Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы

Методические указания MYK4.2.24i3-08

ББК 51.9

Л12

Л12    Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя си

бирской язвы: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2009.— 69с.

1.    Разработаны: Федеральной службой но надзору в сфере зашиты нрав потребителей и благополучия человека (С.Д. Кривуля, Н. Д. Пакскина); Ф1УЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (Е. И. Еременко, Л. II. Кулнченко, Н. П. Буравиева, О. И. Цыганкова. А. Г. Рязанова. Е. А. Цыганкова, Л. К). Аксенова); ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб* Роспотребнадзора (Н. А. Осина, И. И. Шарова. В. Е. Куклев, Е. А. Плотникова, Т. В. Бугоркова); Ф1УЗ Иркутский научно-исследова-тельский институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора (А. В. Родзиковский, 3. Ф. Дугаржапова); ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (А. В. Лип-нинкий, А. М. Барков. И. А. Баркова. В. В. Алексеев); ФГУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора (В. Е. Безсмертный, С. М. Иванова, В. А. Подледнев); Ф1УН Государствен!шш научный центр прикладной микроб иол ош и и биотехнологии Роспотребнадзора (Л. И. Маринин, И. А. Дятлов, Н. А. Шишкова, А. II. Мокриевич); Ф1УН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора (Г. А. Шипулин, С. Б. Яцышина); ГНУ Всероссийский научно-нсследова-тельский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россель-хозакадемии (К). О. Селяшшов, И. Ю. Егорова).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией но государственному' санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе но надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 июля 2008 г. № 2).

3.    Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государствештым санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. (Дшшенко 29 июля 2008 г.

4.    Введены в действие с 1 сентября 2008 г.

5.    С введением в действие данных методических указаний при осуществлении государствешюго санитарно-эпидемиологического надзора методические указания «Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды*, утвержденные 01.09.86 начальником Главного управления ветеринарии Госагропромкомитета СССР и начальником Главного управления карантинных инфекций Минздрава СССР, применению не подлежат.

ББК 51.9

€> Роспотребнадзор, 2009 €> Федеральный центр гишены

н эн идем иолом и Роспотребнадзора, 2009

МУК 4.2.2413-08

г)    продовольственное сырье и продукты животного происхождения:

д)    объекты окружающей среды — почва, трава, фураж, подстилка, вода и т. д.

Забор всех видов материала осуществляется в стерильную стекля иную или пластиковую посуду, соответствующую объему проб. Иммунофлуоресцентным. серологическим и бактериологическим методами исследуется соответствующий материал из общей пробы.

4.2.    Взятие материала от животных

4.2.1. Для бактериологического исследования

В случае падежа животного в лабораторию направляют ухо и мазок, полученный из надреза уха. Ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп. Предварительно ухо туго перевязывают шпагатом у основания в двух местах и отрезают между лигатурами. Место отреза уха на трупе прижигают. Отрезанное ухо заворачивают в пергаментную бумагу, смоченную в дезинфицирующем растворе. Если подозрение на сибирскую язву возникло при вскрытии трупа животного или в ходе вынужденного убоя, все манипуляции по вскрытию прекращают и на исследование направляют кровь, кусочки органов (селезенки, печени, лимфоузлов, в которых имеются характерные патологоанатомические изменения), костный мозг (из грудины или канала бедренной кости). Материалы от трупа необходимо брать и исследовать как можно раньше, так как из-за развития посторонней микрофлоры трудно выделить чистую культуру возбудителя сибирской язвы. От трупов свиней в обязательном порядке отбирают заглоточные лимфатические узлы и участки отечной соединительной ткани.

У животных с подозрением на заболевание или больных берут на исследование кровь с помощью шприца из яремной вены или из вены уха, а у свиней - из вены хвоста. В отдельных случаях у животных берут на исследования пробы каловых масс.

4.2.2.    Для исследования методом ПНР

Микробиоптат/микроаутоптат (пунктат) помещают в микро-центрифужные пробирки объемом 1,5— 1,7 мл с завинчивающимися или защелкивающимися крышками, содержащие 0,1—0.2 мл 0,9 %-го раствора натрия хлорида или транспортной среды № 1 (прилож. 1.8).

Макробиоптат/макроаутоптат (кусочки тканей массой 0,1—1,0 г) помещают в контейнер с 0,9 %-м раствором натрия хлорида или транспортной средой № 2 (прилож. 1.9).

11

4.3. Взятие материала от человека

4.3.1. Для бактериологического исследования

Забор материала от больных людей должен производиться до начала специфического лечения.

Необходимо осторожно обработать спиртом кожу вокруг пораженного места и поверхность карбункула. Содержимое везикулы отсасывают стерильным шприцем или стерильной тонко оттянутой обломанной пастеровской пипеткой. В пипетку обычно набирается небольшое количество опалесцирующей желтоватой жидкости в объеме, достаточном для посева на агаровую среду и для приготовления мазка. Затем иглу или кончик пипетки помещают в пробирку с питательным бульоном. Отделяемое язвы снимают с поверхности стерильным тампоном, смоченным 0.9 %-м раствором натрия хлорида. Фрагменты отторгнутого струпа снимают влажным тампоном или пинцетом.

При всех формах заболевания из крови, взятой на анализ, возбудитель сибирской язвы можно выделить уже при первом повышении температуры тела. Кровь берут из локтевой вены стерильным шприцем в объеме 3—5 мл (с учетом необходимости проведения бактериологических, серологических исследований и ПЦР). Сразу же, непосредственно у постели больного, по 0,1—0,2 мл крови засевают на питательные среды (агар и бульон Хоттингера, pH 7,2—7,5). Одновременно на предметных стеклах делают 2—3 тонких мазка, а остатки крови оставляют для получения сыворотки. Если невозможно сразу же исследовать кровь, ее из шприца переносят в стеклянную посуду (бактериологические пробирки).

Мокроту и испражнения собирают в стерильную посуду. Для высева на питательные среды отбирают слизь с примесью крови.

При висцеральных формах сибирской язвы и менингите исследуют спинномозговую жидкость, которую отбирают после пункции поясничной, субокципитальной области или мозговых желудочков в количестве 0,5 мл в стерильную микроцентрифуж-ную пробирку объемом 1.5— 1,7 мл с завинчивающейся или защелкивающейся крышкой. При подозрении на ингаляционное заражение исследуют также мазки из полости носа. Их берут сухими стерильными ватными тампонами на зондах. Тампон вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2—3 см до нижней раковины. Затем тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную микро центрифужную пробирку объемом

МУК 4.2.2413-08

1.5— 1,7 мл с завинчивающейся или защелкивающейся крышкой с 0,9 %-м раствором натрия хлорида. Погрузив рабочую часть зонда в раствор натрия хлорида, вращают зонд в течение 10—15 с. избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки, и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.

4.3.2. Для исследования методом ПЦР

Забор крови проводят из локтевой вены в объеме 3—5 мл. Кровь аккуратно (без образования пены) переносят в стерильную пробирку, содержащую 6 %-й раствор ЭДТА в отношении 1 : 20 к объему крови. Используют одноразовые шприцы, иглы и посуду.

Содержимое везикул, карбункулов в объеме 0,1—0,3 мл и фрагменты струпьев массой 10—100 мг помещают в микроцентри-фужные пробирки объемом 1,5—1,7 мл с завинчивающимися или защелкивающимися крышками, содержащие 0,1—0,2 мл транспортной среды № 1 (прилож. 1.8). Спинномозговую жидкость после пункции одноразовой пункционной иглой отбирают в количестве 0,5 мл в стерильную микро центрифужную пробирку объемом

1.5— 1,7 мл с завинчивающейся или защелкивающейся крышкой.

Мазки из полости носа берут сухими стерильными ватными

тампонами на зондах, как и для бактериологического исследования. с той разницей, что тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в микроцентрифужную пробирку объемом

1.5— 1,7 мл с завинчивающейся или защелкивающейся крышкой с транспортной средой № 2 (прилож. 1.9).

Транспортирование биологического материала для исследования методом ПЦР при отсутствии транспортной среды осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом при температуре 2—8 °С. Недопустимо замораживание образцов цельной крови!

4.4. Взятие материала из сырья животного происхождения и объектов окру жающей среды

Взятие материала из сырья животного происхождения и из объектов внешней среды проводится в тех случаях, когда необходимо установить источник инфекции или фактор передачи, для выявления обсемененности спорами возбудителя сибирской язвы отдельных объектов, а также в целях обнаружения микроба в местах старых скотомогильников при проведении строительных, мелиоративных. гидротехнических и других работ, связанных с выемкой и перемещением грунта.

4.4. J. Для бактериологического исследования

4.4.1.1. Мясо и мясные проекты

Из материала, доставленного на исследование, отбирают образцы весом 10—30 г, из мяса — участки с лимфоидной тканью или кровоизлияниями.

4.4.1.2. Шерсть

Шерсть для исследования отбирают из разных мест, не менее 5 образцов массой около 2 г каждый (лучше брать пучки загрязненной шерсти). Если шерсть упакована в кипы, берут не менее 10 образцов из разных мест каждой кипы, а также скопившуюся внутри обшивки пыль. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.

4.4.1.3. Кожи и кожсырье

Берут кусочки кожи размером 3 х 3 см с периферических незагнивших и незаплесневевших участков шкурок. При наличии на внутренней стороне шкурки кровоподтеков или инфильтратов пробы берут и в этих местах.

4.4.1.4. Почва

При отборе проб почвы следует руководствоваться «Методическими рекомендациями по отбору проб почвы для бактериологического исследования на наличие возбудителей сибирской язвы и актиномицетов-антагонистов» (М.,1984). Пробы почвы с мест вероятного обсеменения спорами возбудителя (мест вынужденного убоя скота, стоянок и водопоя животных) берут на глубине до 15 см, на территории скотомогильников - на глубине до 2 м с помощью почвенных буров. При этом при заборе проб с большой территории обследуемую площадь разбивают на квадратные участки со стороной не более 4 м. В каждом квадрате намечают 5 точек по диагонали или 4 точки по краям и одну посередине, откуда производят отбор проб почвенным буром. Перед взятием почвы на территории скотомогильника верхний ее слой снимают на 2—3 см и пробы берут на глубину до 1,5—2.0 м через каждые 25 см не менее 200 г в пробе. Особое внимание обращают на костные и другие животные остатки, которые также отбираются для исследования. Пробы упаковываются в том же порядке. Каждую пробу весом около 100—200 г помешают в мешочек из плотной ткани с завязками или в лабораторную посуду (широкогорлый флакон, банку), закрытую такой же тканью. Нельзя помещать пробы почвы в полиэтиленовые мешочки или в плотно закрытую посуду, так как в этих условиях происходит бурное развитие актином и цетов, губительно действующих на возбудитель сибирской язвы. Вынутую из глубины

14

МУК 4.2.2413-08

и не использованную для проб почву с целью обеззараживания смешивают с сухой хлорной известью, содержащей 25 % активного хлора, в соотношении 1 часть хлорной извести на 3 части почвы, слегка увлажняют и сбрасывают в шурф. Место отбора проб дезинфицируют раствором хлорной извести, содержащей 5 % активного хлора, инструменты - огнем паяльной лампы.

4.4.1.5. Вода

Пробы воды из естественных и искусственных водоемов берут у поверхности (на глубине 10— 15 см) и у дна при помощи батометра или специально приспособленной бутыли. Объем каждой пробы не менее 0,5 л, общий объем не менее 1 л. Кроме того, берут пробы придонного осадка у береговой кромки, которые исследуют так же как пробы почвы.

4.4.1.6. (мины с объектов внешней сре.ты

Смывы делают с мест наиболее вероятного обсеменения спорами возбудителя с помощью стерильного тампона, смоченного стерильной дистиллированной водой. Площадь смыва одним тампоном около 100 см². Затем тампоны помещают в пробирки, заливают стерильной дистиллированной водой (15 мл) и закрывают пробкой.

4.4.1.7. Корча

Концентрированные корма (зерно, отруби, комбикорм) отбирают в зависимости от условий хранения. При наличии незатарен-ных кормов первичные пробы отбирают из расчета 1 проба не менее 400 г на 4 м² поверхности, но не менее 5 проб от каждого закрома, партии. Первичные пробы берут как из поверхностных, так и из глубоких слоев корма равномерно по всей площади. При наличии затаренных кормов отбор проводят от каждой упаковочной единицы. Отбор проб проводят сухим стерильным пробным щупом. После взятия проб от каждого обл>екта (партии) щуп очищают и обжигают огнем паяльной лампы. Пробы грубых кормов (сено, солома) берут из разных мест скирды при помощи ножниц и пинцета из расчета 1 проба (40 г) на 4 м² площади скирды. Зеленую массу отбирают, как грубые корма. Корнеплоды, в зависимости от величины, отбирают из расчета 1—3 штуки на 4 м² площади бурта, отсека. С отобранных корнеплодов скальпелем в местах, где имеются остатки земли, срезают поверхностный слой, который используют для исследования.

В лабораторию направляют среднюю пробу, которую составляют из хорошо перемешанных первичных проб данной партии, емкости и т. п. Масса средней пробы должна быть не менее 500 г.

4.4.1.8. Воздух

Пробы воздуха отбирают с помощью специальных приборов, снаряженных сорбирующей жидкостью или фильтрами. Объем исследуемого воздуха должен составлять не менее 3—5 м\

4.4.2. Для исследования методом ПЦР

Для исследования методом ПЦР отбирают пробы из объектов окружающей среды, пищевых продуктов (мясо и продукты животного происхождения), сухих и сочных кормов, подстилки, шкур, шерсти, почвы, воды, смывовс поверхностей. Отбор проб осуществляют так же, как и для бактериологических исследований.

4.5. Направление материала на исследование

Транспортирование и хранение биологического материала для исследования методом ПЦР должны осуществляться с соблюдением «холодовой цепи»: образцы цельной крови — при температуре 2—8 °С — в течение 1 сут: образцы плазмы и сыворотки крови - при температуре 2—8 °С — в течение 5 сут, при температуре -70 °С — длительно.

Образцы остальных видов биологических материалов — при температуре 2—8 °С - в течение 1 сут, при температуре —20 °С - в течение 1 недели, при температуре —70 °С — длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

Патологический материал для исследования помещают в стерильную посуду (пробирки, банки или другу ю лабораторную посуду). Высушенные на воздухе мазки кладут в стерильные чашки Петри, которые обертывают плотной бумагой с надписью «мазок не фиксирован». В направлении к материалу от больного человека или трупа указывают фамилию, имя, отчество больного (умершего), место и время взятия материала, его наименование и предположительный диагноз. Пробы почвы, кормов и других сыпучих объектов помещают в сухую стеклянную банку и закрывают стерильной крышкой, пробкой или пергаментом, можно использовать полиэтиленовые мешочки (кроме проб почвы), которые завязывают шпагатом. Пробы воды наливают в стерильные стеклянные бутылки и закрывают стерильными резиновыми пробками. Допускается использование одноразовых стерильных или многоразовых автоклавируемых пластиковых флаконов. Все пробы нумеруют, емкости заворачивают в лигнин или гигроскопическую вату в количестве. достаточном для сорбции всей жидкости в случае повреждения упаковки. Пробы упаковывают во влагонепроницаемую тару, которую обвязывают, пломбируют или опечатывают, делают надпись «верх, осторожно». Пробы материала и сопроводительные документы доставляются нарочным на спецтранспорте.

МУК 4.2.2413-08

Содержание

1.    Область применения........................................................... 4

2.    Нормативные и методические ссылки............................... 5

3.    Общие положения.............................................................. 6

4.    Материал для исследования, взятие, пересылка материала и подготовка проб дтя исследования........................... 10

5.    Порядок проведения исследования................................... 19

6.    Выдача заключений по результатам лабораторного исследования на сибирскую язву................................................ 44

7.    Режим работы в лабораториях, работающих с возбудителем сибирской язвы............................................................ 46

Приложение 1. Питательные среды, применяемые для выделения и идентификации возбудителя сибирской язвы........................................................... 47

Приложение 2. Приготовление рабочих растворов и реагентов 50 Приложение 3. Критерии интерпретации результатов исследования В. anthracis: пограничные значения диаметров зон подавления роста (мм) и величин МПК (мг/л) антибактериальных препаратов................................................................... 53

Приложение 4. Отличительные признаки штаммов сибиреязвенного микроба различных типов.................. 54

Приложение 5. Диагностические препараты, применяемые для индикации и идентификации возбудителя

сибирской язвы................................................. 56

Приложение 6. Устойчивость В. anthracis к физическим и химическим факторам.......................................... 58

Приложение 7. Идлюстрации к методическим указаниям «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы».................................... 60

Приложение 8. Временной график выполнения лабораторных

исследований на сибирскую язву...................... 66

3

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы но надзору в сфере защиты нрав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

29 июля 2008 г.

Дата введения: 1 сентября 2008 г.

4.2. МЕТОДЫ КОШ РОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы

Методические указания МУК 4.2.2413-08

1. Область применения

1.1.    Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами других заинтересованных организаций.

1.2.    В методических указаниях определены порядок забора, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на сибирскую язву, а также материала из объектов окружающей среды, подозрительного на контаминацию возбудителем данного заболевания.

Список сокращений

Всеросс и йс ки й науч но - исс л едовател ьс ки й институт ветеринарной вирусологии и микробиологии:

Государственный институт стандартизации и контроля;

Государственный контрольный институт; диско-диффузионный метод; дезоксирибонуклеиновая кислота:

4

МУК 4.2.2413-08

иммуноферментный анализ;

килодальтон;

летальный фактор:

мясопептонный агар;

мясопептонный бульон;

минимальная подавляющая концентрация:

метод флуоресцирующих антител;

отечный фактор;

протективный антиген;

полимеразная цепная реакция;

реакция непрямой гемагглютинации:

реакция торможения непрямой

гемагглютинации;

среда для сочетанного определения продукции

экзотоксина и капсулы;

этилендиаминтетераацетата динатриевая соль:

абсолютная летальная доза:

половинная летальная доза:

метод анализа областей генома с вариабельным

числом тандемных повторов.

2. Нормативные и методические ссылки

2.1.    Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности). СП 1.3.1285-03».

2.2.    Санитарные правила «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I—IV групп патогенности. СП 1.2.036-95».

2.3.    «Сибирская язва. СП 3.1.089—96, ВП 13.3.1320—96».

2.4.    Практическое руководство «Специфическая индикация патогенных биологических агентов». 2006.

2.5.    Методические указания «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I—II групп патогенности. МУ 1.3.1794—03».

2.6.    Методические указания «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04».

2.7.    Методические указания «Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I—IV групп патогенности, при исследованиях методом ПЦР. МУ 3.5.5.1034-01».

2.8.    Методические рекомендации по использованию этилового спирта с 3 % перекиси водорода для фиксации на предметном стекле возбудителя сибирской язвы, 1984 .

5

2.9.    Методические рекомендации по отбору проб почвы для бактериологического исследования на наличие возбудителей сибирской язвы и актином и цетов-антагон истов, 1984.

2.10.    Методические рекомендации «Использование 0,05—0.1 % раствора Твина-80, как разводящей жидкости, для определения концентрации спор сибиреязвенного микроба», 1986.

2.11.    Методические рекомендации «Определение гемолитической активности у сибиреязвенного микроба», 1989.

2.12.    Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения. Гос ко мсан эпиднадзор РФ, 1995.

2.13.    Методические рекомендации «Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики». М3 РФ, ЦНИИЭ, 2004.

2.14.    Методические рекомендации «Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ. МР 0100/0556-04-34», 2005.

2.15.    Инструкция по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам, 1990.

3. Общие положения

Сибирская язва (Anthrax) - это острое инфекционное заболевание животных и человека, относящееся к группе особо опасных инфекций. Основным источником инфекции для человека при сибирской язве являются больные травоядные животные. Они в течение всего периода болезни выделяют возбудитель с мочой, испражнениями и слюной в почву, которая становится его дополнительным резервуаром. Заражение животных происходит главным образом алиментарным (через корм и питьевую воду, инфицированные спорами), реже - трансмиссивным (через укусы кровососущих насекомых) и воздушным путями.

В подавляющем большинстве случаев человек заражается сибирской язвой при разделке туш вынужденно убитого скота; употреблении в пищу полученных от него мяса или мясных продуктов: непосредственном контакте с трупами погибших животных, шерстью. шкурами, кожей, щетиной, зараженными возбудителем; уходе за больными животными. Возможно также заражение через укусы кровососущих насекомых, контаминированную почву и при вдыхании содержащего споры аэрозоля.

МУК 4.2.2413-08

В зависимости от путей заражения у человека развивается кожная или висцеральная (кишечная, легочная) формы сибирской язвы. Любая из этих форм может приводить к развитию сепсиса и осложняться сибиреязвенным менингитом (генерализованная форма).

Возбудитель этой инфекции в 2001 г. в США был использован как средство биологического терроризма, что привело к человеческим жертвам и возникновению паники среди населения. Поэтому своевременная и точная лабораторная диагностика сибирской язвы приобретает сейчас особое значение.

Диагностика сибирской язвы у человека и животных основывается на эпизоотологических, эпидемиологических, клинических, лабораторных и патологоанатомических данных. Лабораторные исследования направлены на обнаружение и идентификацию возбудителя сибирской язвы, выявление специфических антител и аллергической перестройки в организме больных людей.

/. Краткие сведения о возбудителе сибирской язвы

Возбудитель сибирской язвы - В. ant h гас is, относится к семейству спорообразующих микроорганизмов Bacillaceae, роду Bacillus. В роду Bacillus, насчитывающем 101 вид, выделяют группу видов Bacillus cereus, в которую входят близкородственные В. cereus, В. anthracis. В. thuringiensis. В. mycoides и недавно признанный новым видом психротолерантный микроб В. weichenstephanensis.

Морфология В. anthracis. В зависимости от стадии развития культуры, а также условий окружающей среды, возбудитель сибирской язвы может существовать в трех формах - в виде бес капсульных вегетативных палочек (бацилл), инкапсулированных палочек и спор.

В мазках из культур, выросших на питательных средах, палочки (размеры 1 — 1,5x6—8—10 мкм) расположены длинными цепочками, концы микробов в окрашенных препаратах обрублены и цепочка напоминает бамбуковую трость с коленчатыми сочленениями (прилож. 7, рис. 1). В мазках из патологического материала палочки расположены поодиночке, попарно или короткими цепочками, окружены хорошо выраженной капсулой, зачастую общей для группы микробов (прилож. 7, рис. 2).

Спорообразование. При выращивании возбудителя на питательных средах и в условиях окружающей среды, при свободном доступе кислорода воздуха, определенной влажности и температуре от 12,0 до 42,5 °С образуются споры овальной формы размером 0,8—1 х 1,2—1,5 мкм. В каждой вегетативной клетке (спорангии) образуется только одна спора, располагающаяся центрально, ее

7

диаметр не превышает ширину тела микробной палочки (при-лож. 7, рис. 3).

Процесс спорообразования состоит из четырех основных стадий: подготовительной, образования проспор, готовых спор и зрелых спор. Спорогенез зависит от особенностей штамма, наличия тех или иных питательных веществ, pH среды, температуры выращивания. влажности и др.

При попадании спор в благоприятные условия (влажность, аэрация, температура, наличие необходимых питательных веществ) из них быстро образуются вегетативные клетки. Время прорастания спор может составлять несколько часов и зависит от температуры (оптимум - 37 °С) и других факторов.

Культурально-биохимические свойства. Сибиреязвенный микроб - факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 34—37 °С, оптимальное значение pH 7,2—7,8, неподвижный, хорошо растет на обычных питательных средах - МПБ и МПА. Характер роста в совокупности с другими признаками учитывается при идентификации.

При посевах на чашки Петри с питательным агаром после суточной инкубации при (36 ± 1) °С микроб формирует крупные шероховатые сухие матовые колонии в R-форме, с «шагреневой» поверхностью, с неровными краями и отходящими от них волнистыми отростками. При малом увеличении под микроскопом (7 х 10) они напоминают локоны волос или львиную гриву (прилож. 7, рис. 4).

Характерный придонный рост сибиреязвенного микроба в МПБ или 1 %-й пептонной воде похож на комочек ваты, с трудом разбивающийся при встряхивании, при этом бульон остается прозрачным (прилож. 7, рис. 5).

Сибиреязвенный микроб способен разлагать с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, сахарозу и некоторые другие сахара, но не разлагает лактозу. Обладает относительно низкой протеолитической активностью и при посеве уколом в столбик 10—12 %-го мясопептонного желатина и выращивании при 22 °С рост микроба напоминает елочку, опрокинутую верхушкой вниз; на 3—5 день желатин разжижается в виде воронки. Большинство сапрофитов полностью разжижает желатин в более короткие сроки. При росте на кровяном агаре с 3—5 % дефибринированной крови барана через 20—24 ч гемолиз не наблюдается, в то время как многие сапрофиты дают быстрый гемолиз (через 12—18 ч при 37 °С). Большинство штаммов сибиреязвенного микроба не образует фермент лецитиназу. При росте на агаре с куриным желтком вокруг колоний не происходит помутнения среды в виде беловатой зоны, а при посеве на жидкую желточную среду желток не сверты-

8

МУК 4.2.2413-08

вается даже при 5—6-суточном инкубировании. Сапрофиты свертывают желток в течение 6—10 ч. Сибиреязвенный микроб, в отличие от сапрофитных бацилл, обладает низкой фосфатазной активностью и не способен разлагать фосфаты, добавляемые в питательную среду (тест на фосфатазу).

Большинство штаммов сибиреязвенного микроба чувствительны к пенициллину и при выращивании на МПА или МП Б в присутствии 0,5—0,05 ЕД/мл бензилпенициллина через 3 ч инкубирования образуют цепочки из шарообразных клеток - «жемчужное ожерелье» (прилож. 7, рис. 6).

До 95 % штаммов сибиреязвенного микроба лизируется сибиреязвенными бактериофагами «Гамма», «К» и Fah-ВНИИВВиМ (прилож. 7, рис. 7).

Чувствительность к антибиотикам. Возбудитель сибирской язвы чувствителен к большинству антибиотиков — цефалосп ори нам I поколения, тетрацикл и нам. рифампицинам. аминогликозидам и фторхинолонам. Пенициллин способен задерживать развитие сибиреязвенного микроба даже при низкой концентрации в питательной среде. К некоторым макролидам сибиреязвенный микроб умеренно устойчив, а к цефалос пори нам II—IV поколения устойчив.

Факторы вирулентности (агрессии). Возбудитель сибирской язвы обладает почти универсальной патогенностью для млекопитающих - человека и других приматов, сельскохозяйственных и диких животных, лабораторных животных.

Важнейшими факторами патогенности у микроба являются капсула и экзотоксины. Сибиреязвенный микроб образует их в инфицированном макроорганизме или при культивировании на искусственных питательных средах в специальных условиях.

Наличие капсулы необходимо на первых этапах инфекционного процесса для предотвращения опсонизации и фагоцитирования микроорганизма.

Т ипичные вирулентные штаммы В. a nth гас is образуют капсулу в организме больных людей и животных, а также при культивировании на 1 %-м бикарбонатно-сывороточном агаре в атмосфере, содержащей 5—50 % углекислоты или на жидкой среде ГКИ, содержащей 40 % инактивированной бычьей (лошадиной) сыворотки и 60 % раствора Хенкса. На 1 %-м бикарбонатном агаре микроб растет в SM-форме в виде гладких, блестящих, влажных, слизистых колоний с неровными краями (прилож. 7, рис. 8).

Экзотоксин играет ведущую роль в патогенезе сибиреязвенной инфекции и формировании специфического иммунитета. Сибиреязвенный экзотоксин относится к бинарным двухкомпонентным белковым токсинам АВ-типа и обладает двумя разными биологическими активностями. Компонентами токсина являются ОФ, ПА

9

и ЛФ. Это белки с молекулярными массами 89, 83 и 85 кДа. В настоящее время можно встретить сообщения о двух токсинах - отечном (ОФ + ПА) и летальном (ЛФ + ПА), в которых эффекторную функцию выполняют ОФ и ЛФ (А-субъединицы). а акцепторную и интернализирующую функции - ПА (В-субъединица).

Геном типичных штаммов сибиреязвенного микроба представлен одной кольцевой хромосомой и двумя плазмидами. Токси-нообразование и капсулообразование детерминированы плазмидами рХ01 и рХ02. Отсутствие хотя бы одной из этих плазмид приводит к снижению вирулентности вплоть до полной ее утраты.

В природе, наряду с «классическими» диплазмидными штаммами, с меньшей частотой встречаются атипичные моно- и бес-плазмидные варианты возбудителя.

3.2. Исаедование на сибирскую язву

Исследование на сибирскую язву включает микроскопию мазков из исходного материала, высевы на питательные среды, постановку основных и дополнительных тестов идентификации, использование МФА для обнаружения антигенов и антител к ним, постановку ПЦР, биопробы и реакции преципитации. У человека и свиней, в случае невозможности установить диагноз вышеперечисленными методами, обязательна постановка клинической кожно-аллергической пробы с сибиреязвенным аллергеном.

4. Материал для исследования, взятие, пересылка материала и подготовка проб для исследования

Все работы по забору, транспортированию и подготовке проб клинического и секционного материала от людей и животных, из объектов окружающей среды осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.1285—03 «Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности)», СП 1.2.036—95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I—IV групп патогенности, МУ 1.3.1794—03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I—II групп патогенности».

4.1. Материал для исследования:

а)    от больных или подозрительных на заболевание людей, в зависимости от формы заболевания - содержимое везикул, отделяемое карбункула или язвы, струпья, мокрота, кровь, спинномозговая жидкость, моча, испражнения, экссудаты:

б)    трупный материал - кровь, экссудаты, кусочки органов (селезенки, печени, лимфоузлов и др.):

в)    материал от животных;

10