Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

41 страница

256.00 ₽

Купить МР 1.2.0045-11 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Методические рекомендации определяют порядок выявления и идентификации многостенных углеродных нанотрубок в срезах тканей животных и растений методами аналитической электронной микроскопии и применяются в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с процессами производства и оборота МУНТ.

  Скачать PDF

Оглавление

I Область применения

II Введение

III Нормативные ссылки

IV Общие положения

V Методика подготовки проб для выявления и идентификации МУНТ в срезах тканей растений

5.1. Перечень реактивов, необходимых для подготовки проб растений

5.2. Перечень расходных материалов и оборудования, необходимых для подготовки проб растений

5.3. Растворы и смеси, необходимые для подготовки проб растений

5.4. Подготовка проб растений к анализу

VI Методика подготовки проб для выявления и идентификации МУНТ в срезах тканей животных

6.1. Перечень реактивов, необходимых для подготовки проб тканей животных

6.2. Перечень расходных материалов и оборудования, необходимых для подготовки проб тканей животных

6.3. Растворы и смеси, необходимые для отбора и подготовки проб животных

6.4. Специфика пробоотбора тканей животных для анализа на содержание МУНТ

6.5. Подготовка проб тканей животных к анализу

6.6. Процедура подготовки образца сравнения МУНТ

VII Методика проведения измерений

7.1. Процедура измерений

7.2. Регистрация изображений и картины электронной дифракции от образца сравнения МУНТ

7.3. Процедура выявления МУНТ в срезах тканей животных или растений

VIII Анализ полученных данных

8.1. Преобразование полученных изображений в форму удобную для анализа

8.2. Программное обеспечение для анализа изображений и электронограмм

8.3, Идентификация МУНТ по морфометрическим критериям

8.4. Идентификация МУНТ методом дифракции электронов

8.5. Анализ плотности распределения МУНТ

IХ Представление полученных данных

Х Обозначения и сокращения

Показать даты введения Admin

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27
Стр. 28
стр. 28
Стр. 29
стр. 29
Стр. 30
стр. 30

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Порядок выявления и идентификации многостенных углеродных нанотрубок в срезах тканей животных и растений методами аналитической электронной микроскопии

Методические рекомендации МР 1.2.0045-11

Издание официальное

Москва • 2012

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Порядок выявления и идентификации многостенных углеродных нанотрубок в срезах тканей животных и растений методами аналитической электронной микроскопии

Методические рекомендации МР 1.2.0045-11

MP 1.2.0045-11

3.43.    ГОСТ 5833-75 «Реактивы. Сахароза. Технические условия».

3.44.    ГОСТ Р 51652-2000 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия».

3.45.    ГОСТ 24104-2001 «Весы лабораторные. Общие технические требования».

3.46.    ГОСТ 27987-88 «Анализаторы жидкости потенциометрические ГСП. Общие технические условия».

3.47.    ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».

3.48.    ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».

3.49.    ГОСТ 29227-91 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».

3.50.    ГОСТ 21240-89 «Скальпели и ножи медицинские. Общие технические требования и методы испытаний».

3.51.    ГОСТ 21241-89 «Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний».

3.52.    ГОСТ 26678-85 «Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия».

3.53.    ГОСТ 3-88 «Перчатки хирургические резиновые. Технические условия».

3.54.    ГОСТ 2493-75 «Реактивы. Калий фосфорно-кислый двузамещенный 3-водный. Технические условия».

3.55.    ГОСТ 4568-95 «Калий хлористый. Технические условия».

3.56.    ГОСТ 4233-77 «Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия».

3.57.    ГОСТ 1625-89 «Формалин технический. Технические условия».

3.58.    ГОСТ 4517-87 «Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе».

3.59.    ГОСТ 20015-88 «Хлороформ. Технические условия».

3.60.    ГОСТ 21239-93 «Инструменты хирургические. Ножницы. Общие требования и методы испытаний».

3.61.    ГОСТ 7.32-2001 «Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления».

IV. Общие положения

4.1. Выявление и идентификация МУНТ в тканях животных и растений проводится в целях:

10

MP 1.2.0045-11

—    оценки экспозиции человека МУНТ через пищевое сырьё животного и растительного происхождения;

—    экспертизы продукции наноиндустрии, полученной или содержащей МУНТ, производимой на территории Российской Федерации или ввозимой на территорию Российской Федерации;

—    санитарно-гигиенического нормирования содержания МУНТ в потребительской продукции и объектах окружающей среды;

—    государственного надзора (контроля) за использованием МУНТ и продукции их содержащей в процессе разработки, производства, хранения, транспортирования, реализации и утилизации;

—    мониторинга загрязнения окружающей среды МУНТ;

—    проверки оценки соответствия продукции наноиндустрии установленным требованиям;

—    разработки мер по охране окружающей среды от вредного воздействия МУНТ и их производных.

4.2.    Порядок и методы отбора проб, выявления и идентификации МУНТ в пробах тканей животных и растительных организмов устанавливаются в соответствии с действующими методическими документами для соответствующих видов объектов окружающей среды и продукции: МУ 1.2.2740—10, МУ 1.2.2741-10, МУ 1.2.2742-10, МУ 1.2.2743-10, МУ 1.2.2744-10, МУ 1.2.2745-10, МУ 1.2.2869-11, МУ 1.2.2873-11, МУ 1.2.2874-11, МУ 1.2.2876-11, МУ 1.2.2877-11, MP 1.2.2640-10, MP 1.2.0022-11, МР 1.2.0023—11.

4.3.    Выбор объектов и пробоотбор растений для выявления и идентификации в них МУНТ производят согласно МУ 1.2.2742—10, МР 1.2.2640-10 и МУ 1.2.2876-11.

4.4.    Выбор объектов контроля, отбор материала для последующего выявления и идентификации МУНТ в срезах тканей животных, транспортирование и хранение образцов осуществляют в соответствии с положениями, изложенными в МУ 1.2.2741—10 и 1.2.2745—10. При проведении анализа тканей животных, которые не относятся к категории лабораторных, порядок отбора проб аналогичен. Перечень видов и нормы отлова животных, подлежащих исследованию, устанавливают органы и учреждения, осуществляющие, санитарно-эпидемиологический и экологический надзор. При выявлении МУНТ в рамках проведения санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции мясного животноводства отбор проб производят в соответствии с МР 1.2.2640—10.

4.5.    Технические характеристики электронных микроскопов и вспомогательного лабораторного оборудования, применяемых при выявлении и идентификации МУНТ в тканях животных и

MP 1.2.0045-11

растений, меры безопасности при проведении лабораторных работ определены в методических рекомендациях МР 1.2.2639—10 и 1.2.2641-10.

У. Методика подготовки проб для выявления и идентификации МУНТ в срезах тканей растений

5.1. Реактивы, необходимые для подготовки проб растений

Ацетон, квалификация чда

Гкдроксид натрия (NaOH), квалификация хч

Глутаровый альдегид (25 %-й водный раствор), Grade I, для использования в электронной микроскопии

Дистиллированная вода

Дихлорэтан

Додецилянтарный ангидрид фирмы «Sig-ma-Aldrich» (США) или аналогичный

Калий фосфорно-кислый однозамещен-ный, хч

Кислота соляная (НС1), квалификация хч

Метилэндиковый ангидрид МЭА-610 фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный

Натрий фосфорно-кислый двузамещен-НЫЙ12-ВОДНЫЙ, хч

Сахароза, квалификация хч

Спирт этиловый абсолютированный (содержание - 99,8 % по объему)

Спирт этиловый ректифицированный, 96 %-Й

12

MP 1.2.0045-11

Тридиметиламинофенол (катализатор DMP-30) фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный

Формвар (Formvar®solution) для микроскопии фирмы «Sigma Aldrich» (США) или аналогичный

Эпоксидная смола (Эпон 812) фирмы «Sigma-Aldrich» (США) или аналогичный

5.2. Расходные материалы и оборудование, необходимые для подготовки проб растений

Материалы и оборудование для отбора

проб растений    МУ 2742—10

МУ 1.2.2876-11

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с погрешностью

взвешивания не более 0,001 г    ГОСТ 24104-2001

Дистиллятор, производительностью от 1 дм3/ч, обеспечивающий получение дистиллированной воды    ГОСТ 6709-79

pH-метр    ГОСТ    27987-88

или аналогичный

Посуда лабораторная стеклянная (колбы стеклянные вместимостью 100 см3, пробирки стеклянные вместимостью 20 см3 с резиновой пробкой, чашки Петри стеклянные диаметром 12 см)    ГОСТ    25336—82

Посуда мерная лабораторная (цилиндр

мерный из стекла вместимостью 100 см3

с наименьшей ценой деления 1 см3,

колба мерная стеклянная с притертой

крышкой вместимостью 250 см3)    ГОСТ    1770—74

Пипетки стеклянные или пластиковые градуированные вместимостью 5 см3 ГОСТ 29227-91

Магнитная мешалка с регулируемой частотой вращения магнитного якоря

13

MP 1.2.0045-11

в диапазоне 100—1 200об./мин, рассчитанная на объем до 1,0 дм3

Система для фильтрации растворов стеклянная вместимостью 1,0 дмс вакуумным насосом

Мембраны эфирно-целлюлозные толщиной 150 мкм, диаметром 47 мм, с размером пор 0,22 мкм

Автоматические дозаторы с переменным объемом дозирования 100—1 000,

20—200 и 2—20 мм3

Наконечники для автоматических дозаторов полистирольные нестерильные вместимостью 1 —200 и 100— 1 000 мм3

Скальпель.    ГОСТ 21240-89

Пинцет медицинский    ГОСТ 21241-89

Медицинский шприц объёмом 50—100 см3 (для удаления воздуха из растений)

Штативы для пробирок

Электромешалка с насадкой спирального типа низкоскоростная (до 250 об./мин) для приготовления эпоксидных смол

Суховоздушный термостат с диапазоном регулируемых температур от 25 до 80 °С и точностью ± 0,1 “С

Ламинарный бокс биологической безопасности класс 11

Вытяжной шкаф, оборудованный фильтром для улавливания наночастиц

Холодильник бытовой электрический    ГОСТ 26678-85

Перчатки хирургические резиновые нестерильные    ГОСТ 3-88

14

MP 1.2.0045-11

стеклянная палочка длиной 220 мм, диаметром 3—5 мм

Бинокулярная лупа, оснащенная настольным штативом, с линейным полем зрения от 2 до 10 см и диапазоном увеличений 0,6х, 1х, 2х

Полипропиленовые пробирки для микро-проб однократного применения типа «Эппендорф» вместимостью

1,5 и 2,0 см3    ТУ    64-2-30—80

Полиэтиленовые капсулы с плоским или коническим дном для заливки образцов, диаметр от 6 мм, выдерживающие нагрев до 75 °С или полипропиленовые аналогичные капсулы, выдерживающие нагрев до 100 °С производства ВЕЕМ® Embedding Capsule или аналогичные

Контейнеры тефлоновые с размером лунки от 0,5 х 0,5 до 1,0 х 1,0 см для заливки образцов в эпоксидную смолу

Лобзик для обработки залитых в эпоксидную смолу образцов

Бритва фирмы «Ted Pella, Inc.» (США), кат. № 121-1 или аналогичная

Пинцет для электронно-микроскопических работ 110 мм тип 5 кончик 0,05 х0,01 мм (или 115 мм тип 7 кончик 0,10 х 0,06 мм) ненамагничивающийся фирмы «Ted Pella»

Держатели для прямоугольных и круглых эпоксидных блоков, совместимые с используемым ультрамикротомом, фирма «Ted Pella, Agar Scientific» или аналогичные

Электронно-микроскопические бленды (медные), с круглым отверстием диаметром 1 мм, 3 мм или овальным

15

MP 1.2.0045-11

отверстием 1 х 2 мм, покрытые формва-ровой пленкой

Контейнеры для хранения бленд

«Parafilm» (пластичная парафиновая пленка с отделяемой бумажной основой)

Ультрамикротом, обеспечивающий получение ультратонких срезов биологических образцов толщиной 30—100 нм, скорость резания 0,4—1,0 мм/с, термопередача 40—60 нм

Прибор для изготовления стеклянных ножей для ультрамикротомов LKB 7800 или аналогичный

Специальное стекло для изготовления стеклянных ножей ширина 25 мм, длина 400 или 200 мм, толщина 6 или 10 мм фирмы «TedPella, Agar Scientific» или аналогичный

Пластиковые одноразовые ванночки для сбора срезов для стеклянных или алмазных ножей фирмы «TedPella» или аналогичные

Химически чистое отшлифованное стекло для получения формваровой плёнки

Специальный стеклянный стакан для приготовления и хранения раствора формвара

Перед использованием инструменты (скальпель, пинцет, бритва, лобзик) подвергают тщательной обработке в ультразвуковой ванне или пользуются одноразовыми инструментами во избежание перекрестной контаминации образцов МУНТ.

MP 1.2.0045-11

5.3. Растворы и смеси, необходимые для подготовки пробрастений

Рабочие растворы готовят в соответствии с общепринятыми правилами лабораторной практики. pH растворов контролируют при помощи pH-метра. Приготовленные растворы фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.

5.3.1.    Приготовление двукратного 0,2моль/дмЗ буферного раствора Соренсена (0,06 моль/дмЗ КН2Р04, 0,14моль/дмЗ Na2HP04) pH 7,2—7,4, с добавлением 30 г/дмЗ сахарозы:

-    готовят вспомогательный раствор 1,0 моль/дм3 КН2Р04. На лабораторных весах взвешивают 136 г КН2Р04 и вносят в мерную колбу объемом 1 000 см3, содержащую 500 см* дистиллированной воды. Перемешивают до полного растворения и объем раствора доводят до 1 000 см3 дистиллированной водой. Раствор фильтруют и хранят при температуре не выше 25 °С не более 6 месяцев;

-    готовят вспомогательный раствор 1,0 моль/дм3 Na3HP04. На лабораторных весах взвешивают 358,2 г Na2HP04 х 12Н,0 и вносят в мерную колбу объемом 1 000 см3, содержащую 500 смдистиллированной воды. Перемешивают до полного растворения и объем раствора доводят до Г000 см3 дистиллированной водой. Раствор фильтруют и хранят при температуре не выше 25 “С не более 6 месяцев;

-    для приготовления двукратного 0,2 моль/дм3 раствора Соренсена с добавлением 30 г/дм3 сахарозы на лабораторных весах готовят навеску 30,0 г сахарозы и помещают в мерную колбу объемом 1 000 см3. В колбу с веществом вносят 300 см3 дистиллированной воды, 60 см31,0 моль/дм3 раствора КН2Р04,140 см31,0 моль/дмраствора Na2HPO и растворяют при перемешивании. Объем раствора доводят до I 000 см3 дистиллированной водой, фильтруют и хранят при температуре не более 25 "С в течение 1 месяца.

5.3.2.    Приготовление однократного 0,1 моль/дм3 раствора Соренсена (0,03 моль/дм3 КН2Р04, 0,07 моль/дм3 Na2HP04), pH 7,2—

7,4, с добавлением 15 г/дм3 сахарозы.

Для приготовления 100 см3 однократного раствора Соренсена (0,1 моль/дм3) с добавлением 15 г/дм3 сахарозы к 50 см3 двукратного раствора Соренсена с добавлением 30 г/дм3 сахарозы (приготовление описано в п. 5.3.1) добавляют 50 см3 дистиллированной воды.

5.3.3.    Приготовление фиксирующего раствора (0,1 моль/дмраствор Соренсена pH 7,2—7,4 и 2,5 % глутарового альдегида).

Для приготовления 100 см3 фиксирующего раствора в мерную колбу вносят 50 см3 двухкратного раствора Соренсена с добавлением 30 г/дм3 сахарозы (по п. 5.3.1)и 10 см3 коммерческого препарата

17

MP 1.2.0045-11

глутарового альдегида (25 %-й водный раствор). С помощью рН-метра доводят pH буфера до 7,3 добавлением 1 М НС1 и далее доводят объём раствора до 100 см3 дистиллированной водой. Фиксирующий раствор готовят непосредственно перед использованием из расчета 4 см3 на 1 образец.

Примечание. При работе с глутаровым альдегидом необходимо соблюдать меры техники безопасности и использовать средства индивидуальной зашиты.

5.3.4.    Приготовление 1,0моль/дм3 раствора NaOH pH 14 и 2 %-го водного раствора тетраоксида осмия детально описано в МР 1.2.2641—10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах» (пп. 5.1.3.3).

5.3.5.    Водные растворы этанола с концентрацией 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 и 80 % готовят путем смешивания 96 %-го этилового спирта и дистиллированной воды согласно табл. 1. Растворы этанола готовят из расчета 2 см3 на образец и хранят в плотно закрытых емкостях при температуре 4 "С не более 1 месяца.

Таблица I

Приготовление водных растворов этанола

Концентрация этанола в растворе, %

Количество 96 %-го этилового спирта, см3

Количество дистиллированной воды, см3

10

104

896

20

208

792

30

333

667

40

417

583

50

521

479

60

625

375

70

730

270

80

833

167

5.3.6. Приготовление смеси эпоксидных смол.

Смесь эпоксидных смол готовят непосредственно перед использованием:

— готовят смесь А (смешивают эпон 812 и додецилянтарный ангидрид в соотношении 5 : 8 по объему, из расчета 3 см3 на 1 образец);

18

MP 1.2.0045-11

—    готовят смесь Б (смешивают эпон 812 и метилэндиковый ангидрид в соотношении 8 : 7 по объему, из расчета 3 см3 на 1 образец);

—    объединяют смеси А и Б в соотношении 13:15 по объему в стеклянном стакане и перемешивают в течение 20—60 мин с помощью электромешалки со спиральной насадкой при скорости вращения 100—120 об./мин, добавляют 1 % (по массе) катализатора полимеризации (триметиламинофенол). Следует отметить, что оптимизация твердости полимерного блока может потребовать экспериментального подбора точных пропорций смолы и катализатора.

5.3.7. Приготовление смесей ацетона и эпоксидной смолы.

Ацетон и эпоксидную смолу без добавления катализатора, приготовленную по п. 5.3.6, смешивают в объемных соотношениях 3:1, 1:1, 1:3. Каждую смесь готовят непосредственно перед использованием из расчета 2 см3 на 1 образец.

5.4. Подготовка проб растений к анализу

5.4.1.    Отобранные образцы тканей растений промывают в чашке Петри с 0,1 моль/дм3 буфером Соренсена (pH 7,2—7,4). Затем образцы разрезают на части линейного размера 3—5 мм. Чтобы минимизировать проникновение в ткани растений пузырьков воздуха, препятствующих эффективному проникновению фиксатора и снижающих качество получаемых образцов, при помощи медицинского шприца вручную откачивают воздух из вырезанных участков.

5.4.2.    Образцы каждого вида от одной объединенной пробы помещают в отдельный пенициллиновый флакон или контейнер с фиксирующим раствором. Флаконы маркируют с указанием вида растения, органа (из которого взяты образцы), даты и места сбора. Срок хранения образцов в фиксирующем растворе при температуре 4 °С — не более 2 месяцев. Нельзя допускать замораживания образцов при хранении.

5.4.3.    Для выявления и идентификации МУНТ в тканях растений методом ПЭМ не требуется дофиксация тетраоксидом осмия и контрастирование проб уранилацетатом.

5.4.4.    Протокол подготовки проб к анализу:

а)    провести отмывку фиксатора в 0,1 М буфере Соренсена pH 7,2-7,4 с сахарозой 15 г/дм3;

б)    провести обезвоживание образцов в серии растворов этанола возрастающих концентраций. Для этого пробы обрабатывают 2 см3 каждого из спиртовых растворов в следующем порядке:

—    10 %-м этанолом в течение 30 мин при 4 °С (процедуру повторяют 3—4 раза, до получения визуально прозрачного водноспиртового смыва);

19

ББК 51.2 П59

П 59 Порядок выявления и идентификации многостенных углеродных нанотрубок в срезах тканей животных и растений методами аналитической электронной микроскопии: Методические рекомендации.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2012,—39 с.

ISBN 978-5-7508-1138-0

1.    Разработаны Государственным учебно-научным учреждением «Биологический факультет Московского государственного университета им, М. В. Ломоносова» (М. П. Кирпичников, Г Е. Онищенко, Е. А. Смирнова, К. В. Шайтан, М. В. Ерохина, А. С. Шебанова); Учреждением Российской Академии наук «Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова» РАН (А. В, Феофанов,

А. А. Игнатова); Учреждением Российской Академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт питания» РАМН (В. А. Тутельян,

И, В. Гмошинский, С А. Хотимчснко, М. М. Г Гаппаров); Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы» (С. А. Кононогов,

С. С. Голубев); Учреждением Российской Академии наук «Центр «Биоинженерия» РАН (К. Г. Скрябин).

Разработаны в рамках Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008—2011 гг».

2.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 11 ноября 2011 г

3.    Введены в действие 11 ноября 20 И г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.2

© Роспотребнадзор, 2012

© Федеральный центр гигиены

и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2012

MP 1.2.0045-11

—    20 %-м этанолом в течение 30 мин при 4 °С;

—    30 %-м этанолом в течение 30 мин при 4 °С;

—    40 %-м этанолом в течение 30 мин при 4 'С;

—    50 %-м этанолом в течение 30 мин при 4 'С;

—    60 %-м этанолом в течение 30 мин при 4 'С;

—    80 %-м этанолом в течение 30 мин при комнатной температуре;

—    96 %-м этанолом в течение 30 мин при комнатной температуре;

в)    два раза выдержать образцы в 100 %-м ацетоне в течение 60 мин;

г)    приготовить эпоксидную смолу, как описано в п. 5.3.6;

д)    провести процедуру замещения ацетона эпоксидной смолой: инкубировать образцы в смеси ацетон—эпоксидная смола (3 :1) в течение 24 ч, затем в смеси ацетон—смола (1 :1) в течение 24 ч, затем в смеси ацетон—смола (1: 3) в течение 24 ч;

е)    при помощи стеклянной палочки перенести образцы в заливочные контейнеры с чистой смолой (100 %-я эпоксидная смола с катализатором);

ж)    для полимеризации смолы контейнеры с образцами поместить в термостат и выдерживать при 37 °С в течение 24 ч, при 45 °С в течение 24 ч, и затем при 60 °С в течение 24 ч;

з)    из полностью полимеризованного образца выпилить с помощью лобзика прямоугольный блок размером 2x2x5 мм;

и)    закрепить блок в специальном держателе и, используя для наблюдения бинокулярный микроскоп, бритвой срезать блок в виде усеченной пирамиды;

к)    с меньшего основания усеченной пирамиды с помощью ультрамикротома, оснащенного стеклянным или алмазным ножом, получить срезы толщиной 40—80 нм. Для повышения статистической значимости результатов анализа нарезку пробы организуют в виде 4—6 серий, отстоящих друг от друга не менее чем на 100 мкм, по 10 срезов в каждой серии;

л)    случайно выбранные срезы (по 1—2 из каждой серии) выловить на бленды, покрытые формваровой пленкой, и высушить в течение не менее 1 ч. Необходимо удостовериться, что на отобранных срезах присутствует ткань.

MP 1.2.0045-11

Содержание

I.    Область применения............................5

II.    Введение...................................6

Ш.    Нормативные ссылки............................7

IV.    Общие положения.............................10

V    Методика подготовки проб для выявления и идентификации

МУНТ в срезах тканей растений....................12

5.1.    Перечень реактивов, необходимых для подготовки

проб растений...........................12

5.2.    Перечень расходных материалов и оборудования,

необходимых для подготовки проб растений.........13

5.3.    Растворы и смеси, необходимые для подготовки

проб растений...........................17

5.4.    Подготовка проб растений к анализу..............19

VI.    Методика подготовки проб для выявления

и идентификации МУНТ в срезах тканей животных.........21

6.1.    Перечень реактивов, необходимых для подготовки

проб тканей животных......................21

6.2.    Перечень расходных материалов и оборудования, необходимых для подготовки проб тканей животных. . , . 22

6.3.    Растворы и смеси, необходимые для отбора

и подготовки проб животных..................26

6.4.    Специфика пробоотбора тканей животных для анализа

на содержание МУНТ.......................27

6.5.    Подготовка проб тканей животных к анализу.........27

6.6.    Процедура подготовки образца сравнения МУНТ......29

VII.    Методика проведения измерений....................29

7.1.    Процедура измерений.......................29

7.2.    Регистрация изображений и картины электронной

дифракции от образца сравнения МУНТ...........30

3

MP 1.2.0045-11

7.3. Процедура выявления МУНТ в срезах тканей

животных или растений......................31

VIII.    Анализ полученных данных.......................33

8.1.    Преобразование полученных изображений

в форму, удобную для анализа..................33

8.2.    Программное обеспечение для анализа

изображений и электронограмм.................34

8.3.    Идентификация МУНТ по морфометрическим

критериям..............................34

8.4.    Идентификация МУНТ методом дифракции электронов. . 35

8.5.    Анализ плотности распределения МУНТ...........36

IX.    Представление полученных данных..................37

X.    Обозначения и сокращения.......................39

4

MP 1.2.0045-11

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г Г Онищенко

II ноября 2011 г.

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Поряцок выявления и идентификации многостенных углеродных нанотрубок в срезах тканей животных и растений методами аналитической электронной микроскопии

Методические рекомендации МР 1.2.0045-11

I. Область применения

1.1.    Настоящие методические рекомендации определяют порядок выявления и идентификации многостенных углеродных нанотрубок (далее — МУНТ) в срезах тканей животных и растений методами аналитической электронной микроскопии.

1.2.    Настоящие методические рекомендации применяются в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с процессами производства и оборота МУНТ.

1.3.    Методические рекомендации могут использоваться для выявления и идентификации МУНТ:

—    при анализе биологической безопасности разрабатываемых новых и уже используемых наноматериалов, содержащих МУНТ, для растений, животных и человека;

—    в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с процессами производства и оборота наноматериалов на основе МУНТ;

—    при проведении экспертизы безопасности продукции сельского хозяйства, биотехнологического производства, пищевых продуктов и ингредиентов животного и растительного происхождения;

—    при проведении мероприятий по осуществлению надзора (контроля) в процессе разработки, производства, хранения, транспортирования, реализации и утилизации МУНТ.

5

MP 1.2.0045-11

1.4.    Методические рекомендации разработаны с целью обеспечения единства измерений при выявлении и идентификации МУНТ.

1.5.    Методические рекомендации предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, научно-исследовательских организаций гигиенического профиля и медицинских учебных заведений, а также иных организаций и учреждений, занимающихся вопросами обнаружения и определения МУНТ.

II. Введение

Углеродные нанотрубки представляют собой линейные (протяженные) цилиндрические каркасные конструкции, состоящие из свёрнутых в бесшовную трубку графеновых листов. Различают одностенные нанотрубки и многостенные — МУНТ. Последние представляют собой конструкции из коаксиально вложенных одна в другую однослойных нанотрубок разного диаметра. Расстояние между соседними графитовыми слоями МУНТ близко к величине 0,34 нм, присущей расстоянию между соседними плоскостями кристаллического графита. Другим показателем структуры нанотрубок является спиральность, то есть величина атомарного сдвига, достигаемого при замыкании плоского слоя, образованного атомами углерода, в трубку. Разнообразие структур МУНТ проявляется как в продольном, так и в поперечном направлении. Структура и диаметр влияют на электропроводность нанотрубок, которые могут вести себя как металлы, полупроводники, полуметаллы.

Обладая уникальными электропроводными, механическими, теплопроводными свойствами, углеродные нанотрубки находят всё более широкое применение в микроэлектронике, входят в состав композиционных материалов, применяются при производстве дисплеев и светодиодов. Высокое отношение поверхностной площади к массе и высокая адсорбционная способность позволяют их применение в различных фильтровальных системах. Способность МУНТ проникать через биологические мембраны, их проходимость через гематоэнцефалический барьер служат основанием для активного проведения исследований по использованию нанотрубок в качестве наноносителей для доставки лекарственных препаратов.

В промышленных условиях производятся МУНТ различного диаметра (от 2,5 до 100 нм) и различной степени очистки в виде порошков, суспензий в органических растворителях, в отдельных

MP 1.2.0045-11

случаях в виде гелей или пленок. По данным консалтинговой компании Clientifica (www.Clientifica.com) мировое производство углеродных нанотрубок и нановолокон в 2004 г. составило 65 т. Производство МУНТ в России активно развивается, и следует ожидать, что в ближайшее время производимые количества МУНТ возрастут до промышленных объёмов, Увеличение масштабов производства МУНТ неизбежно приведет к их накоплению в окружающей среде и, благодаря их уникальным свойствам легко проникать через биомембраны, в организмах животных и растений, а также человека.

Таким образом, существует актуальная потребность в разработке эффективных методик детекции и мониторинга МУНТ в биотических компонентах экосистем, продукции сельского хозяйства, пищевой продукции с целью своевременного выявления уровней их накопления, опасных для здоровья человека. Одной из задач настоящих методических рекомендаций является формирование единого методического подхода к выявлению и идентификации МУНТ в срезах тканей животных и растений, обеспечивающего получение валидных результатов с заданными метрологическими характеристиками.

III. Нормативные ссылки

3.1.    Федеральный закон от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

3.2.    Федеральный закон от 2 января 2000 г № 29-ФЗ «О качестве и безопасности пищевых продуктов».

3.3.    Федеральный закон от 26 июня 2008 г, № 102-ФЗ «Об обеспечении единства измерений».

3.4.    Федеральный закон от 27декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании».

3.5.    Федеральный закон от 10 января 2002 г. N° 7-ФЗ «Об охране окружающей среды».

3.6.    Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. № 987 «О государственном надзоре и контроле в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов».

3.7.    Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. N° 988 «О государственной регистрации новых пищевых продуктов, материалов и изделий».

3.8.    Постановление Правительства Российской Федерации от 2 февраля 2006 г. № 60 «Об утверждении Положения о проведении социально-гигиенического мониторинга».

3.9.    Постановление Правительства Российской Федерации от 15 сентября 2005 г. N° 569 «О Положении об осуществлении госу-

MP 1.2.0045-11

дарственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации».

3.10.    Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики».

3.11.    Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 23 июля 2007 г. № 54 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащих наноматериалы».

3.12.    Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 г. № 79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов».

3.13.    Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 19 июля 2007 г. № 224 «О санитарно-эпидемиологических экспертизах, обследованиях, исследованиях, испытаниях и токсикологических, гигиенических и иных видах оценок».

3.14.    СанПиН 2.6.1.2523—09 «Нормы радиационной безопасности (НРБ —99/2009)».

3.15.    ГН 1.2.2633—10 «Гигиенические нормативы содержания приоритетных наноматериалов в объектах окружающей среды».

3.16.    СП 2.2.2.1327—03 «Гигиенические требования к организации технологических процессов, производственному оборудованию и рабочему инструменту.

3.17.    МУ 1.2.2520—09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов».

3.18.    МУ 1.2.2634—10 «Микробиологическая и молекулярногенетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза».

3.19.    МУ 1.2.2635—10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов».

3.20.    МУ 1.2.2636—10 «Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции, полученной с использованием нанотехнологий и наноматериалов».

3.21.    МУ 1.2. 2741—10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных».

3.22.    МУ 1.2.2742—10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в растениях».

3.23.    МУ 1.2.2745—10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных».

8

MP 1.2.0045—11

3.24.    МУ 1.2.2873—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в водных беспозвоночных».

3.25.    МУ 1.2.2874—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных».

3.26.    МУ 1.2.2875—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в водоемах».

3.27.    МУ 1.2.2876—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в растениях».

3.28.    МУ 1.2.2877—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в рыбах».

3.29.    МР 1.2.2522—09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека».

3.30.    МР 1.2.2566—09 «Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo».

3.31.    МР 1.2.2639—10 «Использование методов количественного определения наноматериалов на предприятиях наноиндустрии».

3.32.    МР 1.2.2640—10 «Методы отбора проб, выявления и определения содержания наночастиц и наноматериалов в составе сельскохозяйственной, пищевой продукции и упаковочных материалов».

3.33.    МР 1.2.2641—10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах».

3.34.    МР 1.2.0022—11 «Порядок отбора проб для контроля за наноматериалами».

3.35.    МР 1.2.0023—11 «Контроль наноматериалов в пищевой продукции».

3.36.    ГОСТ 2603-79 «Реактивы. Ацетон. Технические условия».

3.37.    ГОСТ 4328-77 «Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия».

3.38.    ГОСТ 6709-72 «Вода дистиллированная. Технические условия».

3.39.    ГОСТ 1942-86 «1,2-Дихлорэтан технический. Технические условия».

3.40.    ГОСТ 4198-75 «Реактивы. Калий фосфорно-кислый од-нозамещенный. Технические условия».

3.41.    ГОСТ 3118-77 «Реактивы. Кислота соляная. Технические условия».

3.42.    ГОСТ 4172-76 «Реактивы. Натрий фосфорно-кислый двузамешенный 12-водный. Технические условия».

9