часть колонки помещают небольшой тампон из стекловаты, закрывают кран и приливают 10 см³ гексана. Затем в колонку быстро заливают при помощи стеклянной воронки суспензию 5 г оксида алюминия в 20 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, после чего пропускают через колонку раствор 170 мг воды в 30 см³ этил ацетата со скоростью 1-2 капли в секунду, затем 10 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него 2 г безводного сульфата натрия. Колонку промывают 10 см³ гексана, после чего она готова к работе.

3/

2.5.7.    Проверка хроматографического поведения феноксапроп-Р-этила на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ отбирают 0.05 см³ стандартного раствора феноксапроп-Р-этила с концентрацией 100 - 150 мкг/см³, удаляют растворитель слабым потоком чистого сжатого воздуха или инертного газа, остаток количественно переносят тремя порциями по 1 см³ гексана на подготовленную колонку. Промывают колонку 20 см³ смеси этилацетат-гексан (3:97 по объему), затем 60 см³ смеси этилацетат-гексан (1:4 по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 см³ каждая, упаривают досуха, растворяют в 2-5 см³ подвижной фазы №1 для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание феноксапроп-Р-этила по п. 2.7.1. Рассчитывают содержание вещества в каждой фракции элюата, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

ПРИМЕЧАНИЕ: Хроматографический профиль феноксапроп-Р-этила может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.8.    Подготовка препаративной колонки с силикагелем для очистки сконцентрированного экстракта феноксапропа-Р

В нижнюю часть колонки помещают небольшой тампон из стекловаты, закрывают кран и приливают 10 см³ этил ацетата. Затем в колонку быстро заливают при помощи стеклянной воронки суспензию 5 г силикагеля в 20 см³ этилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, после чего пропускают через колонку 30 см³ смеси этилацетат-метанол (1:1 по объему), затем 10 см³ этилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него 2 г безводного сульфата натрия.

ингаляционная токсичность (LC50) для крыс более 1.224 мг/л воздуха. Феноксапроп-Р-этил не вызывает раздражения кожи. (LC50) для рыб - 0.46-0.58 мг/л (96 час.)

Феноксапроп-Р-этил малотоксичен для пчел, птиц, дождевых червей.

Гигиенические нормативы (ГН 1.2.1323-03) для феноксапроп-Р-этила в России: ОДК в почве - 0.04 мг/кг; ПДК в воде водоемов-0.0003 мг/дм³; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0.06 мг/м³; МДУ для зерна хлебных злаков, моркови, свеклы столовой, подсолнечника (масло) и лука - 0.01 мг/кг, свеклы сахарной, сои - 0.05 мг/кг; капусты - 0.02 мг/кг; рапса, гороха - 0.2 мг/кг.

Основной метаболит феноксапроп-Р-этила: феноксапроп-Р.

(11)-2-[4-[(6-хлор-2-бензоксазолил)окси]фенокси]-иропионовая кислота (ШРАС)

Эмпирическая формула: C^H^ClNOs Молекулярная масса: 333.7

Светло-бежевое кристаллическое вещество со слабым характерным запахом

Температура плавления: 155-1б1°С Давление паров при 20°С: 1.8-1 O'⁴ Па Коэффициент распределения в системе н-октанол/вода: logKo_W=l .83 - 0.24 (pH 5 - pH 9)

Растворимость (в г/л растворителя) при 20°С: толуол - 0,5; метанол - 34; этилацетат - 36; ацетон - 80; вода - 0,27 (pH 5.1) и 68 (pH 7.0)

Другие физико-химические и токсикологические характеристики феноксапропа-Р отсутствуют.

Гигиенические нормативы для феноксапропа-Р в России не установлены.

Область применения препарата:

Феноксалроп-Р-этил - послевсходовый гербицид системного действия из группы ингибиторов синтеза жирных кислот. В комбинации с антидотом - мефенпир-диэтилом используется для уничтожения однолетних злаков в посевах зерновых колосовых культур в том числе ячменя, чувствительного к действию одного феноксапроп-этила. В настоящее время препарат, содержащий в качестве ДВ феноксапроп-Р-этил (69 г/л), а в качестве антидота -мефенпир-диэтил (75 г/л), под торговым названием Ластик проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ на озимой и яровой пшенице и яровом ячмене в качестве послевсходового гербицида при норме расхода 0.6 - 1.2 л/га и однократной обработке за сезон.

80

Феноксапроп-Р-этил - лабильное вещество и в растениях быстро метаболизируется до достаточно стабильного соединения -феноксапропа-Р.

2. Методика определения феноксапроп-Р-этила и феноксапропа-Р в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2.1. Основные положения.

2.1.1. Принцип методики.

Методика основана на определении феноксапроп-Р-этила и его метаболита феноксапропа-Р методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращенно-фазовом режиме со спектрофотометрическим детектором после предварительного извлечения перечисленных компонентов водным ацетонитрилом с последующим концентрированием и очисткой экстракта в системах несмешивающихся растворителей и на колонках с сорбентами.

Количественная обработка результатов анализа проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность методики.

В предлагаемых условиях методика специфична в присутствии других пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания зерновых колосовых культур.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Таблица 1.

Метрологические параметры метода (Р=0.95. п=20У

Анализируемый объект	Предел обнаружения, мг/кг*	Диапазон определяемой концентрации, мг/кг	Среднее знамение определения, %	Огн. станд. отклонение. (ajx), %	Доверит. интервал среднего, %
Феноксапроп - Р - этил
Зерно	0.005	0.005 -0.025	82.1	1.6	±3.1
Солома	0.01	0.01-0.05	78.9	1.8	±3.8
Феноксапроп - Р
Зерно	0.004	0.004- 0.025	77.8	1.9	±3.5
Солома	0.008	0.008- 0.05	77.5	2.1	±3.9

*- при соотношении сигнал/ шум равном 5

яг

Таблица 2. Полнота определения феноксапроп-Р-этила (ФЭ) и феноксапропа-Р (Ф) в модельных матрицах (п=5)

Матрица Внесено Открыто Доверительный ФЭ или Ф, ФЭ или Ф, интервал мг/кг мг/кг среднего, % Феноксапроп-Р-этил 0.005 80.1 ±5.0 Зерно 0.01 81.3 ±4.6 0.015 82.9 ±3.7 0.025 84.2 ±3.5 0.01 75.6 ±5.2 Солома 0.02 76.9 ±4.4 0.03 80.9 ±4.0 0.05 82.1 ±3.9 Феноксапроп-Р 0.004 75.3 ±5.4 Зерно 0.01 76.1 ±4.6 0.015 79.4 ±3.8 0.025 80.5 ±3.2 0.008 76.1 ±5.2 t |ОЛОма 0.02 77.8 ±4.4 0.03 77.1 ±3.9 0.05 79.2 ±3.1

2.2. Приборы, лабораторная посуда.

Жидкостный хроматограф высокой эффективности фирмы “Agilent Technologies”, модель 1100 (США) или любой аналогичный по техническим характеристикам, оборудованный вакуумным дегазатором, термостатом колонок, спсктрофотометрическим детектором с измеряемой длиной волны и любой системой подачи подвижной фазы.

Колонка аналитическая Zorbax SB Cl8 (США) (средний размер частиц 5 мкм) длиной 250 мм и внутренним диаметром 4.6 мм или аналогичная, испытанная фирмой-изготовителем.

Петлевой инжектор с дозировочной петлей вместимостью 20

мм³.

Микрошприц для ВЭЖХ фирмы “Agilent Technologies” или любой аналогичный вместимостью 50 мм³.

Прибор для получения особо чистой (деионизированной) воды «Водолей» или любой аналогичный по техническим характеристикам.

Весы лабораторные GR-200 фирмы A&D, Япония 2-го класса точности (зарегистрированы в Российском Государственном реестре средств измерений под Ns 18902-99) или любые аналогичные по метрологическим характеристикам.

Ванна ультразвуковая FINNSONIC OY (Финляндия) или любая аналогичная по техническим характеристикам.

Колбы мерные с притертыми или полиэтиленовыми пробками по ГОСТ 1770-74 вместимостью 50, 100 и 1000 см³.

&

Пипетки измерительные с расширенной градуировкой и полным сливом по ГОСТ 29227-91 вместимостью 1,2, 5 и 10 см³.

Цилиндры мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 50 и 500 см³.

Колбы остродонные с пришлифованными пробками вместимостью 100 и 250 см³ по ГОСТ 25336-82.

Переход с боковым отводом по ГОСТ 8682-70.

Воронки с фильтром Шотта №3 по ГОСТ 8682-70.

Воронки стеклянные по ГОСТ 8613-64.

Стеклянная колонка для препаративной хроматографии длиной около 300 мм и внутренним диаметром около 12 мм.

Стакан лабораторный типа ВН-50 вместимостью 50 см³.

Колбы конические с пришлифованными пробками вместимостью 200 см³ по ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные вместимостью 100 и 500 см³ по ГОСТ 25336-82.

Шкаф сушильный ШС-1/80 СПУ ПГИЖ 6819454.006 (ТУ 3443-010-00141798-01) или любой аналогичный, пригодный для поддержания температуры не менее 150°С.

Роторно-пленочный испаритель LABOROTA 4000 фирмы “Heidolph” (Германия) или аналогичный.

Насос вакуумный водоструйный по ГОСТ 10696-75.

Мельница электрическая лабораторная по ТУ 46-22-236-79 или аналогичная по техническим характеристикам.

Прибор для перегонки жидкостей при атмосферном давлении.

Источник чистого сжатого воздуха (баллон или безмасляный компрессор) или любого чистого инертного газа.

<56-

Набор для фильтрации элюентов для ВЭЖХ фирмы “MILLIPOR” или аналогичный с гидрофильными фторопластовыми мембранами типа МФФКГ пористостью 0,45 мкм по ТУ 6-55-221-1323-93.

Набор для фильтрации проб для ВЭЖХ фирмы "MILLIPOR” или аналогичный с капроновыми мембранами пористостью 0,2 мкм.

РН-метр-иономер ЭКСПЕРТ-001 фирмы «ЭКОНИКС-ЭКСПЕРТ» (ТУ 4215-001-52722949) или любой аналогичный по техническим характеристикам.

Электрод стеклянный комбинированный типа ЭСК-1060117 (ТУ 4215-004-35918409).

Стекловата, отмытая гексаном и высушенная при температуре 150°С.

2.3. Реактивы и растворители.

Стандартный образец феноксапроп-Р-этила с содержанием основного вещества 98.4 мае. %.

Стандартный образец феноксапропа-Р с содержанием основного вещества 99.1 мае. %.

Ацетонитрил марки «осч» (ТУ 6-09-14-2167).

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709, деионизированная (удельная проводимость не более 0,12 mkS/cm).

Гексан марки «хч» по ТУ 6-09-3375-78.

Железо (II) сернокислое марки “хч” по ГОСТ 4148-78.