Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

3.1. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Порядок организации и проведения индикации патогенных биологических агентов, в том числе неустановленного систематического положения

Методические рекомендации МР 3.1.0129—18

Издание официальное

Москва • 2019

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

3.1. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Порядок организации и проведения индикации патогенных биологических агентов, в том числе неустановленного систематического положения

Методические рекомендации МР 3.1.0129—18

-    идентификацию культур возбудителей неустановленного систематического положения осуществляют с использованием расширенного спектра методов, включая морфометрический, молекулярно-генетический, масс-спектрометрический и другие виды анализа;

—    идентификация выделенных вирусов проводится электронномик-роскоиическими, иммунологическими и молекулярно-генетическими методами.

3.3.11. При выделении культуры микроорганизма, предположительно являющегося этиологическим агентом Болезни или агентом при преднамеренном применении ПБА, определяют его чувствительность к антибактериальным препаратам, при необходимости проводят фрагментарное или полногеномное секвенирование.

3.4. Характеристика методов индикации и идентификации, используемых в лабораториях Центров индикации, Опорных баз Центров индикации и лабораториях МК СПЭБ

3.4.1.    Обязательными методами индикации являются МФА, ПЦР, ИФА и РИГА.

МФА - сочетает иммунологическое и морфологическое исследование с люминесцентным анализом. МФА отличается высокой специфичностью. Чувствительность составляет 5 х 10⁵ м.к./мл пробы. В лабораториях Центров индикации и их Опорных баз, в том числе лабораториях МК СПЭБ при проведении индикации используют прямой метод флуоресцирующих антител с контрастированием неспецифического свечения альбумином, меченным производными родамина. Непрямые модификации используются для идентификации культур возбудителей.

3.4.2.    ПЦР - метод многократного избирательного копирования определенного участка ДНК при помощи ферментов в условиях in vitro. ПЦР позволяет детектировать фрагменты генома бактериальных, микотических и вирусных патогенных биологических агентов, в том числе с измененными фенотипическими свойствами, труднокультивируемые, некультивируемые и др. ПЦР отличает высокая чувствительность 1 х 10³—1 х 10⁴ м.к./мл и специфичность. Для проведения анализа с помощью данного подхода не требуется предварительное культивирование исследуемого материала.

3.4.3.    ИФА - метод позволяет выявлять как антигены, так и антитела к возбудителям инфекционных болезней, а также определять соотношение IgG и IgM, авидность IgG, что дает возможность дифференциации острой и хронической форм заболевания, характеризуется высокой чувствительностью (1 х 10⁴—1 х 10⁵м.к./мл), специфичностью и экс-прессностью.

3.4.4.    РИГА - метод позволяет выявлять как антигены, так и антитела к возбудителям инфекционных болезней. Постановку реакции осуществляют с использованием эритроцитарных коммерческих иммуноглобулиновых диагностикумов. Чувствительность РИГА (РАО) 1 х 10⁵— 1 х Ю⁶ м.к./мл пробы (0,5 мкг токсинов).

3.4.5.    ИХ А - (экспресс-диагностика ПБА) основан на принципе вертикально направленной иммунохроматографии и предназначен для выявления специфических иммуноглобулинов или антигенов возбудителей.

3.4.6.    Полный бактериологический анализ - выделение, идентификация культуры возбудителя с использованием всего комплекса методов (расширенная характеристика ПБА) включает определение:

-    культуральных свойств;

-    тинкториальных свойств;

-    биохимической активности;

-    антигенных свойств;

-    вирулентности и токсигенносги;

-    чувствительности к антибактериальным препаратам.

Для выделения культур возбудителей инфекционных болезней используют: универсальные среды - для культивирования широкого спектра микроорганизмов и высокопитательные среды с витаминными добавками - для труднокультивируемых. Селективные среды применяют для выделения возбудителя из материала, содержащего сопутствующую микрофлору.

3.4.7.    Масс-спектрометрия (МС) - метод идентификации микроорганизмов, основанный на получении информации о структуре и молекулярном весе биомолекул (рибосомальные и др. белки, пептиды, олигонуклеотиды), за счет измерения отношения массы заряженных частиц вещества к их заряду. МС-технологии, позволяющие получать уникальные для каждого вида ПБА масс-спектры, характеризуются высокой специфичностью, чувствительностью, скоростью анализа. Для идентификации микроорганизмов используют базы данных характеристических масс-спектров (действующие и/или постоянно обновляющиеся).

3.4.8.    Фрагментарное секвенирование - метод определения нуклеотидной последовательности участков генома микроорганизмов. Для идентификации ПБА бактериальной природы можно использовать секвенирование фрагмента или полной последовательности гена 16S рРНК или других генов жизнеобеспечения, микозов - D2 сегмента гена большой субъединицы рибосом, вирусов - консервативные участки генома. Для проведения анализа, где в качестве ДНК-мишеней выбраны гены

16S рРНК и D2 сегмента рибосом, могут быть использованы коммерческие наборы реагентов и базы данных нуклеотидных последовательностей этих участков. Метод может быть использован для подтверждения положительных результатов исследований методом ПЦР. Метод характеризует высокая специфичность.

3.4.9.    Полногеномное секвенирование и анализ результатов по международным и национальным базам данных нуклеотидных последовательностей позволяет идентифицировать ПБА на основании выявления уникальных генетических детерминант. Метод характеризует высокая специфичность.

3.4.10.    Риботипирование - метод идентификации микроорганизмов на основании количества и расположения в геноме патогена рибосо-мальных оперонов. Для проведения анализа может быть использована автоматизированная система Riboprinter и база данных рибопринтов, специфичных для широкого круга микроорганизмов. Метод характеризует высокая специфичность.

5.5. Оценка и представление результатов индикации и идентификации

3.5.1.    Предварительный положительный ответ может быть выдан на основании положительных результатов исследования (обнаружение маркеров ПБА) нативного материала с помощью экспресс- и ускоренных методов через 2—6 часов при использовании МФА, ИФА (РИГА), 6—8 часов - ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, 8—12 часов - ПЦР с электрофоретической детекцией результатов. Предварительный положительный ответ может быть дан как в случае положительных результатов по всем используемым методам, так и при получении положительных результатов в одном-двух методах.

3.5.2.    При получении сомнительных результатов анализа предварительный ответ не выдают, проводят повторное исследование исходного нативного материала (для исключения ошибок на всех этапах исследования, включая подготовку проб) и, при необходимости, секвенирование полученных фрагментов ДНК/кДНК.

3.5.3.    При получении несовпадающих результатов в случае использования разных методов индикации вопрос о выдаче предварительного ответа решается в каждом случае отдельно с учетом чувствительности метода и эпидемических предпосылок.

3.5.4.    При получении отрицательных результатов исследований нативного материала методами экспресс- и ускоренной диагностики выдают предварительный отрицательный ответ, исследование продолжают.

3.5.5.    Положительный ответ, полученный на основании методов индикации: ПЦР и/или комплекса иммунологических методов (МФА, ИФА, РИГА) - может служить основанием для проведения противоэпидемических мероприятий с учетом анализа эпидемиологической ситуации.

3.5.6.    Окончательный ответ выдают после получения результатов полного микробиологического (вирусологического) анализа или, в случае невозможности выделения культуры, после подтверждения результатов экспресс- и ускоренной диагностики на базе Референс-центра по соответствующей нозологии или Центра верификации диагностической деятельности.

3.5.7.    По результатам исследования материала оформляют протокол исследования, а в случае выделения культуры микроорганизма и проведенной идентификации возбудителя - паспорт штамма.

3.5.8.    Выделенные штаммы направляют в Референс-центр по соответствующей нозологии и Центр верификации диагностической деятельности, осуществляющий функции Государственной коллекции Роспотребнадзора, которые проводят их изучение. Полученные результаты вносят в открытые экспертные базы данных микробиологических анализаторов, секвенированные нуклеотидные последовательности при необходимости депонируют в установленном порядке в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank), риботипы, данные морфометрического анализа, масс-спектры вносят в учрежденческие и ведомственные базы данных.

3.5.9.    Информация о результатах исследования передается в учреждение, направившее материал, в Управление Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации, Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

IV. Требования биологической безопасности при проведении исследований патогенных биологических агентов, в том числе неустановленного систематического положения

4.1.    Индикацию и идентификацию патогенных биологических агентов неустановленного систематического положения целесообразно организовать в учреждении на базе одного подразделения с соблюдением принципа поточности.

4.2.    Все виды работ с необеззараженным материалом проводят в БМБ III или БМБ II класса защиты с использованием средств индивидуальной защиты в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами по безопасности работы с микроорганизмами I—IV групп патогенности.

4.3.    Выделение ДНК/РНК из проб клинического материала, подозрительного на зараженность неизвестным ПБА, для проведения ПЦР осуществляют методом, предусмотренным для материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) вирусом натуральной оспы. При исследовании проб из объектов окружающей среды готовят две аликвоты. Из первой аликвоты выделение ДНК/РНК проводят методом, предусмотренным для обработки материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) вирусом оспы. После исключения наличия в материале вирусов I группы патогенности из второй аликвоты проводят выделение ДНК/РНК методом, предусмотренным для обработки материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) бактериями II—IV групп патогенности, образующими споры.

4.4.    Дезинфицирующие средства используют в соответствии с требованиями санитарных правил «Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности)», приложение 1 «Режимы обеззараживания различных объектов, зараженных патогенными микроорганизмами».

V. Порядок организации и проведения работ по забору материала

5.1. Общие требования

5.1.1.    Во всех случаях выявления больного (трупа) с подозрением на инфекционное заболевание информация должна быть направлена экстренно, в установленном порядке. В Центр индикации возбудителей инфекционных болезней I—II групп патогенности и обеспечения противоэпидемической готовности, курирующий данную территорию информацию о выявления больного (трупа) с подозрением на инфекционное заболевание передает Управление Роспотребнадзора в субъекте Российской Федерации.

5.1.2.    В медицинской организации, куда госпитализирован больной с подозрением на болезнь или заражение возбудителем неизвестной Болезни, отбор проб клинического материала осуществляют медицинские работники стационара с соблюдением требований санитарно-эпидемиологических правил по безопасности работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности) и прошедшие подготовку по вопросам особо опасных инфекционных болезней:

-забор материала осуществляют с использованием укладки универсальной (комплекта медицинского для забора проб) в присутствии и под руководством специалистов, подготовленных по вопросам диагностики особо опасных инфекций, обученных правилам биологической

безопасности при работе с материалом, подозрительным на заражение возбудителягми инфекционных болезней I—II групп патогенности, окончивших соответствующие курсы профессиональной подготовки, или специалистов противочумных учреждений;

-    используют следующие средства индивидуальной защиты: противочумный костюм I типа или его аналог, разрешенный к применению в установленном порядке, противопылевой респиратор с фильтрующими элементами, плотно прилегающие очки либо полнолицевая маска или фильтрующий противогаз с противоаэрозольной или комбинированной коробкой в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями, две пары латексных перчаток, резиновые сапоги или непромокаемые прорезиненные высокие бахилы;

-    образцы клинического материала отбирают в герметично закрывающиеся промаркированные стерильные контейнеры или пробирки (при необходимости, с транспортными средами), соответствующие требованиям санитарных правил, с использованием стерильных одноразовых инструментов Емкости с образцами биологического материала, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, герметизируют парафинизированной пленкой (парафилмом), помещают в полиэтиленовый пакет с застежкой. Затем упаковывают с соблюдением принципа «тройной» упаковки. Для этого первичные контейнеры помещают внутрь дополнительного пластикового (металлического) контейнера с завинчивающейся крышкой (вторичный контейнер), в котором находится адсорбирующий влагу материал (марля, вата), в количестве, достаточном для впитывания всей жидкости в случае повреждения первичного контейнера. Вторичный контейнер помещают во внешний (третичный) контейнер - герметичный кейс, который используется для защиты вторичного контейнера. При необходимости упакованная проба может быть помещена в транспортную сумку с хладоэлементом.

Для фиксации контейнеров в кейсе используют при необходимости воздушно-пузырьковую пленку или вставку-штатив. В одном кейсе (третичном контейнере) допускается транспортировка образцов материала от разных пациентов предварительно дважды упакованных.

5.1.3. Образцы секционного материала отбирают медицинские работники иатологоанатомических отделений (или БСМЭ), прошедшие подготовку по вопросам биологической безопасности, в присутствии и под руководством специалиста по особо опасным инфекциям, освоившим методы безопасной работы с ПБА I—II групп Отбор и упаковку проб секционного материала осуществляют в соответствии с пунктом 5.3 настоящих методических рекомендаций.

5.1.4. Упаковку и транспортировку проб осуществляют в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I—IV групп патогенности.

5.2 Материал для исследования на наличие возбудителей неустановленного систематического положения, при тяжелом течении Болезни и отсутствии известных предрасполагающих факторов

5.2.1.    Забор материала от больных людей должен производиться предпочтительно до начала антибактериальной (противовирусной) терапии.

5.2.2.    При остром начале лихорадки, наличии любых двух из нижеперечисленных симптомов: геморрагическая или пурпурная сыпь, носовое кровотечение, кровохарканье, наличие крови в стуле, другой геморрагический симптом, а также отсутствии известных предрасполагающих факторов (синдром острой геморрагической лихорадки), лабораторному исследованию подлежат: кровь, смывы из носоглотки, содержимое везикул, пустул, язв, СМЖ, моча и секционный материал (головной мозг, мозговые оболочки, паренхиматозные органы).

5.2.3.    При остром начале диареи, тяжелом течении болезни и отсутствии известных предрасполагающих факторов (синдроме острой диареи), лабораторному исследованию подлежат: испражнения, ректальные мазки, рвотные массы, промывные воды желудка, перитонеальный выпот (при наличии), желчь, кровь, сыворотка крови и секционный материл (фрагменты и содержимое кишечника, фрагменты печени, почки, селезенки, поджелудочной железы, мезентериальные лимфатические узлы).

5.2.4.    При остром лихорадочном заболевании с сыпью, или другими кожными проявлениями, а также при отсутствии известных предрасполагающих факторов (острый дерматологический синдром), лабораторному исследованию подлежат: кровь, содержимое везикул, пустул, язв, смывы из носоглотки, СМЖ, моча, секционный материал (головной мозг, мозговые оболочки, паренхиматозные органы, лимфатические узлы).

5.2.5.    При острой неврологической дисфункции с одним или более из нижеперечисленных симптомов - нарушение ментальной функции, острый паралич, судороги, признаки раздражения менингеальных оболочек, непроизвольные движения, другие неврологические симптомы, а также отсутствии известных предрасполагающих факторов (острый неврологический синдром), лабораторному исследованию подлежат кровь, СМЖ и секционный материал (головной мозг, спинной мозг, мозговые оболочки).

5.2.6.    При остром начале респираторной дисфункции на фоне возникновения острого инфекционного заболевания, тяжелом течении болезни и отсутствии известных предрасполагающих факторов (острый респираторный синдром), лабораторному исследованию подлежат: смывы и мазки из полости носа и ротоглотки, мазки из полости носа и ротоглотки, носоглоточное отделяемое, мокрота, кровь, сыворотка крови, моча, целесообразно включать в исследование аспираты из трахеи, бронхоальвеолярный лаваж, плевральный выпот при возможности их забора; в случае летального исхода - секционный материал: ткань легких, фрагменты трахеи, бронхов, мазки со слизистой дыхательных путей, внутригрудные лимфатические узлы.

5.2.7.    При остром начале желтухи, тяжелом течении болезни и отсутствии известных предрасполагающих факторов (острый желтушный синдром), лабораторному исследованию подлежат, кровь, моча, фекалии, биоптаты печени, а также секционный материал (печень, селезенка).

5.2.8.    При остром лихорадочном заболевании, характеризующемся тремя или более симптомами, касающимися различных систем организма (потеря аппетита и веса, тошнота и рвота, дискомфорт в брюшной полости, потливость и озноб, головная боль и боль в мышцах, сустава*, спине, сыпь), а также при отсутствии известных предрасполагающих факторов (острый «системный» синдром), лабораторному исследованию подлежат: кровь, СМЖ, моча, фекалии, рвотные массы и секционный материал (лимфатические узлы, печень, селезенка).

5.2.9.    При остром начале конъюнктивита с субконъюнктивальными кровоизлияниями или без таковых, и отсутствии известных предрасполагающих факторов (острый офтальмологический синдром), лабораторному исследованию подлежат: кровь, соскобы и смывы с конъюнктивы, мазок из ротоглотки, СМЖ, отделяемое везикул.

5.2.10 От одного больного забирают не менее трех видов клинического материала (в обязательном порядке при всех синдромах забирают кровь) Отбирают не менее двух проб каждого вида материала: одну пробу для проведения первичного исследования методами индикации и бактериологического исследования, вторую - для проведения вирусологического исследования.

5.2.11. При невозможности доставки проб клинического материала в лабораторию в течение 2 часов, его забирают в транспортные среды для бактерий или вирусов (Кери-Блейр, Эймса, двухфазную среду или аналоги) с учетом вида материала, синдромов и предполагаемых методов исследования (приложение 1).

5.3. Отбор проб для исследования из объектов окружающей среды и от лиц, находившихся в зоне поражения в случае преднамеренного применения ПБА

5.3.1.    При подозрении на преднамеренное использование биологических агентов отбор, упаковку и транспортировку проб объектов окружающей среды с места чрезвычайной ситуации (ЧС) осуществляют специалисты Роспотребнадзора, а также других ведомств в соответствии с требованиями нормативно-методических документов по взаимодействию органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением ПБА и опасных химических веществ. Отбор и транспортировка проб осуществляется в соответствии с требованиями действующих нормативных документов.

5.3.2.    Для проведения лабораторных исследований с предполагаемого места ЧС отбирают следующие образцы: почва, воздух, вода, смывы с объектов окружающей среды, смывы с наружных поверхностей зданий, поверхностей и предметов помещений (полы, стены, система вентиляции, мебель и т. д.), транспортных средств, растительности, порошки неясного происхождения, жидкости неясного происхождения, элементы предполагаемого источника ПБА в местах его применения (осколки, оболочки и содержимое биологических боеприпасов, малогабаритного диверсионного снаряжения (контейнеры, пеналы и другие приспособления для заражения почвы и воды), пищевые продукты, продовольственное сырье, фураж и пр.

5.3.3.    От лиц, находившихся в зоне поражения, мазки и смывы из полости носа и ротоглотки забирают работники медицинских организаций.

5.3.4.    Упаковку и транспортировку проб осуществляют в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I—IV ipynn патогенности.

5.4. Условия транспортирования и хранения материала

5.4.1.    Пробы клинического материала и объектов окружающей среды для исследования на наличие неизвестного ПБА в лабораторию Центра индикации (или его Опорной базы) или в лаборатории МК СПЭБ доставляются с участием специалистов по особо опасным инфекциям в соответствии с требованиями санитарных правил.

5.4.2.    Пробы биологического материала транспортируют с соблюдением необходимого температурного режима (приложение 1).

5.4.3. Хранение биологического материала в лаборатории Опорной базы Центра индикации до приезда специалистов противочумных учреждений осуществляют в соответствии с требованиями санитарных правил по безопасности работы с микроорганизмами I—II групп патогенности с соблюдением необходимого температурного режима.

VI. Порядок исследования клинического материала при синдроме острой геморрагической лихорадки

Причиной Болезни с синдромом острой геморрагической лихорадки, характеризующейся острым началом лихорадки, наличием таких симптомов как, геморрагическая или пурпурная сыпь, носовое кровотечение, кровохарканье, наличие крови в стуле, при отсутствии известных предрасполагающих факторов, могут являться вирусы I—II группы патогенности: Эболавирусы, Марбургвирус, вирус Ласса и другие арена-вирусы, вирус лихорадки Рифт-Валли, ККГЛ, вирус денге, желтой лихорадки и другие флавивирусы, хантавирусы, а также возбудители особо опасных инфекционных болезней бактериальной природы: Y pestis, F. tularensis, В. anthracis, энтерогеморрагическая Е. coli (ЭГКП).

Материалом для исследования при синдроме острой геморрагической лихорадки являются кровь, смывы из носоглотки, содержимое везикул, пустул, язв, СМЖ, моча и секционный материал (кусочки головного мозга, мозговых оболочек, паренхиматозных органов).

6.1. Индикация возбудителей, обусловливающих синдром острой геморрагической лихорадки

6.1.1. Световая микроскопия Микроскопия мазков и мазков-отпечатков с использованием окраски по Граму и Романовскому-Гимзе (возбудители бактериальной природы).

6.1.2. Метод флуоресцирующих антител МФА используют при индикации возбудителя чумы в исследуемом материале и после «подращивания» на средах обогащения, а также фла-вивирусов. Приготовление, окрашивание специфическими иммуноглобулинами, просмотр мазков и оценку результатов осуществляют в соответствии с инструкцией по применению препарата. НМФА используют и для обнаружения антител к возбудителям ГЛПС, КГЛ, флавивирусных инфекций.

ББК55.14

П59

П59 Порядок организации и проведения индикации патогенных биологических агентов, в том числе неустановленного систематического положения: Методические рекомендации.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2019.-62 с.

ISBN 978-5-7508-1689-7

1.    Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е. Б. Ежлова, Ю. В. Демина, И. Д. Пакскина, 3. М. Омариев), Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора (И. Н. Шарова, Е. С. Казакова, С. А. Щербакова, Т. Ю. Красовская, В. Е. Кук-лев, С. А. Портенко, Н. А. Осина, А. С. Абдрашитова, И. А. Касьян, И. Г. Карнаухов, О. В. Кедрова, В. В. Кутырев), Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (А. Н. Куличенко, О. В. Мапецкая, А. Г. Рязанова, А. С. Волынкина), Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (С. В. Титова, О. С. Чемисова, Э. А. Москвитина, Л. Л. Трухачев, Н. В. Павлович, С. О. Водопьянов, А. С. Водопьянов, А. Б. Мазрухо, Р. В. Писаное), Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (С. В. Балахонов, О. Д. Захлебная, Л. В. Миронова, А. К. Носков, М. Ю. Шестопалов), Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (Г. А. Ткаченко, Н. П. Храпова, И. Б. Захарова, Л. В. Лемасова, Ю. А. Кузютина, А. М. Маркин, Т. Н. Шаров, И. М. Шпак, Д. В. Викторов, А. В. Топорков), Федеральным бюджетным учреждением науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора (И. А. Дятлов, М. В. Храмов, Е. А. Тюрин, Л. В. Чекан, Г. А. Богун,

A.    А. Кисличкина), Федеральным бюджетным учреждением науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Р. А. Максютов, О. В. Пьянков, С. А. Боднев, В. В. Золин, О. П. Оськина, В. А. Терновой, Е. В. Гаврилова, А. П. Агафонов), Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Противочумный центр» Роспотребнадзора (А. А. Лопатин, С. М. Иванова, В. Е. Без-смертный). Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения «Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (В. Ю. Ананьев,

B.    В. Мордвинова).

2.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 31 мая 2018 г.

3.    Введены впервые.

ББК 55.14

© Роспотребнадзор, 2019

6.1.3. Полимеразная цепная реакция

ПЦР используют для индикации вирусов: Эболавирусы, Марбург-вируса, вирус Ласса и другие аренавирусы, вирус лихорадки Рифт-Валли, ККГЛ, вирус денге, желтой лихорадки и другие флавивирусы, хантавирусы, а также возбудителей особо опасных инфекционных болезней бактериальной природы: Y. pestis, F. tularensis, В. anthracis, энте-рогеморрагическая Е. coli (ЭГКП).

Исследования проводят в соответствии с требованиями действующих нормативно-методических документов и инструкций по применению препаратов по следующей схеме:

-    выделение ДНК/РНК;

-    проведение ОТ-ПЦР с использованием диагностических наборов для выявления РНК-содержащих вирусов I—II группы патогенности (приложение 2, приложение 3);

-постановка ПЦР для выявления ДНК возбудителей особо опасных инфекционных болезней бактериальной природы.

6.1.4. Иммуноферментный анализ и другие иммуносерологические реакции.

Сыворотку крови исследуют с целью выявления специфических антител классов М и G и/или антигенов к Эболавирусам, вирусам II группы патогенности и возбудителям особо опасных инфекционных болезней бактериальной природы.

6.2. Бактериологический анализ

Бактериологический анализ проб клинического материала проводят с целью выделения, идентификации культуры возбудителя бактериальной природы, вызывающего острый геморрагический синдром, и определения его чувствительности к антибактериальным препаратам.

6.2.1. Для выделения культур возбудителей Болезни с синдромом острой геморрагической лихорадки используют следующие питательные среды:

-питательные среды для культивирования и выделения чумного микроба (сухая ЧПС);

-    Ft-агар и (или) набор реагентов для культивирования и выделения туляремийного микроба сухой с глюкозо-витаминной и ингибиторной добавками к питательной среде;

-    питательный бульон для культивирования микроорганизмов широкого спектра (мясо-нептонный бульон, Хоттингера и др.);

-питательный агар для культивирования микроорганизмов широкого спектра (мясо-пептонный агар, Хоттингера и др.);

Содержание

I. Область применения........................................................................................4

II.    Общие положения..............................................................................................5

III.    Порядок организации и проведения работ в лабораториях Центров индикации, Опорных баз Центров индикации и лабораториях

МК СПЭБ...........................................................................................................6

IV.    Требования биологической безопасности при проведении

исследований патогенных биологических агентов, в том числе неустановленного систематического положения.........................................13

V.    Порядок организации и проведения работ по забору материала.................14

VI.    Порядок исследования клинического материала при синдроме

острой геморрагической лихорадки...............................................................19

VII.    Порядок исследования клинического материала при синдроме

острой диареи..................................................................................................22

VIII. Порядок исследования клинического материала при остром

дерматологическом синдроме...................................................................25

IX.    Порядок исследования клинического материала при остром

неврологическом синдроме............................................................................29

X.    Порядок исследования клинического материала при остром

респираторном синдроме................................................................................31

XI.    Порядок исследования клинического материала при остром

желтушном синдроме......................................................................................34

XII.    Порядок исследования клинического материала при остром

«системном» синдроме...................................................................................36

XIII.    Порядок исследования клинического материала при остром

офтальмологическом синдроме......................................................................39

XIV.    Порядок исследования проб из объектов окружающей среды и от

лиц, находившихся в зоне поражения в случае преднамеренного применения ПБА.............................................................................................41

Приложение 1. Условия забора, транспортирования и хранения материала для проведения исследований на наличие патогенных биологических агентов неустановленного систематического

положения.......................................................................................49

Приложение 2. Схема выявления и идентификации ПБА с неустановленным

систематическим положением.......................................................53

Перечень сокращений и определений.....................................................................54

Нормативные и методические документы..............................................................55

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

31 мая 2018 г.

3.1. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Порядок организации и проведения индикации патогенных биологических агентов, в том числе неустановленного систематического положения

Методические, рекомендации МР 3.1.0129—18

I. Область применения

1.1.    Настоящие методические рекомендации определяют порядок организации индикации патогенных биологических агентов, в том числе неустановленного систематического положения (неизвестного ПБА), в Центрах индикации возбудителей инфекционных болезней I—II групп патогенности и обеспечения противоэпидемической готовности на базе противочумных учреждений (далее - Центр индикации). Опорных баз Центров индикации возбудителей инфекционных болезней I—II групп патогенности ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъектах Российской Федерации (далее - Опорная база Центра индикации) и лабораториях мобильного комплекса специализированной противоэпидемической бригады (далее - МК СПЭБ) Роспотребнадзора, функционирующих на базе ФКУЗ «Противочумный институт» Роспотребнадзора.

1.2.    Методические рекомендации определяют основные принципы индикации и лабораторной диагностики инфекционных болезней с тяжелым клиническим течением и (или) неясной клинической картиной, возбудителями которых могут быть в том числе и микроорганизмы неустановленного систематического положения (новые, ранее не известные, атипичные), схему лабораторной диагностики, номенклатуру и объем исследований, требования биологической безопасности при проведении работ.

1.3. Методические рекомендации предназначены для специалистов органов и учреждении Роспотребнадзора, научных и медицинских организаций.

II. Общие положения

2.1.    Задачи и функции Центра индикации определены приказом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 01.12.2017 №1116 «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации», задачи и функции СПЭБ определены приказом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 24.03.2015 №231 «О деятельности специализированных противоэпидемических бригад, сформированных на базе противочумных институтов Роспотребнадзора».

Установление этиологических факторов опасных инфекционных болезней бактериальной, вирусной, микотической и риккетсиозной природы, болезней с тяжелым клиническим течением и (или) неясной клинической картиной, возбудителями которых могут быть микроорганизмы неустановленного систематического положения а также индикация ПБА в случае преднамеренного применения может осуществлятся в лабораториях Центра индикации, Опорных баз Центра индикации и МК СПЭБ.

2.2.    Для выявления и дифференциации этиологических факторов болезни используют подходы, изложенные в методических указаниях «Порядок эпидемиологической и лабораторной диагностики особо опасных, «новых» и «возвращающихся» инфекционных болезней».

Наличие одной из известных инфекционных болезней можно заподозрить на основании проведения клинико-эпидемиологической диагностики, алгоритм которой изложен в вышеуказанном методическом документе. Если предварительный диагноз поставить не удается, то проводится исследование материала на наличие ПБА неустановленного систематического положения. Поскольку в этом случае при проведении лабораторного исследования необходимо исключение всех известных на текущий момент возбудителей инфекционных болезней, то используют синдромный подход, предложенный ВОЗ (Руководство по сбору клинических образцов во время полевых расследований вспышек. WHO/CDS/CSR/EDC/2000.4).

Основными клиническими синдромами болезней являются: синдром острой диареи, синдром острой геморрагической лихорадки, ост-

рый желтушный синдром, острый неврологический синдром, острый респираторный синдром, острый дерматологический синдром, острый офтальмологический синдром, острый «системный» синдром. Для каждого из вышеуказанных острых синдромов существует перечень инфекционных болезней различной этиологии, для которых данный синдром может являться ведущим. В то же время, многие инфекционные болезни имеют не одну, а несколько клинических форм, каждая из которых характеризуется определенным синдромом. Наличие у больного одного из вышеуказанных синдромов при отсутствии известных предрасполагающих факторов служит основанием для проведения лабораторного исследования с целью подтверждения или исключения, прежде всего, возбудителей известных инфекционных болезней, которые характеризуются данным синдромом.

В случае отрицательных результатов лабораторных исследований на известные возбудители, требуется дальнейшее проведение исследований с целью выявления ПБА неустановленного систематического положения.

III. Порядок организации и проведения работ в лабораториях Центров индикации, Опорных баз Центров индикации и лабораториях МК СПЭБ

3.1. Номенклатура и объем исследований

3.1.1.    В лабораториях Центров индикации осуществляют индикацию возбудителей опасных инфекционных болезней бактериальной, вирусной, паразитарной, микотической и риккетсиозной природы I—IV групп патогенности, выделение и идентификацию культур микроорганизмов возбудителей инфекционных болезней бактериальной природы I—IV групп патогенности и вирусной природы II—IV групп патогенности для решения следующих задач:

- установления этиологического фактора инфекционного заболевания в целях предупреждения или ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций, предупреждения завоза и распространения опасных инфекционных болезней на территории субъектов Российской Федерации;

-установления этиологического фактора опасных инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы с тяжелым клиническим течением и (или) неясной клинической картиной, возбудителями которых могут быть микроорганизмы неустановленного систематического положения.

3.1.2.    В лабораториях Опорных баз Центров индикации, а также лабораториях МК СПЭБ специалисты противочумных учреждений осу-

ществляют индикацию возбудителен опасных инфекционных болезней бактериальной, вирусной, паразитарной, микотической и риккетсиозной природы Г—IV групп патогенности, для установления этиологического фактора инфекционного заболевания в целях предупреждения и ли ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций, предупреждения завоза и распространения опасных инфекционных болезней на территории субъектов Российской Федерации.

3.1.3. Для выделения вирусов I—II группы патогенности, специалисты Центра индикации, Опорной базы Центра индикации или СПЭБ обеспечивают (по согласованию с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека) передачу материала в Референс-центры по мониторингу или лабораторной диагностике особо опасных вирусных инфекционных болезней (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, ФГУ «48 ЦНИИ МО РФ»). Для проведения вирусологических исследований с целью выделения культуры вирусов III—IV группы патогенности - в Референс-центры, определенные приказом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 01.12.2017 № 1116 «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации». Транспортировку проб осуществляют в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I—IV групп патогенности.

3.2. Основные принципы индикации и лабораторной диагностики

3.2.1.    Основным принципом индикации и лабораторной диагностики является использование единой комплексной схемы анализа (приложение 2), предусматривающей на первом этапе последовательное выявление или исключение маркеров:

-    вирусов I—II группы патогенности;

-    бактерий I—II групп патогенности;

-    микромицетов II группы патогенности;

-    известных возбудителей инфекционных болезней, обусловливающих определенный синдром.

На втором этапе - выделение и идентификацию культур возбудителей неустановленного систематического положения.

3.2.2.    Использование единых методов исследования при проведении индикации ПБА и лабораторной диагностики инфекционных болезней.

3.2.3.    Принцип двухэтапного исследования материала (нативного и после биологического накопления) после исключения наличия маркеров вирусов I—II группы патогенности с использованием методов экспресс-анализа, ускоренной диагностики.

3.2.4.    Использование единой схемы передачи информации о результатах индикации.

3.2.5.    Использование для проведения лабораторных исследований диагностических препаратов, разрешенных к применению в установленном порядке, при их отсутствии - коммерческие незарегистрированные препараты, экспериментальные производственные серии.

3.2.6.    Целесообразно одновременное (параллельное) использование двух-трех методов (ПЦР и МФА; МФА и РИГА; МФА и ИФА и т. д.) для получения наиболее достоверных результатов.

3.2.7.    При отсутствии возможности использования двух методов допускается подтверждение результатов индикации с использованием препаратов разных производителей (серий) или направленных на выявление различных мишеней.

3.3. Схема индикации и лабораторной диагностики

3.3.1.    В соответствии с единой схемой индикации 11БА предусмотрены следующие этапы:

-    прием, сортировка и регистрация проб;

-    первичная обработка проб и подготовка их к исследованию;

-исследование проб нативного материала с помощью комплекса

методов МФА, ПЦР, ИФА.

3.3.2.    При обнаружении в исследуемом нативном материале маркеров вирусов I группы патогенности - ДНК/РНК, антигены, антитела класса М, дальнейшую работу с материалом прекращают. Все пробы упаковывают в строгом соответствии с требованиями в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I—IV групп патогенности.

3.3.3.    Индикацию и идентификацию возбудителей опасных инфекционных болезней вирусной природы при исследовании проб клинического материала и объектов окружающей среды осуществляют с помощью следующих методов:

-    экспресс-диагностика (МФА, ИХА);

-    ускоренная диагностика (ПЦР, ИФА, серологические реакции);

-    выделение вируса на чувствительной биологической модели (выделение вирусов I группы патогенности и неустановленного систематического положения проводят в учреждениях, имеющих разрешение на

деятельность, связанную с накоплением возбудителей особо опасных вирусных инфекционных болезней (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, ФГУ «48 ЦНИИ МО РФ»).

3.3.3.1.    При невозможности установления возбудителя заболевания с использованием существующих ПЦР тест-систем используют дополнительно электронную микроскопию и молекулярно-генетические методы (в том числе секвенирование отдельных фрагментов и полногеномное секвенирование).

3.3.3.2.    Для выделения, идентификации возбудителя и определения его вирулентных свойств осуществляют заражение перевиваемых культур клеток (Vero, СПЭВ), РКЭ и биопробных животных (новорожденные белые мыши-сосунки).

3.3.3.3.    При выделении вируса с неизвестными ранее свойствами и невозможности его систематизировать по результатам секвенирования (нуклеотидной последовательности генома) составляют паспорт штамма с указанием всех полученных характеристик.

3.3.4.    При выявлении в материале генетических маркеров вирусов II—III группы патогенности (вирусов денге, желтой лихорадки и других флавивирусов, вируса лихорадки Рифт-Валли, ККГЛ, хантавирусов, вызывающих геморрагический синдром, и др.) аликвоты проб направляют по согласованию в Референс-центры по соответствующей нозологии для дальнейших вирусологических исследований.

3.3.5.    При отсутствии в исследуемом материале маркеров вирусов I—II группы патогенности - ДНК/РНК, антигены, антитела класса М, проводят исследования с использованием бактериологического и биологического методов.

3.3.6.    Биологическое накопление предусматривает посев исследуемого материала на питательные среды и заражение биопробных животных (возможно заражение биопробных животных с искусственно сниженной резистентностью).

3.3.7.    С целью выделения культуры патогена проводят посев на комплекс питательных сред (дифференциально-диагностических и селективных).

3.3.8.    После биологического обогащения проводят исследование проб методами МФА, ПЦР, ИФА, ИХА для детекции маркеров возбудителей инфекционных болезней бактериальной этиологии.

3.3.9.    При необходимости осуществляют постановку биологической пробы на токсины - заражение белых мышей.

3.3.10.    Идентификация выделенных культур:

- идентификацию культур возбудителей опасных бактериальных инфекционных болезней осуществляют в соответствии с нормативнометодическими документами для каждого вида возбудителя;