Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

45 страниц

333.00 ₽

Купить МР 1.2.0046-11 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Методические рекомендации применяются для выявления и идентификации наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в тканях и органах животных и растений.

  Скачать PDF

Оглавление

1. Область применения

2. Введение

3. Нормативные ссылки

4. Общие положения

5. Подготовка проб для анализа наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия, церия в тканях животных и растений

5.1. Методики подготовки проб для анализа наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия, церия в тканях растений

5.2. Методики подготовки проб для анализа наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия, церия в тканях животных

5.3. Приготовление образцов сравнения из наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия, церия

6. Анализ наночастиц в биологических образцах с применением метода знергодисперсионной микроспектроскопии

6.1. Технические характеристики применяемых средств измерений

6.2. Подготовка и настройка прибора перед проведением анализа методом ПЭМ с ЭДС

6.3. Процедура проведения измерений

7. Анализ полученных данных и представление результатов

7.1. Анализ полученных данных

7.2. Представление результатов анализа

Приложение 1. Обозначения и сокращения

Приложение 2. Рекомендуемая литература

Показать даты введения Admin

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27
Стр. 28
стр. 28
Стр. 29
стр. 29
Стр. 30
стр. 30

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Применение метода энергодисперсионной микроспектроскопии для анализа наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в тканях животных и растений

Методические рекомендации МР 1.2.0046—11

Издание официальное

Москва • 2012

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Применение метода энергодисперсионной микроспектроскопии для анализа наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в тканях животных и растений

Методические рекомендации МР 1.2.0046—11

3.38.    ГОСТ 6709-72 «Вода дистиллированная. Технические условия».

3.39.    ГОСТ 1942-86 «1,2-Дихлорэтан технический. Технические условия».

3.40.    ГОСТ 4198-75 «Реактивы. Калий фосфорно-кислый одноза-мещенный. Технические условия».

3.41.    ГОСТ 3118-77 «Реактивы. Кислота соляная. Технические условия».

3.42.    ГОСТ 4172-76 «Реактивы. Натрий фосфорно-кислый двуза-мещенный 12-водный. Технические условия».

3.43.    ГОСТ 5833-75 «Реактивы. Сахароза. Технические условия».

3.44.    ГОСТ Р 51652-2000 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия».

3.45.    ГОСТ 24104-2001 «Весы лабораторные, Общие технические требования».

3.46.    ГОСТ 27987-88 «Анализаторы жидкости потенциометрические ГСП. Общие технические условия».

3.47.    ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».

3.48.    ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».

3.49.    ГОСТ 29227-91 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».

3.50.    ГОСТ 21240-89 «Скальпели и ножи медицинские. Общие технические требования и методы испытаний».

3.51.    ГОСТ 21241-89 «Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний».

3.52.    ГОСТ 16317-87 «Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия».

3.53.    ГОСТ 3-88 «Перчатки хирургические резиновые. Технические условия».

3.54.    ГОСТ 2493-75 «Реактивы. Калий фосфорно-кислый двуза-мещенный 3-водный. Технические условия».

3.55.    ГОСТ 4568-95 «Калий хлористый. Технические условия».

3.56.    ГОСТ 4233-77 «Реактивы. Натрий хлористый. Технические

условия».

3.57.    ГОСТ 1625-89 «Формалинтехнический. Технические условия».

3.58.    ГОСТ 4517-87 «Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе».

3.59.    ГОСТ 20015-88 «Хлороформ. Технические условия».

10

MP 1.2.0046—11

3.60.    ГОСТ 21239-93 «Инструменты хирургические. Ножницы. Общие требования и методы испытаний».

3.61.    ГОСТ 7.32-2001 «Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления».

IV. Общие положения

4.1. Целью выявления и идентификации наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в срезах тканей животных и растений методом энергодисперсионной микроспектроскопии является:

•    установление возможности проникновения металлических и металлооксидных наночастиц в организмы животных и растения;

•    выявление органов-мишеней воздействия металлических и металлооксидных наночастиц;

•    установление наличия эффектов кумуляции наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в организмах животных и растениях;

•    выявление механизмов действия наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия;

•    исследования по токсиколого-гигиенической и медико-биологической оценке наноматериалов на основе наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия;

•    санитарно-гигиеническое нормирование содержания наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в продовольственном сырье и пищевых продуктах растительного и животного происхождения;

•    экспертиза продукции наноиндустрии, полученной на основе наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия, производимой на территории Российской Федерации или ввозимой на территорию Российской Федерации;

•    государственный надзор (контроль) за использованием наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия, церия и продукции, их содержащей, в процессе разработки, производства, хранения, транспортирования, реализации и утилизации;

•    оценка экспозиции человека наночастицами серебра, оксидами цинка, алюминия и церия через пищевые продукты животного и растительного происхождения;

•    оценка риска для здоровья населения при поступлении наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в организм в составе продукции растительного и животного происхождения;

•    проверка оценки соответствия продукции наноиндустрии установленным требованиям;

11

• разработка мероприятий по охране окружающей среды от воздействия металлических и металлооксидных наночастиц.

4.2.    Отбор проб органов и тканей животных и растений осуществляется в соответствии с МУ 1.2.2741—10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных», МУ 1.2.2742—10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в растениях», МУ 1.2.2745—10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных», МР 1.2.2640—10 «Методы отбора проб, выявления и определения содержания наночастиц и наноматериалов в составе сельскохозяйственной, пищевой продукции и упаковочных материалах», МР 1.2.0022—11 «Порядок отбора проб для контроля за наноматериалами».

Фиксацию и хранение проб органов и тканей растений для последующего анализа методом ПЭМ выполняют, как описано в МУ 1.2.2876—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в растениях». Фиксацию и хранение проб органов и тканей животных для последующего анализа методом ПЭМ выполняют, как описано МР 1.2.2640—10 «Методы отбора проб, выявления и определения содержания наночастиц и наноматериалов в составе сельскохозяйственной, пищевой продукции и упаковочных материалов» (п. 5.1.5.2.2).

4.3.    Организация (лаборатория) должна быть аккредитована на проведение работ в области оценки безопасности наноматериалов.

В лаборатории должны соблюдаться правила надлежащей лабораторной практики в соответствии с приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики».

4.4.    В организации (лаборатории), проводящей исследования по выявлению и идентификации наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в срезах тканей животных и растений, должна быть разработана программа по обеспечению качества проводимых исследований. Все производственные операции проводятся в соответствии со стандартными операционными процедурами (СОП), осуществляемыми в целях обеспечения качества, достоверности и воспроизводимости результатов исследования.

4.5.    Организации (лаборатории), проводящие исследования по выявлению и идентификации наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в срезах тканей животных и растений методами энергодисперсионной микроспектроскопии, должны быть укомплектованы необходимыми оборудованием и средствами измерений, прошедшими поверку (калибровку) в установленном порядке. Эксплуатация оборудова-

12

MP 1.2.0046—11

ния и средств измерений проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения поверки (калибровки) и текущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание. Применяются средства измерений, имеющие сертификат и зарегистрированные в Государственном реестре средств измерений.

4.6.    Организации (лаборатории) проводящие исследования по выявлению и идентификации наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в срезах тканей животных и растений методами энергодисперсионной микроспектроскопии, должны иметь оборудованные помещения для работы с биологическим материалом (препарирование, про-боподготовка, анализ). Для обработки материала должны быть установлены ламинарные шкафы, обеспечивающие вертикальный поток воздуха, а также возможность работы без ламинарного потока, и длительную экспозицию облучения внутренних поверхностей ультрафиолетовым светом.

4.7.    Организации (лаборатории), проводящие исследования по выявлению и идентификации наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в срезах тканей животных и растений методами энергодисперсионной микроспектроскопии, должны иметь оборудование, обеспечивающее безопасность работы с наноматериалами неорганического происхождения: ламинарные вытяжные шкафы, перчаточные боксы, снабжённые системой вентиляции (НЕРА-фильтры), препятствующие поступлению аэрозоля наноматериалов в воздух производственных помещений и в окружающую среду.

4.8.    Организации (лаборатории), проводящие исследования по выявлению и идентификации наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в срезах тканей животных и растений методами энергодисперсионной микроспектроскопии, должны иметь помещения для содержания и работы с лабораторными животными (виварий, клиники лабораторных животных), требования к которым изложены в МУ 1.2.2874— 11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных».

4.9.    Проведение исследований по выявлению и идентификации наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в срезах тканей животных и растений методами энергодисперсионной микроспектроскопии осуществляется на основе предварительно разработанного дизайна (плана) исследований в соответствии с МУ 1.2.2874—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных живот-

13

MP 1.2.0046—11

ных» и МУ 1.2.2876—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в растениях». При разработке дизайна (плана) исследований необходимо учитывать, что метод энергодисперсионной микроспектроскопии за день работы позволяет провести анализ ограниченного (не более 10, в среднем 5—6) числа образцов.

4.10.    Документом, подтверждающим результаты проведённых исследований наноматериалов, является отчёт о проведённом исследовании. Отчет содержит следующие сведения: название исследования; адрес организации; даты начала и завершения исследований; цель и задачи исследования; характеристика тестируемого наноматериала; перечень исследованных образцов и применяемых стандартов; для животных -вид, линию, пол и возраст используемых животных, состав применяемых рационов, условия содержания животных, метод введения наночастиц, применяемые дозы, длительность и кратность введения, схему проведения исследования; для растений - вид, линию используемых растений, условия выращивания или сбора, методы введения наночастиц, применяемые дозы, длительность введения, схему проведения исследования; перечень использованных средств измерений и вспомогательного оборудования и режимы их работы; методы статистической обработки результатов; результаты исследования, представленные в виде обобщающих таблиц, рисунков с соответствующей статистической обработкой и комментариев к ним; заключение; выводы; список использованных источников.

Оформление отчёта о результатах исследования должно соответствовать требованиям ГОСТ 7.32-2001 «Отчёт о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления».

Отчет о результатах проведенного исследования составляется ответственным исполнителем, утверждается руководителем организации и скрепляется печатью организации.

4.11.    Организация (лаборатория), проводящая исследования по выявлению наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в срезах тканей животных и растений методами энергодисперсионной микроспектроскопии, должна обеспечить конфиденциальность результатов исследований в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации.

Сотрудники обязаны соблюдать конфиденциальность в отношении любых данных, полученных в ходе исследования, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

14

MP 1.2.0046—11

V. Подготовка проб для анализа наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия, церия в тканях животных и растений

5./. Методики подготовки проб для анализа наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия, церия в тканях растений

5.1.1 Реактивы, материалы и оборудование

5.1.1.1.    Реактивы

Дигидрофосфат калия водный (КН2Р04 х Н20),

квалификация хч

Гидрофосфат натрия 12-водный

(Na2HP04 х 12Н20), квалификация хч

Гидроксид натрия (NaOH), квалификация хч

Сахароза, квалификация хч

Кислота соляная (НС1), квалификация хч

Дистиллированная вода

Спирт этиловый ректифицированный, 96 %-й

первого сорта или высшей очистки

Ацетон, квалификация чда

Эпоксидная смола (Epoxy Embedding Medium,

Эпон® 812) фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или

аналогичная

Додецилянтарный ангидрид фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный Метилэндиковый ангидрид МЭА-610 фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный Тридиметиламинофенол (катализатор DMP-30) фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный Формвар (Formvar® solution) для микроскопии фирмы «Sigma-Aldrich» (СИ1А) или аналогичный (в случае самостоятельного приготовления формваровой пленки)

Дихлорэтан (для приготовления раствора формвара)

5.1.1.2.    Материалы Материалы для отбора проб растений в соответствии с МУ 1.2.2876—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в растениях»

Пинцет медицинский Ножницы медицинские

15

Скальпель

Перчатки хирургические резиновые Бритва фирмы «Ted Pella, Inc.» (США), кат. № 121-1 или аналогичная Контейнеры стеклянные для фиксации материала вместимостью 50 смПенициллиновые флаконы стеклянные с крышкой вместимостью 10 смЧашки Петри стеклянные (диаметром 12 см3) Пробирки стеклянные вместимостью 20 смс резиновой пробкой Штативы для пробирок

Медицинский шприц объёмом 50—100 см3 (для удаления воздуха из растений)

Цилиндр мерный вместимостью 100 см3 с наименьшей ценой деления 1 смКолба мерная стеклянная с притертой крышкой вместимостью 250 см3

Пипетки стеклянные или пластиковые градуированные вместимостью 5 см3    ГОСТ 29227-91

Наконечники для автоматических дозаторов полистирольные нестерильные вместимостью 200 и 1 000 мм3


Колбы стеклянные без крышки вместимостью 100,250,1 000 см3

Система для фильтрации растворов стеклянная вместимостью 1,0 дм3 с вакуумным насосом Мембраны эфирно-целлюлозные толщиной 150 мкм, диаметром 47 мм, с размером пор 0,22 мкм

Пинцет для электронно-микроскопических работ 110 мм тип 5 кончик 0,05 * 0,01мм (или 115 мм тип 7 кончик 0,10 х 0,06 мм) ненамагничиваю-щийся фирмы «Ted Pella»

Полипропиленовые пробирки для микропроб однократного применения типа «Эппендорф» вместимостью 1,5 и 2,0 см3    ТУ 64-2-30—80

Полиэтиленовые капсулы с плоским или коническим дном для заливки образцов, диаметр от 6 мм, выдерживающие нагрев до 75 ° С или

16

MP 1.2.0046—11

полипропиленовые аналогичные капсулы, выдерживающие нагрев до 100 °С производства фирмы «ВЕЕМ® Embedding Capsule» или аналогичные

Контейнеры тефлоновые с размером лунки от 0,5 х 0,5 см до 1,0 х 1,0 см для заливки образцов в эпоксидную смолу

Электронно-микроскопические бленды (медные), отверстие круглое 1, 3 мм или овальное 3 х 2 мм, или сетки медные круглые с размером отверстий 200—450 мкм

Специальное стекло для изготовления стеклянных ножей шириной 25 мм, длиной 400 или 200 мм, толщиной 6 или 10 мм фирмы «TedPella,

Agar Scientific» или аналогичный (если используются стеклянные ножи)

Пластиковые одноразовые ванночки для сбора срезов фирмы «TedPella» или аналогичные Палочки для чистки алмазного ножа из сердцевины пробкового дерева фирмы «TedPella, Agar Scientific» или аналогичные (если используется алмазный нож)

Стеклянная палочка длиной до 220 см и диаметром 3—5 мм

Химически чистое отшлифованное стекло для получения формваровой плёнки Специальный стеклянный стакан для приготовления и хранения раствора формвара Фильтровальная бумага

5.1.1.З. Оборудование Вытяжной шкаф, оборудованный фильтром для улавливания наночастиц

Холодильник бытовой электрический    ГОСТ 26678-85

Центрифуга со скоростью вращения ротора до 12 000 об./мин и охлаждением для микропробирок вместимостью 1,5 см3 (5415 R «Eppendorf»,

ФРГ или аналогичная)

Центрифуга мультифункциональная со скоростью вращения ротора до 5 000 об./мин (с бакет-ротором) и 14 000 об./мин (с угловым ротором),

17

MP 1.2.0046—11

охлаждением для пробирок вместимостью 20 см3 (5804 R «Eppendorf», ФРГ или аналогичная) (для суспензионных образцов)

Весы лабораторные общего назначения 2-го

класса точности с погрешностью взвешивания

не более 0,001 г    ГОСТ 24104-2001

pH-Метр, диапазон измерения    ГОСТ 27987-88

pH от 0,0 до 14, дискретность измерения 0,01

или аналогичный

Ультрамикротом, обеспечивающий возможность получения ультратонких срезов биологических образцов толщиной 30—100 нм, скорость резания 0,1—50 мм/с, термоподача 40—60 нм Прибор для изготовления стеклянных ножей для ультрамикротомов LKB 7800 или аналогичный Алмазные ножи для ультрамикротома Магнитная мешалка с регулируемой частотой вращения магнитного якоря в диапазоне 100—

1 200 об./мин, рассчитанная на объем до 1,0 дм3 Электромешалка со спиральной насадкой низкоскоростная (до 250 об./мин), рассчитанная на объем до 0,5 дм3

Суховоздушный термостат с диапазоном регулируемых температур от 25 до 80 °С и точностью ± 0,4 °С

Дистиллятор объемом от 4 дм3, производительностью от 1 дм3

Автоматические дозаторы с переменным объемом дозирования 100—1 000 мм3, 20—200 мм3 и 2—20 мм3

Держатели для прямоугольных и круглых блоков, совместимые с используемым ультрамикротомом, фирма «TedPella, Agar Scientific» или аналогичные Лобзик ручной механический для обработки залитых в эпоксидную смолу образцов Бинокулярная лупа, оснащенная настольным штативом, с линейным полем зрения от 2 до 10 см и диапазоном увеличений 0,6*, 1 xs 2x54xs 8х Встряхиватель вибрационный типа «Вортекс» со скоростью вращения до 3 000 об./мин (V3 «Elmi Ltd», Латвия или аналогичный)

MP 1.2.0046—11

Ламинарный бокс биологической безопасности класс II

5.1.2. Приготовление рабочих растворов и смесей

Рабочие растворы готовят в соответствии с общепринятыми правилами лабораторной практики. pH растворов контролируют при помощи pH-метра. Приготовленные растворы фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. После каждого использования рабочие инструменты подвергают тщательной обработке в ультразвуковой ванне во избежание перекрестной контаминации образцов наночастицами.

5.1.2.1. Приготовление двукратного раствора Соренсена (0,2 молъ/дм3) 0,06моль/дм3 КН2Р04, 0,14моль/дм3 Na2HP04, pH 7,2—7,4, с добавлением 30 г/дм3 сахарозы.

Для приготовления вспомогательных 1,0 моль/дм3 растворов на лабораторных весах готовят навески 136 г КН2Р04, 358,2 г Na2HP04 * 12Н20 и вносят каждое вещество в отдельную мерную колбу объемом 1 000 см3, содержащую 500 см3 дистиллированной воды. Соли растворяют при перемешивании, и объемы растворов доводят дистиллированной водой до 1 000 см3. Для ускорения растворения солей рекомендуется подогреть воду до 50—60 °С. Вспомогательные растворы фильтруют и хранят при температуре не более 4 °С в течение 6 месяцев.

Для приготовления двукратного 0,2 моль/дм3 раствора Соренсена с добавлением 30 г/дм3 сахарозы на лабораторных весах готовят навеску 30,0 г сахарозы и помещают в мерную колбу объемом 1 000 см3. В колбу с веществом вносят 300 см3 дистиллированной воды, 60 см3 1,0 моль/дмраствора КН2Р04, 140 см3 1,0 моль/дм3 раствора Na2HP04 и растворяют при перемешивании. Объем раствора доводят до 1 000 см3 дистиллированной водой, фильтруют и хранят при температуре не более 4 °С в течение 1 месяца.

5Л.2.2. Приготовление однократного раствора Соренсена (0,1 моль/дм3) 0,03 моль/дм3 КН2Р04, 0,07 моль/дм3 Na2HP04, pH 7,2—7,4, 15 г/дм3 сахарозы.

Для приготовления 100 см3 однократного раствора Соренсена (0,1 моль/дм3) с добавлением 15 г/дм3 сахарозы к 50 см3 двукратного раствора Соренсена с добавлением 30 г/дм3 сахарозы (приготовление описано в п. 5.2.1) добавляют 50 см3 дистиллированной воды.

5.1.2.3. Приготовление фиксирующего раствора (0,1 моль/дм3 раствор Соренсена pH 7,2—7,4, 2,5 % (по массе) глутарового альдегида).

Для приготовления 100 см3 фиксирующего раствора в мерную колбу вносят 50 см3 двухкратного раствора Соренсена с добавлением

19

ББК51.2

П75

П75 Применение метода энергодисперсионной микроспектроскопии для анализа наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в тканях животных и растений: Методические рекомендации.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2012.—43 с.

ISBN 978—5—7508—1128—1

1.    Разработаны Государственным учебно-научным учреждением «Биологический факультет Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова» (М. П. Кирпичников, Г. Е. Онищенко, Е. А. Смирнова, К. В. Шайтан, А. С. Шебанова, А. Г. Богданов, М. В. Ерохина); Учреждением Российской Академии наук «Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова» РАН (А. В. Феофанов, А. А. Игнатова); Учреждением Российской Академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт питания» РАМН (В. А. Ту-тельян, И. В. Гмошинский, С. А. Хотимченко, М. М. Г. Гаппаров); Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы» (С. А. Коно-ногов, С. С. Голубев); Учреждением Российской Академии наук «Центр «Биоинженерия» РАН (К. Г, Скрябин).

2.    Разработаны в рамках Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008—2011 годы».

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 11 ноября 2011 г.

4.    Введены в действие 11 ноября 2011 г.

5.    Введены впервые.

ББК 51.2

ISBN 978—5—7508—1128—1

© Роспотребнадзор, 2012 © Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2012

MP 1.2.0046—11

30 г/дм3 сахарозы (по п. 5.1.2.1), 10 см3 коммерческого препарата глута-рового альдегида (25 %-й водный раствор). С помощью pH-метра доводят pH буфера до 7,3 добавлением 1М НС1 и далее доводят объём раствора до 100 см3 дистиллированной водой.

Фиксирующий раствор готовят непосредственно перед использованием из расчета 4 сж на 1 образец.

5.1.2.4.    Приготовление 1 моль/дм3 раствора NaOH pH 14, а также 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 %-х водных растворов этанола проводят, как описано в МР 1.2.2641—10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах» (п. 5.1.3.3). Растворы этанола готовят из расчета 2 см3 на образец и хранят в плотно закрытых емкостях при температуре 4 °С в течение 1 месяца.

5.1.2.5.    Смесь эпоксидных смол готовят непосредственно перед использованием:

•    смесь А (смешивают эпон 812 и додецилянтарный ангидрид в соотношении 5 : 8 по объему, из расчета 3 см3 на 1 образец);

•    смесь Б (смешивают эпон 812 и метилэндиковый ангидрид в соотношении 8 : 7 по объему, из расчета 3 см3 на 1 образец);

•    объединяют смеси А и Б в соотношении 13 : 15 по объему в стеклянном стакане и перемешивают в течение 20—60 мин с помощью электромешалки со спиральной насадкой при скорости вращения 100— 120 об./мин, добавляют 1 % (по весу) катализатора полимеризации три-диметиламинофенола. Следует отметить, что оптимизация твердости полимерного блока может потребовать экспериментального подбора точных пропорций смолы и катализатора.

5.1.2.6.    Ацетон и эпоксидную смолу приготовленную по п. 5.1.2.5, но без добавления катализатора, смешивают в объемных соотношениях 3:1, 1:1,1 :3. Каждую смесь готовят непосредственно перед использованием из расчета 2 см3 на 1 образец.

5.1.3. Протокол подготовки проб к анализу

5.1.3.1.    Образцы вынимают из фиксатора и промывают в буферном растворе Соренсена (pH 7,2—7,4) 2—4 раза до получения прозрачного смыва.

5.1.3.2.    Образцы дегидратируют в серии спиртовых растворов восходящей концентрации:

•    10 %-м этанолом в течение 30 мин при 4 °С (процедуру повторяют 3—4 раза, до получения визуально прозрачного водно-спиртового смыва);

•    20 %-м этанолом в течение 30 мин при 4 °С;

MP 1.2.0046—11

Содержание

I.    Область применения...........................................................................................4

II.    Введение...............................................................................................................5

III.    Нормативные ссылки..........................................................................................7

IV.    Общие положения.............................................................................................11

V.    Подготовка проб для анализа наночастиц серебра, оксидов цинка,

алюминия, церия в тканях животных и растений...........................................15

5.1.    Методики подготовки проб для анализа наночастиц серебра,

оксидов цинка, алюминия, церия в тканях растений..............................15

5.2.    Методики подготовки проб для анализа наночастиц серебра,

оксидов цинка, алюминия, церия в тканях животных............................22

5.3.    Приготовление образцов сравнения из наночастиц серебра,

оксидов цинка, алюминия, церия.............................................................24

VI.    Анализ наночастиц в биологических образцах с применением

метода энергодисперсионной микроспектроскопии......................................25

6.1.    Технические характеристики применяемых средств измерений...........25

6.2.    Подготовка и настройка прибора перед проведением анализа

методом ПЭМ с ЭДС.................................................................................26

6.3.    Процедура проведения измерений............................................................27

VII.    Анализ полученных данных и представление результатов...........................29

7.1.    Анализ полученных данных......................................................................29

7.2.    Представление результатов анализа.........................................................41

Приложение L Обозначения и сокращения...........................................................43

Приложение 2. Рекомендуемая литература............................................................43

3

MP 1.2.0046—11

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

11 ноября 2011 г.

Дата введения: с момента утверждения

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Применение метода энергодисперсионной микроспектроскопии для анализа наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в тканях животных и растений

Методические рекомендации МР 1.2.0046—11

I. Область применения

1.1.    Настоящие методические рекомендации применяются для выявления и идентификации наночастиц серебра, оксидов цинка, алюминия и церия в тканях и органах животных и растений.

1.2.    Настоящие методические рекомендации могут использоваться:

•    при анализе разрабатываемых и новых наноматериалов, содержащих наночастицы серебра, оксидов алюминия, церия и цинка с целью оценки их безопасности;

•    в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с процессами производства и оборота наноматериалов на основе наночастиц серебра, оксидов алюминия, церия и цинка;

•    при проведении экспертизы пищевых продуктов, продукции сельского хозяйства, фармацевтической промышленности, биотехнологического производства;

•    при проведении мероприятий по осуществлению надзора (контроля) в процессе производства, транспортирования, хранения, реализа-

4

MP 1.2.0046—11

ции и утилизации наноматериалов на основе наночастиц серебра, оксидов алюминия, церия и цинка.

1.3.    Методические рекомендации разработаны с целью обеспечения единства процедур и средств подготовки образцов, проведения измерений и представления результатов в ходе выявления и идентификации наночастиц серебра, оксидов алюминия, церия и цинка в тканях животных и растений методом энергодисперсионной микроспетроскопии.

1.4.    Методические рекомендации предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями и иными организациями, проводящими исследования по оценке безопасности наноматериалов и продукции наноиндустрии.

II. Введение

Метод энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (далее -ЭДС) является одним из наиболее надёжных и широко применяемых методов аналитической электронной микроскопии. Метод является методом элементного анализа. В случае задач по выявлению и идентификации искусственных наночастиц в биологических образцах применение метода ЭДС в комбинации с методом просвечивающей электронной микроскопии (далее - ПЭМ) позволяет за относительно короткое время проанализировать элементный состав интересующей области образца (например, области, содержащей скопление наночастиц неизвестного происхождения либо единичные наночастицы).

Принцип метода состоит в регистрации характеристического рентгеновского излучения при возбуждении внутренних оболочек атомов образца падающими электронами пучка. При возбуждении электрона внутренней оболочки и его переходе на более высокий энергетический уровень происходит переход другого электрона с более высокого энергетического уровня на освободившуюся позицию, сопровождающийся эмиссией характеристического рентгеновского излучения. Энергия излучаемого рентгеновского фотона соответствует разности энергий энергетических уровней. При этом, согласно правилам отбора, могут иметь место только определённые электронные переходы. Рентгеновские фотоны, излучающиеся при переходе на К, L, М и так далее оболочки атома, обозначаются символами К, L, М и так далее соответственно. Греческими символами а, Р обозначаются рентгеновские фотоны, образую-

MP 1.2.0046—11

щиеся при конкретных, разрешённых правилами отбора, электронных переходах между подоболочками (рис. 1).

5

3

т

я

ш2 М

1

ш

all (33

м

и

*

L-серия

Г" J

МП L

1

"2 и

1

г

а1

1

а2

Г 1

pi

Г 1

К-серия

' к

Рис. 1. Энергетические уровни электронов в атоме и примеры обозначения рентгеновских фотонов, излучающихся при определённых электронных переходах (по [1], с изменениями)

Энергия характеристического рентгеновского излучения измеряется в килоэлектронвольтах (кэВ). Каждому химическому элементу соответствует набор характеристических энергий эмитируемого рентгеновского излучения, соответствующих возможным электронным переходам. Значения характеристических энергий рентгеновского излучения являются табличными. Если энергии фотонов, соответствующие двум разным переходам одного элемента, близки (например, фотоны Ка1 и Ка2), то в справочниках они представляются как одно значение (Ка1, 2).

Для применения метода ЭДС в комбинации с методом ПЭМ, просвечивающий электронный микроскоп должен быть оборудован детектором рентгеновского излучения. Рентгеновские фотоны попадают в

MP 1.2.0046—11

детектор, в котором образуются электрические заряды, пропорциональные энергии излучения. Заряды преобразуются в импульсы напряжения, высота которых пропорциональна величине зарядов. Импульсы напряжения анализируются с помощью многоканального анализатора высоты импульсов, с помощью которого анализируется количество импульсов, соответствующих каждой высоте. В итоге получается спектр, по оси х которого отложена энергия рентгеновского излучения, а по оси у - количество детектированных рентгеновских фотонов с данными значениями энергии. Анализируя спектр, можно определить элементный состав образца, сравнивая значения энергии пиков в спектре с табличными значениями характеристического излучения для элементов. Данная процедура проводится с помощью специального программного обеспечения. Однако следует отметить, что пики некоторых элементов могут перекрываться, поэтому специалисту, проводящему анализ, следует представлять, какие элементы могут присутствовать в образце.

Анализ методом ЭДС в комбинации с ПЭМ можно проводить в различных режимах. Одним из вариантов является получение рентгеновского спектра со всей области видимой на экране электронного микроскопа. Другим вариантом является точечный анализ: фокусировка электронного пучка в определённую точку образца и получение спектра с данной точки. Последний вариант позволяет надежно идентифицировать обнаруженные в образце наноразмерные электронно-плотные включения по их элементному составу. Для реализации данного режима измерения электронный микроскоп должен быть оснащён системой развёртки пучка, сканирующей приставкой, и, таким образом, иметь возможность работы в режиме сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (далее - СПЭМ).

Ш. Нормативные ссылки

3.1.    Федеральный закон от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

3.2.    Федеральный закон от 2 января 2000 г. N° 29-ФЗ «О качестве и безопасности пищевых продуктов».

3.3.    Федеральный закон от 26 июня 2008 г. № 102-ФЗ «Об обеспечении единства измерений»

3.4.    Федеральный закон от 27 декабря 2002 г. N° 184-ФЗ «О техническом регулировании».

3.5.    Федеральный закон от 10 января 2002 г. N° 7-ФЗ «Об охране окружающей среды».

7

MP 1.2.0046—11

3.6.    Постановление Правительства Российской Федерации от 30 июня 2004 г. № 322 «Об утверждении Положения о Федеральной службе в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека».

3.7.    Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. № 987 «О государственном надзоре и контроле в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов».

3.8.    Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. №988 «О государственной регистрации новых пищевых продуктов, материалов и изделий».

3.9.    Постановление Правительства Российской Федерации от 2 февраля 2006 г. № 60 «Об утверждении Положения о проведении социально-гигиенического мониторинга».

3.10.    Постановление Правительства Российской Федерации от 15 сентября 2005 г. № 569 «О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации».

3.11.    Приказ Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. №755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».

3.12.    Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики».

3.13.    Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 23 июля 2007 г. № 54 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы».

3.14.    Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 г. №79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов».

3.15.    СанПиН 2.6.1.2523—09 «Нормы радиационной безопасности (НРБ -99/2009)».

3.16.    ГН 1.2.2633—10 «Гигиенические нормативы содержания приоритетных наноматериалов в объектах окружающей среды».

3.17.    СП 2.2.2.1327—03 «Гигиенические требования к организации технологических процессов, производственному оборудованию и рабочему инструменту».

3.18.    МУ 1.2.2520—09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов».

8

MP 1.2.0046—11

3.19.    МУ 1.2.2636—10 «Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции, полученной с использованием нанотехнологий и наноматериалов».

3.20.    МУ 1.2.2741—10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных».

3.21.    МУ 1.2.2742—10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в растениях».

3.22.    МУ 1.2.2745—10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных».

3.23.    МУ 1.2.2873—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в водных беспозвоночных»,

3.24.    МУ 1.2.2874—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных».

3.25.    МУ 1.2.2875—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в водоемах».

3.26.    МУ 1.2.2876—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в растениях».

3.27.    МУ 1.2.2877—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в рыбах».

3.28.    МУ 1.2.2635—10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов».

3.29.    МР 1.2.2522—09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека».

3.30.    МР 1.2.2566—09 «Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo».

3.31.    МР 1.2.2639—10 «Использование методов количественного определения наноматериалов на предприятиях наноиндустрии».

3.32.    МР 1.2.2640—10 «Методы отбора проб, выявления и определения содержания наночастиц и наноматериалов в составе сельскохозяйственной, пищевой продукции и упаковочных материалов».

3.33.    МР 1.2.2641—10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах».

3.34.    МР 1.2.0022—11 «Порядок отбора проб для контроля за наноматериалами».

3.35.    МР 1.2.0023—11 «Контроль наноматериалов в пищевой продукции».

3.36.    ГОСТ 2603-79 «Реактивы. Ацетон. Технические условия».

3.37.    ГОСТ 4328-77 «Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия».

9