ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

(Сборник нормативных материалов)

Москва, 1994 г.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

(Сборник нормативных материалов)

Москва, 1994 г.

Сосуды, содержащие афлатоксины подлежат обозначению «Яд» и в целях предупреждения загрязнения рабочего места должны находиться в стаканах или других емкостях. Рабочее место с той же целью нужно покрыть л истом фильтровальной бумаги, которая после работы переносится в герметичный мешок или контейнер для последующею сжигания.

В случае попадания афлатоксина на лабораторное оборудование и предметы, их детоксикацию следует проводить тщательной обработкой 5 или 10% раствором хлорамина, а затем 1% раствором NaHCOj.

Работать с афлатоксинами следует в халате, марлевой маске, клеенчатом фартуке и резиновых перчатках. Перчатки и фартук после работы необходимо обработать раствором хлорамина и тщательно промыть в проточной воде.

В случае попадания афлатоксинов на открытые участки тела, в глаза, на слизистую рта и носа, необходимо их немедленно и тщательно смыть 1% раствором борной кислоты, а затем проточной водой.

В лабораторных помещениях, где производится работа с афлатоксинами, запрещается курить, принимать пищу и воду.

26

СОДЕРЖАНИЕ

I    МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ    *

1.    Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах методом тех.................................... 3

2.    Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах с

помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии    ...    11

3.    Методика определения афлатоксинов в продуктах животного

происхождения ................................. 19

4.    Методика определения содержания патулииа в фруктовых и

овощных соках и пюре............................ 26

5.    Методика определения мпкотоксина патулииа в продуктах

переработки плодов и овощей ....................... 31

6.    Методика определения зсарпленопл в пищевых продуктах    ....    37

7.    Методика определения дсзоксинивалспола (вомитокспна) в    зерне

и зернопродуктах................................ 41

8.    Методика определения дсзоксинниллснола и зсараленона в зерне

и зернопродуктах ............................... 45

9.    Методика определения Т-2 токсина в пищевых продуктах и

продовольственном сырье.......................... 53

10.    Методика определения охратоксина А в пищевых продуктах ...    57

11.    Методики определения мпкотокеппои: Т-2 токсина, зсараленона

(Ф-2) и охратоксина А............................ 63

II. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ 77

12.    Атомно-абсорбционные методы определения токсинных элементов в пищевых продуктах и пищевом сырье.............. 77

13.    Методика определения мстил-этилмсркурхлорида в пищевых

продуктах, кулннарно обработанных ................... 93

14.    Методика определения содержания общей ртути в пищевых

продуктах методом беспламенной атомной абсорбции....... 97

15.    Методика по определению хрома в овощных консервах...... 103

16.    Методика определения содержания гистамина в рыбопродуктах

(флуоромстричсский метод)......................... 105

17.    Метод выделения, идентификации и количественного определения

гистамина в рыбопродуктах (колориметрический метод)...... ПО

18.    Методика определения нитратов и нитритов в молоке и молочных

продуктах..................................... 114

19.    Методика определения жиратов и нитритов в плодовоощной

консервированной продукции........................ 124

биологических жидкостях .......................... 133

21.    Методика определения остаточных количеств

Эстрадиола-17/? в продуктах животноводства ............. 138

22.    Методика определения антибиотиков тстрациклинового ряда методом тонкослойной хромато<рафии (качественный анализ) ...    142

23.    Методика определения антибиотиков тетрацикл и нового ряда

<]»луоримстричсским методом (количественный анализ) ...... 143

24.    Определение летучих N-нитрозаминов в продовольственном сырье

и пищевых продуктах........................ .    .    .    ]4<з

Брагина И. В., Орехова II. Л- — специалисты лаборатории физико-химических методов исследований Российского Республиканского информационно-аналитического центра.

Под редакцией: Подуповой JI. Г. — заместители Главного государственного санитарного врача РФ, заслуженного врача РФ.

Подписано к печати. 21.11.94.

Формат 60 х 88/16. Бумага офсетная. Уел. псч. л. 9,8. Уел. кр.-огг. 9,8. Тираж 1000 экз. Зак. 220.

Изготовлено в Московской типографии № 11 Комитета по печати РФ. 113105, Москва, ул. Нагатинская, 1,

ВВЕДЕНИЕ

Загрязнение пищевых продуктов токсичными чужеродными веществами является частью глобальной проблемы загрязнения окружающей среды, поэтому в настоящее время очень важным аспектом является определение микропримесей загрязняющих веществ в продуктах питания и снижение их содержания. В последние годы все больший приоритет приобретают исследования по определению таких токсикантов как различные микотоксины (афла-токсины, патулин, зеараленон, вомитоксин, трихотецены и др.), соли тяжелых металлов, нитриты, нитраты, N-нитрозамины и др.

Настоящий сборник включает в себя ранее изданные Методические указания по определению наиболее приоритетных загрязнителей пищевых продуктов, разработанные научно-исследовательскими институтами медицинского профиля и утвержденные Главным санитарно-эпидемиологическим управлением Минздрава СССР и ГКСЭН РФ.

В соответствии с Постановлением Госкомсанэп ид надзора Российской Федерации от 06.02.92 г. № 1 *0 порядке действия на территории Российской Федерации нормативных актов бывшего Союза ССР в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» на всей территории Российской Федерации действуют общесоюзные санитарные правила и нормативные акты впредь до принятия соответствующих нормативных актов Российской Федерации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

Сборник предназначен для санитарно-гигиенических лабораторий центров Госсанэпиднадзора, НИИ и учреждений гигиенического профиля, кафедр гигиены питания медицинских институтов и институтов усовершенствования врачей, а также может быть использован лабораториями других организаций, занимающихся исследованиями пищевых продуктов.

Будем признательны за все критические замечания и пожелания, направленные на улучшение данного Сборника или составление аналогичных Сборников по другим разделам исследований пищевых продуктов.

Л. Г. Подунова

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АФЛАТОКСИНОВ _#

В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Оборудование и материалы

J. Весы технические по ГОСТ 19491-74;

2.    Аппарат для встряхивания жидкостей АВУ-6С по ТУ 264-1-2451-78.

3.    Микроразмельчитель тканей (тип РТ-2) (Одесский экспериментальный завод «ЭМА»).

4.    Баня водяная с электронагревателем МРТУ 42-886-63.

5.    Лабораторный автотрансформатор (ЛАТР).

6.    Мясорубка.

7.    Стеклянная четырехугольная камера для тонкослойной хроматографии (240 х 210 х 100 мм) с притертой крышкой завода «Дружная горка¹, ст. Сиверская, Ленинградская область.

8.    Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833 МРТУ 64-1-1080-63 или аппарат ВИО-1 с фильтром УФС-6).

9.    Насос водоструйный лабораторный стеклянный по ГОСТ 10696-75.

10.    Ротационный испаритель по ТУ 25-11-917-76 (завод «Хим-лабприбор»).

11.    Распылитель стеклянный с грушей.

12.    Термометр 0-100°

13.    Воронка Бюхнера.

14.    Колонка хроматографическая (300 х 20 мм), снабженная на выходе пористым стеклянным фильтром и краном.

15.    Колба Бунзена на 500 мл.

16.    Пипетка Пастера.

17.    Микрошприц МШ-10.

18.    Цилиндры 2-50, 2-100, 2-250, 2-500 по ГОСТ 1770-74.

19.    Чашка фарфоровая на 300 мл.

20.    Воронка стеклянная с диаметром 75 мм по ГОСТ 8613-75.

21.    Колбы плоскодонные конические на 250, 500 мл.

22.    Колбы мерные 2-20, 2-100, 2-250 по ГОСТ 1770-74.

23.    Делительные воронки на 500 мл по ГОСТ 8613-75.

24.    Ножницы.

25.    Бумага фильтровальная (мягкая, для грубых осадков).

26.    Пластина для ТСХ «Силуфол» 15 х 15 см (ЧССР).

27.    Л ипетка измерительная на 0,2; 5; 10 мл по ГОСТ 20292-74Е.

28.    Силикагель ЛСЛ 100-250 мкм (ЧССР).

29.    Колба круглодонная коническая на 500 мл.

30.    Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76.

31.    Хлороформ медицинский или по ГОСТ 3160-51.

32.    Гексан по ТУ 6-09-3375-74.

33.    Метиловый спирт по ГОСТ 6995-77.

34.    Вода дистиллированная.

35.    Натрий хлористый по ГОСТ 4233-77.

36.    Лимонная кислота по ГОСТ 3652-59.

37.    Свинец уксуснокислый по ГОСТ 1027-67.

38.    Сернокислый аммоний по ГОСТ 3769-78.

39.    Бензол для криоскопии или по ГОСТ 5955-75.

40.    Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-74.

41.    Эфир диэтиловый медицинский по ГОСТ 6265-74.

42.    Йод кристаллический ГОСТ 4159-79.

43.    Уксусная кислота (ледяная) по ГОСТ 61-75.

44.    Азотная кислота по ГОСТ 4461-77.

45.    Трифторуксусная кислота по МРТУ 6-09-4769-61.

46.    Ацетон по ГОСТ 2603-79.

НЕКОТОРЫЕ ОБЩИЕ УСЛОВИЯ И ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ АНАЛИЗА

Ряд факторов могут влиять на результат анализа. К ним относится чистота растворителя и посуды, тщательность калибровки и соблюдение условий хранения, характер освещенности в лабораторной комнате и др.

Для получения точных результатов необходимо использовать органические растворители и реактивы самой высокой чистоты. Растворители, длительное время хранившиеся в пластмассовых емкостях, нельзя использовать ввиду возможного их загрязнения.

Посуда, находившаяся в контакте с афлатоксином, подлежит тщательной обработке путем погружения на 12 часов в специальный деконтаминационный раствор следующего состава: 2,5 кг NaOH, 1 кг хлорамина, 100 г стирального порошка, 50 л воды. После такой деконтаминации посуду моют общепринятым способом.

20

ОТБОР ПРОБ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦОВ

Отбор проб продуктов животного происхождения рекомендуется проводить с использованием действующей в настоящее время нормативно-технической документацией на конкретный вид продукта, при определении количества отбираемого образца нужно учитывать особенности каждого продукта. Свежее мясо, субпродукты (печень, почки и др.), колбасы и другие готовые мясные изделия рекомендуется брать в количестве 50 г, молоко, кефир и другие жидкие молочные продукты— 50 мл, сухое молоко —5 г (растворить в 45 мл воды), плотные молочные продукты —50 г. Пробы подлежат немедленному анализу с целью получения данных, точно характеризующих партии продукта в момент контроля.

Указанные навески мяса, мясных изделий, других плотных продуктов разрезают ножом или ножницами на мелкие кусочки, дважды пропускают через мясорубку, затем тщательно гомогенизируют к размельчителе тканей в 40 мл насыщенного раствора лимоннокислого натрия^{2 3}. Для молока, жидких продуктов и биологических сред процесс размельчения исключается.

ЭКСТРАКЦИЯ И ОЧИСТКА

Гомогенат переносят в 500 мл колбу, добавляют 150 мл охлажденного метанола, встряхивают 30 мин. Затем смесь фильтруют через Бюхнеровскую воронку с широкопористой фильтровальной бумагой в колбу Бунзена на 500 мл под вакуумом. Фильтр с осадком осторожно переносят обратно в 500 мл колбу, заливают 60 мл водяного метанола⁴, встряхивают 15 минут и фильтруют. 150 мл объединенного фильтрата переносят в 500 мл колбу, добавляют 10 мл раствора ацетата свинца³'³, 5 г сульфата аммония в 75 мл воды, тщательно перемешивают и помещают в водяную баню при 50° С на 15 минут. После встряхивания в течение 20 минут смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в 250 мл градуированный цилиндр и 160 мл фильтрата переносят в 500 мл делительную воронку. К фильтрату добавляют 50 мл гексана или петролейного эфира, встряхивают 1 минуту и после разделения нижний водно-метаноловый слой переливают в другую делительную воронку на 500 мл. Процедуру повторяют дважды. Затем добавляют 50 мл хлороформа, встряхивают 1 минуту и, после разделения, нижний хлороформный слой сливают в круг-лодонпую колбу с притертой пробкой на 500 мл. Процедуру пов-

торяют трижды. Объединенные хлороформные экстракты концентрируют в чашке на водяной бане при 60—61° С или ротационном испарителе при 40° С до объема около 5 мл.

КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

В хроматографическую колонку на стеклянный фильтр насыпают 5 г безводного сульфата натрия, на образовавшийся слой наливают суспензию силикагеля⁵. После осаждения в колонку осторожно насыпают еще 5 г безводного сульфата натрия. Избыток хлороформа выпускают при помощи крана и сразу же медленно наносят образец. Стенки флакона обмывают двумя 5 мл порциями хлороформа, которые также переносят в колонку по достижении уровнем раствора образца поверхности верхнего слоя сульфата натрия в колонку порциями осторожно наливают 100 мл смеси хлороформ-метанол (97:3). Элюат собирают в 300 мл фарфоровую чашку или круглодонную колбу, концентрируют на водяной бане в чашке при 60—61° С или ротационном испарителе при 40° С до объема 1,5—2,0 мл. Концентрированный раствор переносят в центрифужную пробирку на 10 мл. Остатки смывают со стенок чашки или колбы 3 порциями хлороформа по 2 мл каждая. Объединенный экстракт в пробирке выпаривают досуха⁶. Остаток на дне и стенках пробирки тщательно растворяют в 0,2 мл хлороформа*** и тут же подвергают хроматографии в тонком слое сорбента.

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

1. Подготовка аналитической хроматографической пластины (АХП)

На пластине «Силуфол⁵ (15 х 15 см или 20 х 20) при помощи острого тонкого предмета (иглы, скальпеля и др.) и линейки проводят четкие параллельные линии, делящие слой сорбента на хроматографические дорожки шириной 0,8 см с промежутками между ними 0,2 см. На одной из сторон пластины (край А), соответственно указанным дорожкам, простым карандашом наносят номера исследуемых образцов. На расстоянии 4 см от края противоположной стороны (край Б) и параллельно ему в промежутках между хроматографическими дорожками наносят карандашом пунктирную ли-

нию, обозначающую уровень нанесения образцов (линия старта). Приготовленные таким образом пластины должны быть сухими, для чего их следует хранить в условиях, предупреждающих увлажнение.

2. Нанесение образцов на АХП

Для достижения необходимой точности образцы объемом 20 мкл наносят на хроматографические дорожки с помощью микрошприца. При этом размеры образующихся пятен не должны превышать 3 мм в диаметре. Стандартные афлатоксины наносят на крайние хроматографические дорожки последними.

3. Проявление АХП включает 2 предварительных этапа: обезжиривание эфиром и разделение афлатоксинов

Для обезжиривания пластину, с нанесенными образцами, краем А опускают в камеру с эфиром, толщина слоя которого не превышает 1 см. Используемый эфир должен быть очищен от перекисей на колонке с окисью алюминия. Предварительно камера должна быть насыщена парами эфира, что достигается путем выстилания всей площади ее задней и боковых стенок фильтровальной бумагой и последующей герметизацией в течение 20—30 мин. тщательно притертой стеклянной крышкой. Пластины находятся в закрытой камере до момента, когда фронт растворителя достигнет уровня 0,5 см ниже края Б, после чего ее извлекают и высушивают на открытом воздухе. Процесс обезжиривания повторяют трижды. Затем край Б пластины с концентрированной на нем полосой примесей обрезают, отступая 1,5 см от линии старта (пунктирной линии), и удаляют.

Для разделения афлатоксинов пластинку стартовым краем опускают в ненасыщенную камеру со смесью растворителей хлороформ-ацетон (9:1). Погружение пластины следует проводить быстро, но осторожно без нарушения глади поверхности смеси, чтобы предотвратить смывание пятен афлатоксинов. Пластину оставляют в камере до момента достижения фронтом растворителя противоположного края, после чего ее извлекают и высушивают на воздухе.

Обнаружение и количественное определение афлатоксинов

Проявленную хроматограмму рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение на пластине пятен, соответствующих хроматографической подвижностью и цветом флуоресценции пятнам стандартов свидетельствует о возможном присутствии афлатоксинов в образцах пищевых продуктов.

Для исключения афлатоксиноподобных веществ рекомендуется использовать 3 дополнительных теста.

23

Йодный тест. Проявленная хроматограмма помещается на 30 сек. и эксикатор, насыщенный парами йода^{7 8}. Затем пластину рассматривают под УФ-светом. Изменение цвета интенсивности флуоресценции говорит об отсутствии в образце афлатоксинов.

Тест с азотной кислотой. Проявленную хроматограмму опрыскивают водным раствором азотной кислоты (2:1) и рассматривают под УФ-светом. При этом свечение пятен стандартов меняется на желтый. Если таким же образом меняется свечение пятен образцов, то это указывает на содержание в них афлатоксинов.

Тест с трнфторуксуснон кислотой⁹. На соответствующие дорожки в точки нанесения конечных экстрактов исследуемых образцов и растворов стандартного афлатоксина, осторожно наносят по 1 капле концентрированного раствора Трифторуксусной кислоты. Затем пластины помещают в темное место на 10—15 мин., после чего проводят этап проявления по описанному выше способу. При наличии в экстрактах афлатоксинов появляется дополнительное свечение с уменьшением Rf.

Количественное определение проводят путем сравнения интенсивности флуоресценции пятен афлатоксинов в экстрактах с интенсивностью флуоресценции различных количеств стандартов афлатоксинов, нанесенных на ту же пластину.

Расчет концентрации афлатоксина в продукте следует вести по формуле:

„ УгУзУзЛ

^с~ v₂ v₄ v₆ M'^me-

С — концентрация афлатоксина в мкг/кг или мкг/л;

Vi — объем водно-метаноловой смеси в мл

— (для свежего мяса и субпродуктов — 232, для готовых мясных изделий — 200, для молока и жидких молочных продуктов — 250, для плотных молочных продуктов — 200);

V2 — объем водно-метанолового фильтрата, предназначенного для дальнейшего анализа в мл (150);

Уз — объем водно-метанолового фильтрата и раствора уксуснокисло го свинца в мл (235);

V4 — объем водно-метанолового фильтрата после обработки уксус нокислым свинцом и сульфатом аммония в мл (160);

V5 — объем очищенного раствора экстракта в хлороформе перед тонкослойной хроматографией в мкл (100);

Уб — объем раствора экстракта, наносимого на пластину мкл (2);

М — навеска или объем продукта, взятого на анализы г или мл;

А — количество афлатоксина в пятне образца АХП в мг.

При строгом соблюдении объемно-весовых отношений, указанных в приведенной формуле, последнюю можно упростить путем введения коэффициента, учитывающего вес или объем исследуемого образца и динамику его аликвот в процессе анализа. В таком случае формула приобретает следующий вид:

С мкг/кг или мкг/л » К Л, где:

К — коэффициент, имеющий значение:

для свежего мяса и субпродуктов — 0,272

для готовых мясных изделий — 0,195

для молока, жидких продуктов и биологических сред — 0,224

для плотных молочных продуктов —0,195.

Приготовление эталонного раствора из кристаллического афлатоксина Bi

1 мг кристаллического афлатоксина Bi помещают в мерную колбу на 100 мл и добавляют смесь бензол-ацетонитрил (98:2) до метки. 1 мл такого эталонного раствора, содержащего 10 мкл афлатоксина, переносят во флакон на 20 мл и полностью выпаривают растворители. Затем добавляют 20 мл вышеуказанной смеси, закрывают флакон притертой пробкой, в 1 мкл полученного раствора содержится 0,5 нг афлатоксина Вь

Приготовление эталонного раствора из кристаллического афлатоксина Mi

Афлатоксин Mi выпускается обычно в ампулах, содержащих 10 мкг кристаллического препарата. Ампулу вскрывают, содержимое растворяют в 2 мл смеси бензол-ацетонитрил (98:2) и переносят в мерную колбу на 20 мл. Ампулу промывают трижды 3-х мл порциями бензолацетонитрила и растворы объединяют в той же мерной колбе. Колбу заполняют указанной смесью растворителей до метки 20 мл и закрывают притертой пробкой. Таким образом, в 1 мкл эталонного раствора содержится 0,5 нг афла- токсина Mi.

Общие условия и правила работы

Афлатоксины — сильные токсичные и канцерогенные вещества. Поэтому для работы с ними необходимы определенные условия и строгое соблюдение ряда правил.

Исследования, связанные с афлатоксинами, следует проводить в отдельной комнате или в обычной химической лаборатории, имеющей боксовое отделение или настольный бокс. Афлатоксины следует хранить в местах, недоступных для посторонних (в закрывающихся на замок холодильниках или морозильных камерах, вне работы подлежащих опечатыванию).

25

1

   — Методические рекомендации по количественному контролю за содер

жанием а<|щатоксинов в продуктах животного происхождения, утв. М3 СССР И. 10.85 г. № 3942-85

19

2

*    — готовят следующим образом: в 100 мл дистиллированной воды растворяют 40 г натрии хлор 4,8 г лимонной кислоты, перемешивают, подогревая

*⁴ —раствор содержит на 100 мл: 50 мл метанола и 50 мл насыщенного раствора лимоннокислого натрия

3

   ³ — в 1 л воды содержится 150 г уксуснокислого свинца

4

— готовится из 10 г силикагеля (100—250 мкн) на 20 мл хлороформа

*    ⁵ — выпаривание лучше проводить в токе азота с использованием пастеровского капилляра, погруженного в экстракт

5

   ^{5 5} — пробирку плотно закрывают пробкой для предупреждения выпаривания

6

растворителя

7

— для насыщения на дно эксикатора насыпают 2—3 г кристаллического

пода

8

⁸    —    достаточно специфичен, основан на переводе афчатокспнов в полуа-

9

цетальные <|юрмы

24