ПРОДУКТЫ БЕЗАЛКОГОЛЬНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Методы микробиологического анализа

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2010

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности (ВНИИ ПБиВП). Техническим комитетом ТК 335 • Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность». Межгосударственным техническим комитетом по стандартизации МТК 91 «Пивобезалкогольная и винодельческая продукция»

ВНЕСЕН Госстандартом России

2    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 19 от 24 мая 2001 г.)

За принятие проголосовали:

Наименование государства	Наименование национального органа по стандартизации
Азербайджанская Республика	Азгоссганларт
Республика Армения	Армгосстандарг
Республика Беларусь	Госстандарт Республики Беларусь
Грузия	Грузе тантарт
Республика Казахстан	Госстандарт Республики Казахстан
Кыргызская Республика	Кыршзстантарг
Республика Молдова	Молдовастандарт
Российская Фслсрапия	Госстандарт России
Республика Таджикистан	Таджи кстантарг
Туркменистан	Главгосслужба «Туркмснстантартлары»
Республика Узбекистан	Узгосстанларт
Украина	Госстандарт Украины

3    Постановлением Государственного комитета Российской Федерации по стандартизации и метрологии от 31 июля 2001 г. № 304-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 30712-2001 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 июля 2002 г.

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5    ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель2010г.

О ИПК Издательство стандартов. 2001 © СТАНДАРТИНФОРМ. 2010

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания на территории Российской Федерации без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

200

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

11РОДУКТЫ БЕЗ АД KOI ОД ЫЮЙ П РОМ Ы ШЛ EH IЮСТИ

Метилы микробиологического анализа

Products of non-alcoholic industry.

Methods of microbiological analysis

Дата введения 2002—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на продукты безалкогольной промышленности (безалкогольные и слабоалкогольные напитки, сиропы, концентраты напитков в потребительской таре, напитки на зерновом сырье) и устанавливает методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, бактерии группы кишечных палочек (колиформных бактерий), дрожжей и плесневых грибов.

Методы предназначены для определения количества микроорганизмов:

-    посевом в агаризованные питательные среды жидкого продукта, содержащие в I см³ более 15 или в 1 г твердого продукта более 150 колониеобразующих единиц (КОЕ);

-    посевом на агаризованные питательные среды жидкого продукта, содержащего в 1 см¹ более 150 КОЕ. а с применением мембранной фильтрации в продуктах, содержащих в нормируемом объеме 100 и более КОЕ.

(Поправка).

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 1341-97 Пергамент растительный. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2874-82* Вода питьевая. Гигиенические требования и контроль за качеством

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4159-79 Реактивы. Йод. Технические условия

ГОСТ 4232 — 74 Реактивы. Каши йодистый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия пироокись. Технические условия

ГОСТ 5556-81 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия

ГОСТ 5962-67** Спирт этиловый ректификованный. Технические условия

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для .микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9412-93 Марля медицинская. Общие технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

• На территории Российской Федерации действуют СанПиН 2.1.4.1074—2001 «Питьевая вола. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества», ГОСТ Р 51232-98

** На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000.

Издание официальное

ГОСТ 10444.12-88 Продукты нишевые. Метод определения дрожжей и плесневых фибов ГОСТ 10444.15-94 Продукты нишевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытания

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия ГОСТ 18481-81 Арсомефы и цилиндры стеклянные. Общие технические условия ГОСТ 19569-89¹ Стерилизаторы паровые медицинские. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Обшие технические требования и методы испытаний ГОСТ 24104-88² Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Обшие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25706-83 Лупы. Типы, основные параметры. Обшие технические требования ГОСТ 26668-85 Продукты нишевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26669-85 Продукты нишевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиолошческих анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты нишевые. Методы культивирования микроорганизмов ГОСТ 28498-91 Термомефы жидкостные стеклянные. Обшие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29225-91 (ИСО 1775—75) Посуда и оборудование фарфоровые лабораторные. Обшие требования и методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки фадуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 29228-91 (ИСО 835-2—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки традунрованные. Часть 2. Пипетки традунрованные без установленного времени ожидания

ГОСТ 29229-91 (ИСО 835-3—81) Некуда лабораторная стеклянная. Пипетки традуированные. Часть 3. Пипетки традуированные с временем ожидания 15 с

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4—81) Некуда лабораторная стеклянная. Пипетки фадуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

ГОСТ 30518-97/ГОСТ Р 50474-93³ Продукты нишевые. Методы выявления и определения количества бактерий фуппы кишечных палочек (колиформных бактерий)

ГОСТ 30519-97/ГОСТ Р 50480-93^й Продукты нишевые. Мегод выявления бактерий рода Sallmonella.

3 Отбор и подготовка проб

3.1    Огбе>р проб по ГОСТ 26668 со следующим дополнением:

Перед взятием пробы готового напитка пробку и горловину бутылки, поверхность металличес-кой банки или другой упаковки протирают ватным тампоном, смоченным в 70 %-м растворе этилового спирта по ГОСТ 5962. Затем стерильным ключом быстро снимают кроненпробку или пробку бутылки отвинчивают. Горловину открытой бутылки обжигают в пламени спиртовки или протирают 70 %-м раствором этилового спирта но ГОСТ 5962 и отбирают необходимый для анализа объем напитка.

Не допускается обжигать над пламенем стеклянную бутылку с газированным напитком, закупоренную кроненпробкой. гак как она может взорваться.

3.2    Подготовка проб — по ГОСТ 26669.

ГОСТ 30712-2001

4 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы, материалы

4.1 При проведении испытаний используют:

автоклав или стерилизатор паровой медицинский по ГОСТ 19569:

весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 1 кг. 3-го класса точное™ по ГОСТ 24104:

прибор вакуумного фильтрования:

термостаты любого типа, обеспечивающие поддержание заданной температуры от 24 до 55 *С с допустимой по1решностью ±1 *С;

шкаф сушильный любого типа, обеспечивающий температуру нагрева 100 — 200 *С: pH-метр или потенциометр:

микроскоп световой биологический любого типа, обеспечивающий увеличение 900 — 1000^х: ареометр-сахаромер но ГОСТ 18481: холодильник по ГОСТ 16317;

плитку Электрическую с закрытой спиралью по ГОСТ 14919; баню водяную;

фильтры мембранные для микробиологических целей: пинцеты медицинские по ГОСТ 21241: шпатели мстатические и стеклянные:

термометры жидкостные стеклянные (нертугные) диапазоном измерений от 0 до 100 *С и ценой деления шкалы 1 *С по ГОСТ 28498; лупу по ГОСТ 25706; спиртовку по ГОСТ 25336; сетку асбестовую; петли бактериологические; чашки фарфоровые но ГОСТ 29225: ключ для вскрытия бутылок;

колбы К. П. Кн вместимостью 50. 100. 250. 500 и 1000 см³ по ГОСТ 25336; пробирки П1, 112, П2Т по ГОСТ 25336;

пипетки градуированные вместимостью 1, 2.5.10.25 см³ по ГОСТ 29227. ГОСТ 29228. ГОСТ 29229. ГОСТ 29230;

стаканы типов В и Н вместимостью 100. 150. 250. 400. 600. 800. 1000 см³ по ГОСТ 25336; стаканчики для взвешивания (бюксы) типов СВ или СИ но ГОСТ 25336; стекла часовые;

кюветы для окрашивания препаратов;

стекла предметные для микро препаратов по ГОСТ 9284;

стекла покровные дш м и крон ре пара юв по ГОСТ 6672;

цилиндры мерные вместимостью от 25 до 2000 см³ по ГОСТ 1770:

шарики стеклянные, используемые для обеспечения равномерности кипения;

чашки биологические (Петри) по ГОСТ 25336:

марлю медицинскую по ГОСТ 9412:

вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556;

пергамент по ГОСТ 1341;

бумагу фильтровальную но ГОСТ 12026:

агар микробиологический но ['ОСТ 17206;

агар сухой питательный:

среду сухую Кесслер;

среду сухую Эндо;

среду сухую Сабуро;

сусло пивное неохмеленное;

масло иммерсионное для микроскопии но ГОСТ 13739:

бумагу индикаторную универсальную;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;

воду питьевую по ГОСТ 2874;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

калий йодистый по ГОСТ 4232;

йод по ГОСТ 4159;

203

натрия гидроокись по ГОСТ 4328:

кислот)' соляную по ГОСТ 3118;

кристаллический фиолетовый:

фуксин основной.

Допускается использование других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов, материалов, по техническим характеристикам не уступающих указанным выше.

5 Подготовка к проведению анализов

5.1 Подготовка посуды

5.1.1. Новую посуду, предназначенную для микробиологических работ, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты объемной долей 1—2 %) в течение 15 мин. затем ополаскивают дистиллированной водой до полного удаления следов моющего раствора и высушивают в сушильном шкафу.

5.1.2    Пробирки, колбы, бутылки закрывают ватно-марлевыми пробками, покрывают колпачком так. чтобы исключить загрязнение посте стерилизации в процессе работы и хранения. Пипетки со вставленными тампонами из ваты упаковывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу. Бактериолотческие чашки в закрытом виде укладывают в металлические пенаты или заворачивают в бумагу. Бумага, используемая для обертывания лабораторной посуды, не должна разрушаться при стерилизации. Режимы стерилизации посуды — по ГОСТ 26668.

5.1.3    Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.

5.1.4    Посуду с питательными средами после подсчета на них колоний микроорганизмов обеззараживают перед мойкой путем стерилизации в автоклаве при (121 ± I) *С в течение 30 мин или кипячением в течение 1 ч.

5.2 Приготовление реактивов и растворов

5.2.1    Реактивы для окраски по Грамму (модификация Г.П. Калины) — по ГОСТ 10444.1.

Приготовление реактива 1

В 100 см³ 96 %-го ректификованного спирта по ГОСТ 5962 растворяют 0.5 г кристаллического фиолетового.

Приготовление реактива 2

К 96 см³ спиртового раствора йодистого калия массовой концентрации 5 17дм³ добавляют 2 см³ спиртового раствора основного фуксина массовой концентрации 50 г/дм³ и 2 см ’спиртового раствора йода массовой концентрации 50 г/дм³.

Йодистый калий растворяют в спирте на водяной бане при температуре (45 ± 5) 'С при постоянном помешивании.

5.2.2    Раствор гидроокиси натрия концентрации 100 г/дм³ но ГОСТ 10444.1 (4.17). Готовый раствор стерилизуют при (120 ± 1) 'С в течение 20 мин.

Раствор применяется для подщелачивания питательных сред.

5.2.3    Спиртовой раствор основного фуксина массовой концентрации 5 г/дм³ по ГОСТ 10444.1 (4.25).

Применяют для повышения дифференцирующих свойств среды Эндо.

5.2.4    Приготовление 70 %-го раствора этилового спирта.

Для приготовления 70 %-го раствора этилового спирта необходимо к 70 см³ 96 %-го ректификованного этилового спирта добавить 26 см³ дистиллированной воды.

Применяют для асептической обработки тары при отборе проб для анализа.

5.2.5    Приготовление стерильной воды

Питьевую воду рахтивают в колбы или пробирки и стерилизуют в автоклаве при (121 ± 1) 'С в течение 30 мин.

5.2.6    Сроки хранения реактивов и растворов не более месяца.

5.3 Приготовление мигательных сред

5.3.1    Среда из сухого питательного агара

Среду готовят по прописи на этикетке или используют мясо-пептонный агар, приготовленный по ГОСТ 10444.1 (5.12).

Применяют для определения мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

5.3.2    Среда Кесслер с лактозой

Среду готовят по прописи на этикетке. При приготовлении среды в пробирки или калбы помешают поплавки. Для приготовления среды двойной концентрации навеску среды увеличивают в 2 раза.

204

ГОСТ 30712-2001

Допускается приготовление среды из отдельных ингредиентов но ГОСТ 30518 (4.2.4).

Селективную среду применяют дли накопления бактерий фунпы кишечных палочек.

5.3.3    Среда Эндо

Среду готовят по прописи на этикетке.

Для повышения дифференцирующих свойств в готовую и охлажденную до 60 — 70 'С среду перед розливом в чашки допускается прибавлять на 100 см Чреды 0.2 ем' 5 %-ю спиртового раствора основною фуксина.

Применяют селективную среду для определения бактерий фуппы кишечных палочек.

5.3.4    Солодовое сусло

Приютовление солодового сусла массовой долей сухих веществ II — 12 % и 7 — 8 % — по ГОСТ 10444.1 (5.44).

Можно использовать готовое неохмеле иное пивное сусло посте предварительной обработки. Готовое сусло массовой долей сухих веществ 11 — 12 % стерилизуют при (112 ± 1) ’С в течение 15 мин. Затем сусло фильтруют, разливают в стерильную посуду и стерилизуют при (116 ± 1)’С в течение 20 мин.

Применяют солодовое сусло: массовой долей сухих веществ 11 — 12 % для выявления дрожжей и плесневых фибов в концентратах напитков и соковых напитках с мякотью плодов, массовой долей сухих веществ 7 — 8 % — для приготовления солодового агаризованного сусла.

Солодовое сусло можно заменить виноградным суслом с аналогичным содержанием сухих веществ.

5.3.5    Солодовое агариэованное сусло

К I дм³ отфильтрованного сусла массовой долей сухих веществ 7 — 8 % добавляют 20 г агара. Среду расплавляют на водяной бане, разливают по стерильным пробиркам или колбам и стерилизуют при температуре (116 ± 1)*С в течение 20 мин.

Применяют дтя определения дрожжей и плесневых фибов.

5.3.6    Среда Сабуро

Среду готовят по прописи на этикетке. Из отдельных ингредиентов готовят следующим образом. 40.0 г глюкозы. 10.0 г пептона. 18.0 г агара добавляют к I дм³ дистиллированной воды. Смесь подогревают, периодически помешивая до растворения составных частей, охлаждают до 45 — 55 ’С. устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации она составляла при (25 ± 2) 'С 6.5 ±0.1. разливают в мерные колбы и стерилизуют 15 мин при температуре (121 ± I) *С.

Применяют дтя определения дрожжей и плесневых грибов.

5.3.7    Готовые питательные среды хранят при температуре (4 ± 2) *С не более одного месяца.

5.3.8    Допускаются к использованию питательные среды, диагностические препараты и системы идентификации производства зарубежных фирм, предназначенные дш целей описываемых методов. Питательные среды и биологические препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ISO 9000 или EN 29000.

При использовании следует руководствоваться рекомендациями фирмы-производителя.

Все питательные среды и препараты отечественного производств;! должны соответствовать требованиям нормативного документа и иметь инструкцию по применению.

5.4 Подготовка мембранных фильтров и фильтровального прибора

5.4.1    Дтя фильтрации используют мембранные фильтры диаметром от 50 до 35 мм размерами пор 0.65 — 0.45 мкм в стерильной и нестерильной упаковках.

Нестерильные фильтры стерилизуют непосредственно перед их использованием: кипячением или другим способом, рекомендованным фирмой-изготовите.тем.

Дтя кипячения фильтры помешают в стеклянный стакан тын медицинский стерилизатор с дистиллированной водой, нагретой до 30 *С. медленно доводят до кипения на слабом oihc. посте чего воду меняют и кипятят 10 мин. Во избежание деформации фильтров во время кипячения в стакан или медицинский стерилизатор помещают стеклянные шарики или сетку.

5.4.2    Дтя определения дрожжей и плесневых фибов используют фильтры размерами пор 0.65 — 0.45 мкм: для бактерий — 0.45 мкм.

5.4.3    Перед фильтрацией пробы воронку и столик обтирают ватным тампоном, смоченным 96 %-м ректификованным этиловым спиртом, и стерилизуют фламбированием и пламени горящего тампона. После охлаждения на столик кладут фламбиро ванным пинцетом мембранный фильтр, у era -нашивают воронку и закрепляют ее держателем.

Использование одноразовых стерильных комплектов, состоящих из воронки и мембраны, позволяет исключить стадию стерилизации фильтровального прибора.

205

5.4.4    Исследуемый объем пробы выливают в воронку и нажатием кнопки включают насос. При отсутствии мерных уровней в воронке пробы объемом 100 см ' и более отбирают стерильными цилиндрами. а объемом 10 см’ — стерильными пипетками.

5.4.5    По окончании фильтрации пробы фильтр промывают 2—3 см' стерильной питьевой воды для удаления остаточных следов кислоты и консерванта. После прохождении жидкости через фильтр колбу держат под вакуумом в течение 5—7 с (для иатного удаления следов жидкости) и насос отключают.

Снимают воронку и с помощью фллмбированного пинцета осторожно снимают фильтр вдольего кромки.

Открывают чашку Петри с питательной средой и опускают, не переворачивая, на нее фильтр. Накладывать фильтр следует так. чтобы между ним и поверхностью питательной среды не образовывались пузырьки воздуха. Для этою противоположный край фильтра (напротив пинцета) должен лечь на поверхность среды, а затем постепенно накладывают весь фильтр «накатом» на среду.

Поверхность фильтра с осевшими на нее микроорганизмами должна быть обращена вверх. Чашку закрывают и на дне чашки под каждым фильтром делают надписи с указанием номера профильтрованной пробы. На одну чашку можно поместить в зависимости от диаметра фильтра и чашки 11етри от 1 до 4 фильтров гак. чтобы фильтры не соприкасались.

5.4.6    Перед фильтрацией следующей пробы столик и воронку прибора тщательно фламбируют.

Кроме фламбирования прибора можно перед следующей пробой проводить кипячение ею в

кастрюле с питьевой водой, которая устанавливается недалеко от рабочего места. Вода должна быть заранее доведена до кипения и полностью покрывать фильтровальный прибор. Кипячение проводят в течение 1—2 мин. вынимают стерильный прибор фламбированными щипцами. Фильтровальный прибор в собранном виде можно стерилизовать в автоклаве при (121 ± 1) *С в течение 20 — 30 мин.

6 Методы анализа

6.1    Определение количества мезофнльных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Метод основан на высеве продукта или разведения навески продукта в агаризованную питательную среду, инкубировании посевов, подсчете всех выросших видимых каюний.

6.1.1    Проведение испытаний

6.1.1.1    Из навески продукта, отобранной по ГОСТ 26668. готовят исходный и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так. чтобы можно было определить в продукте предполагаемое коли-чество микроорганизмов или количество, указанное в нормативном документе на продукт.

6.1.1.2    При определении количества микроорганизмов посевом в агаризованные питательные среды из продукта и (или) из каждого соответствующею разведения но 1 см' высевают в две параллельные чашки Петри. Посевы заливают расплавленной и охлажденной до 45 — 48 ^СС одной из агаризо-ванных сред по 5.3.1. Посевы проводят по ГОСТ 26670 (4.1).

6.1.1.3    Посевы инкубируют при температуре (30 ± 1) *С в течение (72 ± 3) ч. Чашки Петри с посевами распределяют в термостате таким образом, чтобы расстояние между стопками чашек и стенками термостата было не менее 3 см.

6.1.2 Обработка результатов

6.1.2.1    Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке Петри, поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь луной с увеличением в 4—10^х. Каждую подсчитанную калонию отмечают на дне чашки чернилами. Для подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 300 колоний.

6.1.2.2    При большом количестве каюний и равномерном их распределении дно чашки Петри делят на 4 и бал ее одинаковых секторов, подсчитывают число каюний на 2 — 3 секторах (но не менее чем на •/, поверхности чашки), находят среднеарифметическое значение числа колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом находят общее число каюний. выросших на одной чашке.

Подсчитывают колонии микроорганизмов в каждом из параллельных посевов одною разведения. По результатам подсчета вычисляют среднеарифметическое значение числа каюний в посевах одною разведения.

Есш имеются колонии, выросшие в последующих разведениях, то подсчитываю! количество микроорганизмов в продукте по результатам подсчета колоний в каждом из этих разведений раздельно и вычисляют среднеарифметическое значение числа каюний.

206

ГОСТ 30712-2001

Полученное среднеарифметическое значение числа колоний округляют по ГОСТ 26670: до числа, кратного 5. — если среднеарифметическое значение числа колоний менее 100 (например 71 до 75; 83 до 85);

до числа, кратного 20, — если среднеарифметическое значение числа колоний более 100 и оканчивается цифрой 5 (например 115 до 120; 125 до 140);

до числа, кратного 10. — если среднеарифметическое значение числа колоний более 100 и не оканчивается цифрой 5 (например 116 до 110; 111 до 110; 121 до 120).

6.1.2.3 Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в пересчете на 1.0 г (см¹) продукта проводят но ГОСТ 26670.

Количество микроорганизмов в 1.0 г (см³) продукта Л/вычисляют по формуле

О)

где N — степень разведения навески;

т — количество инокулята, внесенное в чашку Петри, см³;

С — округленное среднеарифметическое значение числа колоний.

Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМА-ФАнМ) выражается КОЕ/см³ или КОЕ/г. где КОЕ — колониеобразующая единица.

Результат вычисления выражают чистом от 1,0 до 9.9x10".

Пример: 85 - 0.85 х 10²; 2220 - 2.22 х 10\

6.2 Определение количества мезофильных аэробных микроорганизмов

Метол основан на высеве нормируемого объема напитка с использованием мембранных фильтров на плотный питательный агар, инкубировании посева и подсчете всех видимых колоний, выросших на фильтре.

Метол предназначен для определения микроорганизмов в напитках с использованием подсластителей и заменителей сахара.

6.2.1    Проведение испытаний

6.2.1.1    Нормируемый объем исследуемой пробы напитка (100 см¹), отобранной по 3.1. фильтруют через мембрану по 5.4.

6.2.1.2    По окончании фильтрации фильтр переносят в чашку Петри на поверхность питательной среды, приготовленной по 5.3.1. Чашки закрывают и на дне чашки против каждого фильтра ставят номер колбы. Из каждой пробы делают посев в двух повторностях.

6.2.1.3    Чашки с посевами помещают в термостат при температуре (30 ± I) *С на (72 ± 3) ч.

6.2.2 Обработка результатов

6.2.2.1    Количество выросших колоний подсчитывают на каждом фнлыре. пользуясь лупой с увеличением в 4 — 10^х. При большом числе колоний фильтр делят на сектора и находят общее число колоний, выросших на всей поверхности фильтра.

6.2.2.2    После подсчета колоний на фильтре с параллельной пробой находят среднеарифметическое значение числа колоний, округляют до числа, кратного 5, по 6.1.2.2. Полученный результат является количеством аэробных микроорганизмов (КМАэМ). выраженным КОЕ/ЮОсм³.

6.3    Определение бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

Метод основан на выявлении бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) по сбраживанию лактозы с образованием кислоты и газа при (36 ± 1) *С в течение 24 ч. К бактериям группы кишечных палочек (колиформных бактерий) относятся грамотрицательные. бесспоровые палочки. принадлежащие к родам Echerichia. Citrobacter. Enterobacter, Klebsiella. Serratia (т. e. как цктрат-отрицательные. так и цитратположительные представители энергобактерий).

Определение БГКГ1 (колиформных бактерий) проводят методом мембранной фильтрации или прямым посевом в питательную среду.

Метод мембранной фильграиии основан на фильтровании нормируемого объема продукта через мембранный фильтр, инкубировании посевов на агариэованной селективной среде с лактозой и последующей идентификации колоний но культуральным и биохимическим признакам.

Метод прямого посева основан на накоплении бактерий посевом нормируемого объема или его разведения в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании, пересеве, при необходимости, на агаризованную селективную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим признакам.

6.3.1 Проведение испытаний

Метод мембранной фильтрации используют дли посева прозрачных и замутненных напитков, легко фильтруемых через мембрану.

207

Метл прямот посева — дли соковых напитков с мякотью плода и загустителям и. концентратов для напитков в потребительской таре, квасе брожения.

Анализ проводят в двух повторностях.

6.3.1.1    Метод мембранной фильтрации

Нормируемый объем пробы напитка (100 см³), отобранной по 3.1. фильтруют по 5.4. Фильтр укладывают на авизованную селективную среду Эндо, приготовленную по 5.3.3. разлитую в чашки Петри по ГОСТ 26670.

При посеве методом мембранной фильтрации освобождение от двуокиси углерода и нейтрализацию напитка не проводят.

6.3.1.2    Метод прямого посева

Посев продукта проводят в жидкую селективную среду Кесслер с лактозой, приготовленную по 5.3.2. Соотношение между количеством высеваемого продукта и питательной средой 1:9. а для среды двойной концентрации 1:1.

Перед посевом напитка в среду Кесслер его освобождают от двуокиси углерода по ГОСТ 26669 (2.6.8) и нейтрализуют стерильным раствором гидроокиси натрия для предотвращения резкого снижения pH среды Кесслер (на 0,5 и более).

Значение pH среды Кесслер при посеве в нее продукта доводят до допустимых значений стерильным раствором гидроокиси натрия или при приготовлении среды pH устанавливают выше заданного с учетом его последующего значения при внесении продукта. Количество добавляемого раствора гидроокиси натрия или величину, на которую необходимо увеличить pH при приготовлении питательной среды, устанавливают опытным путем.

6.3.1.2.1    Нормируемый объем пробы напитка (100 см³) засевают в среду Кесслер с лактозой двойной концентрации. разлитую по 100 см ' во флаконы с поплавком.

6.3.1.2.2    Нормируемый объем пробы концентрата для напитка в потребительской таре (1 г/см') помешают в пробирку с 9 см³ стерильной питьевой воды, перемешивают и засевают в пробирку с 10 см³ среды Кесслер двойной концентрации с поплавком.

6.3.1.2.3    Квас брожения, приготовленный на чистых культурах, в количестве 1.0 см' (нормируемый объем) засевают в пробирку с 9 см' среды Кесслер с поплавком.

6.3.1.2.4    Для посева кваса брожения, приготовленного на хлебопекарных дрожжах, делают разведение по ГОСТ 26669: 1 см³ кваса разводят в 9 см' стерильной питьевой воды (разведение 1:10). Из разведения берут I см' (что соответствует нормируемому объему кваса — 0.1 см*), засевают в пробирку с 9 см ' среды Кесслер с поплавком.

6.3.1.3    Посевы на средах Эндо и Кесслер инкубируют при температуре (36 ± 1)°С в течение 24 — 48 ч. Чашки Петри с посевами инкубируют дном вверх. Посевы просматривают через (24 ± 3) ч. отмечают положительные результаты посевов в среду Кесслер, а окончательный учет проводят через (48 ± 3) ч.

Положительными результатами посева в среду Кесслер считают посевы, в которых имеет место интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды, образовании газа.

6.3.1.4    Дш подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на среде Кесслер, к колиформным бактериям делают пересевы по ГОСТ 26670 на поверхность среды Эндо, приготовленную по 5.3.3. Посевы инкубируют при температуре (36 ± 1) ‘С в течение (24±3) ч.

6.3.1.5    Посевы на среде Эндо по 6.3.1.1 и 6.3.1.4 после инкубирования просматривают и отмечают рост типичных колоний для бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) — красных с металлическим блеском или без него, розовых и бледно-розовых. Типичные колонии для колиформных бактерий имеют отпечаток на обратной стороне фильтра или на среде Эндо после снятия петлей колонии. Для повышения дифференцирующих свойств среды Эндо (проявления отпечатков) в нее добавляют 5 %-й спиртовым раствор основного фуксина по 5.2.3.

6.3.1.6    При обнаружении на чашках со средой Эндо мелких бесцветных колоний, подозрительных на возбудителей кишечных инфекций, микробиолог лаборатории должен указанные чашки передать в лабораторию санитарно-эпидемиологической станции для дальнейшего изучения но ГОСТ 30519.

6.3.1.7    При необходимости подтверждения принадлежности выросших колоний микроорганизмов на среде Эндо к колиформным бактериям из колоний приготовляют препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей минимальное количество культуры из исследуемой колонии, не размешивая в воде. Затем вносят петлей каплю реактива I. приготовленного но 5.2.1. Смесь распределяют на участке площадью примерно 1 см², просушивают при 20 ‘С и фиксируют, медленно пронеся предметное

208

1

11а территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51935-2002.

2

С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. Па территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.

3

Па территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52816-2007.

*⁴ На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52814-2007.

202