МУК 4.2.1890-04
Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам

Методические указания МУК 4.2.1890—04

ББК 52.64 060

060 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания.—М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России. 2004.—91 с.

1.    Разработаны: Центральным научно-исследовательским институтом •эпидемиологи (Н. Л. Семина. С. В. Сидоренко); Государственным научным центром по антибиотикам (С. II. Резван, С. А. Грудинина): Научно-исследовательским институтом антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии (JI. С. Страчунский. О. У. Стецкж Р. С. Коо-лов. М. В. Эйделыитейн): Кафедрой микробиологии и химиотерапии Российской медицинской академии последипломного обра-ювания (Е. А. Ведьмина. Л. Г. Столярова, И. В. Власова); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (3. С. Середа).

2.    Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г. Г. Онищенко 4 марта 2004 г.

3.    Введены взамен «Методических указаний по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков», утв. Заместителем Главного государственного санитарного врача СССР В. Е. Ковшило 10 марта 1983 г. № 2675-83.

ЬЬК 52.64

< Роспотребнадзор, 2004 Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004

МУК 4.2.1890—04

учетом их активности. Расчет навески АБП для приготовления базового раствора проводят по формуле:

т АБтеор, - расчетная (теоретическая) навеска АБП;

С - необходимая концентрация АБП:

I ’„кор. - объём растворителя для растворения теоретической навески: А - активность АБП (количество активного вещества, содержащегося в субстанции).

Взвесить точно расчётное количество порошка практически невозможно. Поэтому готовят близкую к расчётной навеску, а затем пересчитывают количество необходимого растворителя.

Крак-т. - объём растворителя для растворения практической навески: /// АБ_пршт - полученная навеска АБП:

/// АБтеор - расчётная (теоретическая) навеска АБП;

1'тсор. ~ объём растворителя для растворения теоретической навески. В связи с тем. что АБП существенно различаются по растворимости. в ряде случаев возникает необходимость использовать различные вещества для первичного растворения (солюбилизации) препаратов (растворители) и хтя доведения их до заданной концентрации (разбавители). В тех случаях когда растворители и разбавители являются разными веществами, для растворения АБП необходимо использовать минимально возможное количество растворителя.

Отличные от воды растворители и разбавители для отдельных АБП приведены в табл. 1. Основные растворы необходимо хранить при температуре нс выше -20 °С (сроки хранения отдельных АБП при этой температуре существенно различаются). Оптимальными условиями для хранения основных растворов АБП является температура -60 °С и ниже. хтитсльность нс более 6 месяцев. При этом необходимо иметь в виду. что основные растворы бета-лактамных АБП могут терять активность и в более ранние сроки.

После извлечения из холодильника перед открыванием флаконов с основными растворами их необходимо довести до комнатной температуры хтя предотвращения конденсации влаги. Размороженные основные растворы должны быть использованы для приготовления рабочих растворов, повторное замораживание нс допускается. Для приготовления рабочих растворов используется дистиллированная вода.

11

Из рабочих растворов готовят двукратные разведения АБП. При расчетах за основу берется конечная концентрация АБП в питательной среде равная 1.0 мкг/мл (более высокие - 2. 4. 8. ит.д; более низкие -0.5: 0.25: 0.125 и т. д.). При этом реальные концентрации растворов должны учитывать фактор разбавления раствора АБП при приготовлении чашек с плотной питательной средой или при инокуляции. Диапазон двукратных серийных разведений АБП зависит от вида тестируемого микроорганизма. предполагаемой активности АБП и целей исследования.

4.2.2. Метод серийных разведении в бульоне

Различают два основных варианта метода серийных разведений в бульоне: макромстод (пробирочный) и микромстод (при величине конечного объема 0.2 мл и меньше). Область применения макромстода из-за низкой производительности ограничивается случаями необходимости оценки чувствительности единичных штаммов.

Макрометод

Процедура

Тестирование проводят в объеме 1 мл каждого разведения АБП с конечной концентрацией исследуемого микроорганизма примерно 5 х 10⁵ КОЕ/мл.

Питательная среда

Питательный бульон для определения чувствительности разливают по 0.5 мл в каждую пробирку. Количество пробирок определяют необходимым диапазоном разведений АБП и увеличивают на одну для постановки «отрицательного» контроля.

Приготовление серийных разведении АБП (рис. 1)

Рабочий раствор АБП готовят из основного раствора с использованием жидкой питательной среды. Концентрацию рабочего раствора рассчитывают исходя из необходимой максимальной концентрации в ряду серийных разведений, учитывая фактор разбавления препарата при последующей инокуляции. Затем рабочий раствор в количестве 0.5 мл при помощи микропипетки со стерильным наконечником вносят в первую пробирку, содержащую 0.5 мл бульона. Тщательно перемешивают и новым стерильным наконечником переносят 0.5 мл раствора АБП в бульоне во вторую пробирку, содержавшую первоначально 0.5 мл бульона. Эту процедуру повторяют, пока нс будет приготовлен весь необходимый ряд разведений. Из последней пробирки 0.5 мл бульона удаляют.

Таким образом, получают ряд пробирок с растворами АБП. концентрации которых отличаются в соседних пробирках в 2 раза. Одновременно готовят дополнительные ряды серийных разведений АБП для

МУК 4.2.1890—04

тестирования контрольных штаммов. Серия разведений обязательно должна включать в себя пограничные концентрации и допустимые диапазоны МПК для контрольных штаммов.

Приютов.нише 1111оку.пома и инокуляции

Для инокуляции используют стандартную микробную взвесь, эквивалентную 0.5 по стандарту МакФарланда, разведенную в 100 раз на питательном бульоне, после чего концентрация микроорганизма в ней составит примерно 10⁶ КОЕ/мл.

По 0.5 мл инокулюма вносят в каждую пробирку, содержащую по

0.5 мл соответствующего разведения АБП. и в одну пробирку с 0.5 мл питательного бульона без антибиотика («отрицательный» контроль). Конечная концентрация микроорганизма в каждой пробирке достигнет необходимой - примерно 5 х 10^> КОЕ/мл. Инокулюм должен быть внесен в пробирки с разведениями АБП не позднее 15—30 мин с момента приготовления.

Инкубация

Пробирки закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками или металлическим колпачками и все пробирки с тестируемыми штаммами. кроме пробирки «отрицательный» контроль, инкубируют в обычной атмосфере при температу ре 35 °С в течение 16—20 или 20—24 ч (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма). Пробирку «отрицательный» контроль помещают в холодильник при 4 °С. где хранят до учета результатов.

Учет результатов

Для определения наличия роста микроорганизма пробирки с посевами просматривают в проходящем свете. Рост культуры в присутствии АБП сравнивают с референтной пробиркой («отрицательный» контроль). содержащей исходный иноку люм и хранившейся в холодильнике. МПК определяют по наименьшей концентрации АБП. которая подавляет видимый рост микроорганизма.

Микрометод

Преимуществами микромстода является высокая производительность и возможность длительного хранения заранее приготовленных планшет. Тестирование проводят при величине конечного объема 0.2 мл и меньше, что позволяет значительно сократить количество расходных материалов. Методика нс имеет отличий от макрометода, за исключением используемых объемов питательного бульона с разведениями антибиотиков и инокулюма. но требует дополнительного оснащения лаборатории многоканальными пипетками. 96-луночными планшетами хтя иммунологических исследований (с плоским дном) со стерильными крышками.

МУК 4.2.1890—04

ячейке без АБП. За МГЖ принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста исследуемого штамма.

Метод серийных микроразведений в бульоне легко поддается модификациям дтя разработки тест-систем. При использовании тест-систем. разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке, следует пользоваться инструкциями изготовителей.

Контроль качества При постановке методов серийных разведений в бульоне необходимо проводить контроль роста культуры в среде без АБП. Необходимо также контролировать чистоту суспензии микроорганизма, использованной дзя инокуляции, путем высева на нссслсктивныс среды. Каждая партия тестируемых штаммов сопровождается внутренним контролем качества исследования с использованием соответствующих контрольных (референтных) штаммов.

4.2.3. Метод серийных разведении в агаре

Метод серийных разведений в агаре позволяет одновременно определить МПК партии штаммов (от 15 до 30 клинических штаммов + контрольные штаммы, в зависимости от используемой модели инокулятора).

Процедура

Принцип метода заключается в посеве тестируемых микроорганизмов на чашки Петри с агаром, содержащим последовательные двойные разведения антибиотиков. Одновременно проводят тестирование партии клинических штаммов и соответствующих контрольных штаммов. а также контроль роста микроорганизмов на чашках без АБП и контроль чистоты культуры путем высева образцов инокулюма на неселективные питательные среды.

Приготовление серийных разведений АБП Из основного раствора исследуемого АБП готовят рабочий раствор в концентрации, в 10 раз превосходящей максимальную из используемых в конкретном исследовании. Затем готовят серию двукратных раз-ведений рабочего раствора. Таким образом, концентрация АБП в каждом последующем разведении должна быть в 2 раза меньшей, чем в предыдущем. Для приготовления серии разведений используют любые стерильные химически инертные лабораторные емкости с завинчивающимися крышками объемом нс менее 10 мл (дзя удобства размешивания).

Питательная среда Сухую агаризованную питательную среду растворяют и автоклавируют в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещают на водяную баню при 48—50 °С. где выдерживают до достижения указанной температуры.

15

МУК 4.2.1890—04

после чего в них асептически вносят рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора АБП на 9 частей расплавленного агара) и. при необходимости, термо лабильные питательные добавки. Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри, толщина слоя питательной среды должна быть 3—4 мм.

Вторым способом приготовления чашек Петри с агаром, содержащим разведения АБП. является смешивание питательной среды и раствора АБП непосредственно в чашке Петри. Для приготовления стандартных пластиковых чашек диаметром 90 мм необходимо к 2 мл раствора АБП добавить 18 мл разогретого до 50 °С жидкого агара. Чашки предварительно маркируют с указанием препарата и его концентрации. Очень важно тщательно перемешивать агар до того, как он начнет застывать для равномерного распределения АБП по всей толще питательной среды. Перемешивание производят на горизонтальной поверхности последовательно плавными разнонаправленными круговыми движениями чашки. После приготовления чашек агар должен затвердеть в горизонтальном положении. Нельзя резко передвигать, переносить чашки до полного застывания агара.

Параллельно с чашками Петри, содержащими растворы антибиотиков. для контроля роста готовят чашки Петри без антибиотиков. Чашки оставляют при комнатной температуре дзя застывания и подсушивания на 10—12 ч.

Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно, однако допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4—8 °С в течение 5 сут. При этом необходимо иметь в виду, что некоторые бета-лактамные антибиотики (прежде всего, ампициллин, цефаклор. имипснем). особенно при низких концентрациях, нс выдерживают даже указанный срок хранения. В этой связи стабильность антибиотиков в приготовленных в лаборатории чашках Петри целесообразно устанавливать экспериментально с использованием референтных штаммов.

Приготовление ннокулюма и инокуляции

Конечная посевная доза исследуемого микроорганизма на поверхности питательной среды должна составлять 10⁴ КОЕ. Поскольку коммерческие инокуляторы или стандартная бактериологическая петля диаметром 3.0 мм переносят 1—2 мкл жидкости, концентрация микроорганизмов в исходной суспензии должна быть 10 КОЕ/мл. Таку ю концентрацию можно получить при разведении стандартной микробной суспензии, соответствующей стандарту 0,5 по МакФарланду, в 10 раз. Полученную суспензию необходимо иноку лировать на поверхность

МУК 4.2.1890—04

Содержание

1.    Область применения...............................................................................................4

2.    Общие сведения......................................................................................................4

3.    Пока зания для исследования чувствительности микроорганизмов

к антибактериальным препаратам.........................................................................5

4.    Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам...............................................................................7

4.1.    Общая хараюеристика методов.....................................................................7

4.2.    Методы серийных разведений......................................................................10

4.3.    Диско-диффузионный метод (ДДМ)............................................................18

5.    Контроль качества определения чувствительности...........................................21

5.1.    Контроль чистоты роста культуры..............................................................21

5.2.    Контроль качества питательных сред..........................................................21

5.3.    Интегральный контроль качества определения чувствительности...........23

5.4.    Хранение контрольных штаммов.................................................................24

5.5.    Частота проведения контроля качества.......................................................24

6.    Определение чувствительности отдельных групп бактерий к

антибактериальным препаратам и интерпретация результатов.......................25

6.1.11ринципы выбора АБП для тестирования различных видов микроорганизмов и интерпретации результатов..............................................25

6.2.    Определение чувствительности представителей семейства

Enterobacteriaceae..........................................................................................27

6.3.    Определение чувствительности Р. aeruginosa, Pseudomonas spp.,

Acinetobacter spp. и других неферментирующих бактерий (НФБ)...........36

6.4.    Определение чувствительности Staphylococcus spp...................................38

6.5.    Определение чувствительности Enterococcus spp.......................................44

6.6.    Определение чувствительности микроорганизмов со сложными

питательными потребностями.....................................................................47

6.7.    Определение чувствительности Streptococcus spp......................................48

6.8.    Определение чувствительности Haemophilus influenzae............................52

6.9.    Определение чувствительности Neisseria gonorrhotae................................54

7.    Эпидемиологический надзор за резистентностью к антимикробным препаратам....................................................................................................55

Приложение 1. Используемые сокращения............................................................68

Приложение 2. Таблицы 1—10...............................................................................69

Приложение 3. Таблицы 11—19.............................................................................82

Приложение 4. Таблицы 20—23.............................................................................86

3

УТВЕРЖДАЮ Главный государственный санитарный врач Российской Федерации.

Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

4 марта 2004 г.

Дата введения: с момента >тверждсния

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам

Методические указания _МУК    4.2.1890—04_

1. Область применения

1.1.    В настоящих методических указаниях изложены стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (методы серийных разведений и диско-диффузионный метод).

1.2.    Методические указания предназначены для применения в микробиологических лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы и здравоохранения.

2. Общие сведения

Определение чувствительности микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека к антибактериальным препаратам (АБП) - приобретает все более важное значение в связи с появлением и широким распространением антибиотико-рсзнстснтности у бактерий. Стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП (диско-ди(|м|)узнонный и серийных разведений) были разработаны во второй половине 60-х - начале 70-х годов XX века и с тех пор с методической точки зрения нс претерпели принципиальных изменений.

Однако внедрение в клиническую практику значительного количества новых АБП и появление новых механизмов антибиотико-резис-тснтности у микроорганизмов потребовало более строгой стандартизации процедуры тестирования, разработки новых подходов к ннтсрпрс-

4

МУК 4.2.1890—04

тации результатов, внедрения современной системы внутреннего контроля качества на каждом этапе исследования.

В настоящих методических указаниях систематизированы современные подходы к определению чувствительности бактериальных возбудителей инфекционных заболеваний человека, учитывающие рекомендации Европейского комитета по определению чувствительности к антибиотикам, а также Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США.

Исследования чувствительности микроорганизмов к АБП осуществляются для решения следующих задач:

•    обоснование целенаправленной индивидуальной антибактериальной терапии для лечения конкретной инспекционной болезни отдельным пациентам;

•    обоснование эмпирической терапии отдельных нозологических форм инфекционных болезней в пределах лечебных учреждений или географических регионов;

•    осуществление наблюдения за распространением антибнотико-рсзистснтности в отдельных учреждениях или географических регионах;

•    исследование новых химических соединений на наличие антибактериальной активности.

3. Показания для исследования чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам

В ходе повседневной деятельности в бактериологических лабораториях из различных биологических материалов и объектов внешней среды выделяют множество бактерий, относящихся к различным таксономическим группам. Однако определение чувствительности выделенных микроорганизмов к АБП показано далеко не во всех случаях. Определение показаний для исследования чувствительности микроорганизмов к АБП является обязанностью врача-бактсриолога.

Определять чувствительность к АБП представителей нормальной микрофлоры человека, при их выделении из естественных мест обитания. бактерий, выделенных из объектов внешней среды, за исключением случаев проведения специальных исследований, нецелесообразно.

Обязательному исследованию на чувствительность к АБП подлежат все микроорганизмы, выделенные из первично стерильных жидкостей. органов и тканей человека. В остальных случаях оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости выделенного микроорганизма.

Определение чувствительности выделенного штамма микроорганизма показано, если уровень его устойчивости к АБП не может быть

предсказан на основании данных идентификации или вероятной таксономической принадлежности микроорганизма. Практически важной задачей является выявление приобретенной резистентности к АБП у природно-чувствительных к ним микроорганизмов. Подтверждение природной чувствительности или резистентности микроорганизма к АБП нс является целью практических исследований.

Исследованию по оценке антибиотикочувствительности подлежат чистые культу ры микроорганизмов или материал изолированных колоний с плотных питательных сред после первичного посева образца клинического материала, в последнем слу чае параллельно необходимо провести идентификацию ку льту ры.

При обнару жении на плотных питательных средах после первичного посева смешанной культуры исследовать антнбиотнкочу вствн-тсльность до идентификации и оценки этиологической значимости отдельных микроорганизмов нецелесообразно.

Прямое определение чу вствительности с использованием клинического материала (без выделения чистой ку льту ры) возможно только в исключительных случаях при условии подтверждения однородности культуры и высокой степени обсеменен ности при окраске по Г раму, причем исследование следует повторить после выделения чистой ку льтуры микроорганизма.

Следует у делять особое внимание определению чувствительности микроорганизмов, относящихся к таксономическим группам, для которых характерна высокая частота распространения приобретенной резистентности.

У микроорганизмов, проявляющих универсальную чувствительность к каким-либо АБП. т. е. когда слу чаев резистентности нс описано (например. Streptococcus pyogenes - все штаммы чувствительны к пенициллину). проводить определение чувствительности к этим препаратам в повседневной практике нецелесообразно.

Факты выявления резистентности у микроорганизмов, лзя которых этот феномен ранее нс был описан в нау чной литературе, следу ет оценивать с крайней осторожностью и рекомендуется обращаться за консультациями в лаборатории, занимающиеся изучением антибнотико-рсзистснтности.

Нс следует в практических целях исследовать микроорганизмы, хтя которых методы определения чувствительности в настоящее время не стандартизованы и отсутству ют критерии интерпретации результатов. Резу льтаты, полученные в данном случае, нс могут служить основанием для назначения антибактериального препарата, если соответствующая нозологическая форма нс приведена в утвержденной инструкции по его применению.

6

МУК 4.2.1890—04

4. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам

4.1. Общая характеристика методов

Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП подразделяют на методы серийных разведений и диффузионные.

Методы серийных разведений основаны на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность АБП - величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК).

МПК - минимальная концентрация, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной среде.

Для определения МПК заданные концентрации АБП вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро- и мнкроразведсний.

Разновидностью метода серийных разведений является также метод. основанный на использовании только двух концентраций АБП. соответствующих пограничным значениям МПК (см. ниже). Этот принцип исследования широко используется в автоматизированных системах для определения чувствительности микроорганизмов.

Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии АБП из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация АБП превосходит МПК.

В настоящее время существуют две основные модификации диффузионного метода: диско-диффузионный и Е-тсст.

В диско-диффузионном методе в качестве носителя АБП используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии АБП из носителя в питательную среду. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК. Однако диско-диффузионный метод позволяет лишь косвенно судить о величине МПК. а результатом исследования является отнесение микроорганизма к одной из категорий чувствительности (чувствительный, промежуточный или резистентный).

7

Е-тест представляет собой узкую полоску полимера (0.5 х 6.0 см), на которую нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация АБП. диффундирующего из носителя, выше МПК. при этом образуется каплевидная зона ингибиции. Значения концентрации АБП в каждом участке носителя типографским способом нанесены на наружной (обращенной к исследователю) поверхности Е-теста. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотну ю подходит к носителю. Детальные инструкции по определению чувствительности с использованием Е-тсстов прилагаются изготовителем к набору реактивов.

4. /. I. Основные этапы проведения тестирования

Оценка антибиотикочувствительности. независимо от конкретного метода, предполагает последовательное выполнение нескольких этапов:

•    приготовление питательных сред:

•    приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (иноку-люма);

•    инокуляция:

•    инкубация:

•    учет и интерпретация результатов, формулировка рекомендаций по лечению.

Диффу зионные методы включают также этап наложения дисков или полосок Е-тсста на плотную питательну ю среду.

4. /. 2. Приготовление питательных сред для определения чувствительности

Для оценки чувствительности используют специально предназначенные для этой цели среды, разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке и по своим характеристикам удовлетворяющие требованиям, приведенным в разделе 5. Внутрилабора-торный контроль качества среды проводят при использовании всех сред, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

Вид питательной среды для оценки чувствительности определяют выбранным методом проведения исследования (агар или бульон), а также видом тестируемого микроорганизма.

Выбранную питательную среду хтя определения чувствительности готовят из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду сразу же разливают в стерильные пробирки или в чашки Петри, или (если необходимо) колбы со средой помещают на водяну ю баню при

МУК 4.2.1890—04

48—50 °С. где выдерживают до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят термолабильные питательные добавки и/или рабочие растворы антибиотиков, а затем разливают в пробирки или в чашки Петри.

Агар разливают по чашкам слоем толщиной 4 мм (на чашку диаметром 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку' диаметром 90 мм -20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при 4—8 °С в течение 5 суток.

4.1.3. Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов

(инокулюма)

Общим и принципиально важным для всех методов тестирования является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма, ее концентрация должна составлять 1.5 х 1()⁸ КОЕ/мл. Практически наиболее приемлемым методом оценки концентрации бактериальной суспензии является измерение ее оптической плотности. Оптическая плотность бактериальной суспензии с концентрацией 1.5 х 10^s КОЕ/мл при визуальном контроле соответствует стандарту мутности 0.5 по МакФарланду. Контроль оптической плотности суспензии можно также осуществлять спсктро(|ютомстричсскн (дснсито.мстрнчсски). Существуют коммерчески досту пные стандарты мутности и спектрофотометры. Бактериальную суспензию можно готовить либо из бульонной, либо из агаровой культуры.

Приготовление инокулюма из агаровой культу ры

Дтя приготовления инокулюма используют чистую суточную ку льту ру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на несслективных плотных питательных средах. Петлей переносят незначительное количество материала с верху шек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором или питательным бульоном, доводя плотность инокулюма точно до 0.5 по стандарту МакФарланда. Иноку люм следу ет использовать в течение 15 мин после приготовления.

Приготовление иноку люма из бульонной кулыуры

При определении чу вствительности быстро расту щих бактерий с обычными питательными потребностями для приготовления иноку люма также можно использовать 5—6-часову ю бульонну ю культу ру микроорганизма. Для этого отбирают несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносят незначительное количество материала в

пробирку с 4.0—5.0 мл жилкой неселективной питательной средой. Инкубируют при 35 °С. Через 5—6 ч инкубации плотность микробной суспензии приблизительно соответствует необходимой, и ее точно доводят до 0.5 по МакФарланду путем добавления стерильного бульона или физиологического раствора.

Стандарт МакФарланда может быть либо приобретен, либо приготовлен в лаборатории.

4.1.4. Приготовление стандарта 0,5 по МакФарланду

К 0,5 мл раствора ВаС1? в концентрации 0.048 моль/л (1.175 % раствор ВаСЬ х 2 Н_:0) медленно при тщательном перемешивании добавить 99,5 мл раствора H₂SO.j в концентрации 0.18 моль/л (1 %) до получения гомогенной суспензии.

Правильность приготовления суспензии необходимо проверить на спсктро(|ютометре. Поглощение при использовании кюветы 1 см должно составить 0.08—0.10 при длине волны 625 нм.

Полученную суспензию необходимо разлить по 4—6 мл в пробирки с герметично закрывающимися крышками. Пробирки должны быть такого же диаметра, как и используемые для приготовления бактериальной суспензии.

Хранить пробирки с суспензией необходимо в темноте при комнатной температуре.

Перед использованием пробирки необходимо тщательно встряхивать и оценивать однородность суспензии. При появлении видимых частиц пробирки изымаются из употребления.

Стандарт мутности необходимо обновлять или проверять его оптическую плотность ежемесячно.

4.2. Методы серийных разведений

4.2.1. Приготовление растворов АБП для методов серийных разведений

Общим и крайне важным этапом для всех методов серийных разведений является приготовление растворов АБП. Различают «основные» растворы АБП (пригодные для хранения) и «рабочие» - тс. которые необходимо использовать вех tempore» для приготовления питательных сред.

Для приготовления основных растворов АБП необходимо использовать субстанции АБП с известной активностью, лекарственные формы нс пригодны. Для взвешивания субстанций необходимо использовать электронные лабораторные весы с точностью до 4 знака, хтя измерения объемов - калиброванные дозаторы и пипетки.

Основные растворы АБП готовят в концентрации 1 000.0 мкг/мл и выше. Навески АБП для приготовления базовых растворов готовят с