ДРОЖЖИ КОРМОВЫЕ - ПАПРИН

Методы определения 3,4-бензпирена

Издание официальное

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ Минск

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН МТК 326. институтом мигания Российской АМН. ВНИИканцерогенеза ВОНЦ Российской АМН

ВНЕСЕН Госстандартом Российской Федерации

2    ПРИНЯТ Межгосударственным Советом но стандартизации, метрологии и сертификации 15.04.94 (отчет Технического секретариата № 2)

За принятие проголосовали:

Наименование госуларсгна	Наименование национальною органа по стандартизации
Республика Армении Республика Беларусь Республик:! Казахстан Киргизская Республика Республика Молдова Российская Федерация Туркменистан Украина	Арм госстандарт Госстандарт Беларуси Госстандарт Республики Казахстан Киргиэстандарт Молдовасшнларг Госстандарт России Гланная государе тонная инспекция Туркменистана Госстандарт Украины

3    Постановлением Комитета Российской Федерации по стандартизации, метрологии и сертификации 29 февраля 19% г. № 147 межгосударственный стандарт ГОСТ 30087-93 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 января 1997 г.

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5    ПЕРЕИЗДАНИЕ

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания на территории Российской Федерации без разрешения Госстандарта России

94

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ДРОЖЖИ КОРМОВЫЕ— ПАПРИН

Методы определения 3,4-бензпирена

Fodder yeast — paprinc. Methods for determination of 3,4-benzopyrene

Дата введения 1997—01—01

Настоящий стандарт распространяется на кормовые дрожжи—паприн и устанавливает методы определения в них 3,4-бензпирена.

1    Методы отбора проб

Отбор проб — по ГОСТ 28178.

2    Метод низкотемпературной спектрофлуоримегрии

(метод III польского)

Сущность метода заключается в экстракции углеводородов, в том числе 3.4-бензпирена, гексаном из продукта, предварительно обработанного спиртовым раствором едкого калия, выделении фракции полициклических ароматических углеводородов тонкослойной хроматографией на окиси алюминия и количественном определении в полученной фракции

3,4-бензпирсна низкотемпературной спектрофлуориметрией (метод Ш польского).

2.1 Аппаратура и реактивы

Спектрофотометр флуоресцентный с криогенной приставкой для измерений при температуре жидкого азота (—196) *С (типов Хитачи-850. MPF-43A. MPF-44B или других типов).

Хроматоскоп или облучатель ультрафиолетовый типа ОЛД.

Шкаф сушильный лабораторный типа СНОЛ, обеспечивающий температуру 250—300 *С.

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания-200 г по ГОСТ 24104*.

Весы лабораторные технические любого типа.

Испаритель ротационный типа ИР-1М.

Баня водяная.

Сосуд Дьюара для жидкого азота любой вместимости.

Ванны для хроматофлфирования (фотокюветы эмалированные).

Пластины стеклянные размером 15x30 и 15x40 см.

Экстрактор (рисунок I).

Насадка Дина и Старка по нормативному документу.

Колбы К-1—250—29/32 ТХС. К-1-500-29/32 ТХС или П-1-500-29/32 ТХС но ГОСТ 25336.

Холодильник ХПТ-2—400—29/32 ХС и ХШ-1-300-29/32 или ХШ-1-400-29/32 ХС по ГОСТ 25336.

Холодильник ХПТ-1-300-14/23 ХС или ХПТ-1-400-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

• С 1 июля 2002 г. вводится н действие ГОСТ 24 КМ—2001 (здесь и далее).

Издание официальное

Дефлегматор 250-19/26-29/32 ТС или дефлегматор 300-19/26-29/32 ТС но ГОСТ 25336.

Пробирки стеклянные П2—10—180 ХС по ГОСТ 25336.

Алонж АИО-14/23-50 ТС по ГОСТ 25336.

Насадка Н-1-19/26-14/23-14/23 ТС или Н2-19/26-14/23 по ГОСТ 25336.

Пипетки вместимостью 1. 2. 5. 10 см³ по ГОСТ 29228 и ГОСТ 29229.

Пробирки мерные П-2-15-14/23 ХС но ГОСТ 1770.

Электроплитка бытовая с закрытой спиралью.

Воронка делительная ВД-1—500 или ВД-3—500 по ГОСТ 25336.

Цилиндры мерные 1-100. 1-250 или 3-100. 3-250 по ГОСТ 25336.

Стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-14/8 или СВ-19/9. или СВ-24/10. или СВ-34/12 по ГОСТ 25336.

Колбы мерные 2—100—2 по ГОСТ 25336.

Кашьыяры стеклянные.

//-октан, ч.

Гексан, ч.

Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300 или спирт этиловый технический по ГОСТ 17299. или спирт этиловый ректификованный но ГОСТ 5962¹.

Эфир иетролейный (фракция 40—70 ’С).

Хлороформ по ГОСТ 20015, х.ч.

Алюминия окись для хроматографии 2-й степени активности.

Калия гидроокись но ГОСТ 24363.

Вода дистиллированная.

3.4-бензпирен.

1.12-бензперилен.

Азот жидкий по ГОСТ 9293.

2.2 П о д г о т о в к а к испытанию

2.2.1    Очистка растворителей

Растворители («-октан, этиловый спирт, иетролейный эфир, хлороформ и гексан) перегоняют общепринятым способом с елочным дефлегматором.

2.2.2    Подготовка окиси атминин

Окись алюминия высушивают в сушильном шкафу при температуре 250 ¹С в течение 4 ч и хранят в сосуде с пришлифованной пробкой.

2.2.3    Приготовление раствора 3,4-бензпирена dm хроматографии в тонком слое концентрации 100 мкг/см⁵ (раствор-свидетель)

Раствор 3.4-бензпирена готовят в петролейном эфире. Для этого в бюксу отвешивают около 10 мг 3.4-бензпирена, приливают несколько миллилитров петролейного эфира до полного растворения взятой навески. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см’ и доводят объем раствора до метки петролейным эфиром.

2.2.4    Приготовление стандартного раствора 3.4-бензпирена для спектрофлуориметрического определения его по методу Шпольского

Стандартный раствор 3.4-бензпирена готовят в «-октане с исходной концентрацией 100 мкг/см '. Для этого в бюксу отвешивают 10 мг 3,4-бензпирена, приливают несколько миллилитров «-октана до полного растворения взятой навески. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки «-октаном.

2.2.5    Приготовление рабочих растворов 3.4-бензпирена для спектрофлуориметрического определения его по методу Шпольского

Рабочие растворы 3.4-бензпирена концентрации 0,1; 0,04 и 0,02 мкг/см³ в «-октане готовят последовательным разведением исходного стандартного раствора 3,4-бензпирена в мерных колбах вместимостью 100 см³.

2.2.6    Приготовление внутреннего стандарта для спектро/рлуориметрического определения содержания 3.4-бензпирена

В качестве внутреннего стандарта используют раствор 1.12-бензнерилена в «-октане рабочей концентрации 0.01—0.001 мкг/см '. который готовят путем последовательных разведений исходного стандартного раствора 1.12-бензперилена концентрации 100 мкг/см³. Для приготовления исходного раствора 1,12-бензиерилена в бюксу отвешивают 10 мг 1.12-бензнерилена. приливают несколько миллилитров «-октана до полного растворения взятой навески. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки «-октаном.

ГОСТ 30087-93

2.3 Проведение испытания

В две круглодонные колбы вместимостью 500 см³ помешают по 25 г продукта, добавляют в каждую 20 см³ дистиллированной воды. 200 см³ этилового спирта и 20 г гидроокиси калия. Содержимое колб перемешивают встряхиванием. Колбы соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане при кипении реакционной смеси в течение 3 ч. Затем в колбы через холодильник добавляют по 150 см' дистиллированной воды, колбы с бани снимают и охлаждают до комнатной температуры.

После охлаждения жидкую фазу реакционной смеси декантацией переносят в делительную воронку, оставляя остаток продукта в колбе. В колбу с остатком добавляют 150 см³ гексана, содержимое колбы энергично перемешивают и гексан декантируют в делительную воронку.

Воронку закрывают пробкой и энергично встряхивают, затем закрепляют в штативе и оставляют для расслаивания жидкостей. Для разделения образовавшейся устойчивой эмульсии к смеси в делительной воронке добавляют 20 см' этилового спирта. После расслаивания нижнюю водно-спиртовую фазу сливают обратно в колбу с осадком, в гексановый экстракт переливают в колбу вместимостью 500 см³.

Такую обработку реакционной смеси повторяют еще два раза, используя для экстракции гексан по 100 см' и этиловый спирт для расслаивания эмульсии, порциями по 20 см³.

По окончании экстракции остаток в колбе и гидролизат отбрасывают, а экстракт из двух параллельных проб объединяют, промывают в делительной воронке дистиллированной водой три раза по 50 см' и упаривают порциями в предварительно взвешенной с точностью до второго знака после запятой круглодонной колбе вместимостью 250 см' на ротационном испарителе при остаточном давлении не ниже 50 мм рт. ст. и температуре водяной бани не более 60 *С. Колбу с экстрактом оставляют в вытяжном шкафу для удаления следов растворителя, после чего взвешивают с точностью до второго знака после занятой.

От взвешенною экстракта отбирают Vs часть в бюксу. не взвешивая. Колбу с остатком экстракта взвешивают с указанной выше точностью. В бюксу с частью экстракта добавляют 0.1 — 0.2 см' раствора-свидетеля 3.4-бензпирена, приготовленного, как указано в п. 2.2.3. Содержимое бюксы растворяют в петролейном эфире. Полученный раствор служит «свидетелем» при проведении тонкослойной хроматографии. Остаток в колбе также растворяют в небольшом объеме петролейного эфира. Полученный раствор является рабочей (анализируемой) пробой.

Для хроматографического разделения экстракта на стеклянную пластину размером 20x40 см равномерно насыпают окись алюминия. Затем с помощью стеклянной наточки, разделенной на три части (14. 1 и 3 см) резиновыми колечками толщиной 1 мм и шириной 3 мм. тщательно разравнивают окись алюминия.

Подученные растворы количественно наносят на подготовленную пластину стеклянными капиллярами на узкую часть — раствор из бюксы (свидетель), на широкую часть — раствор из колбы (рабочая проба). Растворы наносят равномерно аыошной полосой, отступив от нижнего края пластины 7—8 см.

После нанесения пробы и «свидетеля* пластину помешают в ванну иод углом 10—15*. наливают петролейный эфир так. чтобы он не доходил до линии нанесения пробы. Ванну накрывают стеклом и проводят хроматографию, доводя фронт растворителя почти до верхнего края пластины.

Не высушивая пластину, облучают ее ультрафиолетовым светом и по светящейся паюсе «свидетеля* определяют место нахождения 3.4-бензпирена в исследуемой пробе. Отмечают фаницы паюсы 3.4-бензпирена на хромато|рамме исследуемой пробы. Пластину высушивают в вытяжном шкафу.

При анализе некоторых образцов не происходит полного и четкого разделения флуоресцирующих компонентов при первичном хроматофафировании в петролейном эфире. В этом случае по •свидетелю* выделяют довольно широкую паюсу окиси алюминия с перекрывающимися флуоресцирующими компонентами. Полное разделение достигается при повторном хроматофафировании, как указано в и. 2.3.1.

Отмеченную на хроматограмме исследуемой пробы полосу с помощью предметного стекла количественно переносят в экстрактор (см. рисунок. 1). Экстрактор с пробой подвешивают на крючок специальной насадки, помещают в круглодонную колбу вместимостью 250 см³ с 10 см' этилового спирта. Закрепляют колбу на штативе над плиткой, соединяют с обратным холодильником и приступают к элюированию пробы. Нагрев ка!бы регулируют гак. чтобы слой растворителя над окисью алюминия был 3—5 мм. Экстракцию проводят в течение 45 мин, начиная с момента слива

97

растворителя из экстрактора. По окончании экстракции отключают нагрев и оставляют до полного слива растворителя из экстрактора.

Так как снектрофлуориметрический анализ по определению содержания 3.4-бензпирена проводят в «-октане. необходимо далее перевести выделенный

3.4- бензпирен в «-октан. Дли этою в колбу со спиртовым раствором 3.4-бензпирена, охлажденную до комнатной температуры, добавляют 15 см³ «-октана, соединяют ее с насадкой Дина и Старк;!, к которой присоединяют обратный холодильник и колбу нагревают. При этом из колбы отгоняют спирт и часть «-октана.

3.4- бензпирен остается в колбе, растворенным в «-октане. Окончание отгонки определяется тем. что положение |раницы между спиртом и «-октаном в приемнике остается неизменным (см. рисунок 2).

2.3.1 Более тонкое хроматографа веское pa зде. хение

При неполном и нечетком разделении анализируемой смеси при первичном хроматографировании в иет-ролейном эфире выделенную по «свидетелю* широкую полосу окиси алюминия, содержащую фракцию 3.4-бензпирена, элюируют вышеуказанным способом, после чего проводят вторичное разделение полученного спиртового экстракта.

Для этого спиртовой экстракт наносят пипеткой на пластину с окисью алюминия размером 15x30 см с толщиной слоя окиси алюминии 0.3 мм.

Пластину помешают в жижу иод углом 10—15* и проводят хроматографию в хлороформе, доводя фронт растворителя до верхнего края пластины.

Далее повторяют все операции, как указано выше.

В полученном по пн. 2.3 или 2.3.1 экстракте

3.4- бензпирена в «-октане проводят спектрофлуориметрическое определение содержания 3.4-бензнирена.

Объем экстракта не должен превышать 4 см' при исходной навеске продукта 50 г.

Количественное определение содержания

3.4- бензпирена на спектрофлуори метре можно проводить методом добавок или методом внутреннего стандарта.

определение содержания 3,4-бензпирена

В три пробирки наливают пипеткой по 1 см' экстракта 3,4-бензнирена в «-октане, приготовленного. как указано в и. 2.3 или 2.3.1. В первую пробирку приливают 2 см' «-октана. Во вторую пробирку приливают 1,5 см' «-октана и 0.5 см' раствор;! 3.4-бензпирена концентрации 0.1 мкг/см'. приготовленного, как указано в п. 2.2.5. В третью пробирку приливают 1 см' «-октана и I см' того же раствора 3.4-бензпирена, что и во вторую пробирку.

Снектрофлуориметрический анализ начинают с третьей пробирки. Для этого третью пробирку помешают в сосуд Дьюара перед входной щелью спектрофотометра: выводят прибор барабаном длин волн флуоресценции на аналитическую линию флуоресценции 3,4-бензпирена — 403 нм при длине волны возбуждающего света 367 нм. Регулировкой коэффициента усиления и раскрытием щели, а также одновременной юстировкой пробирки в сосуде Дьюара добиваются максимального сигнала по регистрирующему прибору спектрофотометра (до 50—80 %). после чего записывают спектрограмму аналитической линии 3.4-бензпирена в области 401—404 нм. При этом обязательно фиксируют, при каком значении регистрирующего прибора спектрофотометра перо самописца находилось при значении длины волны 401 нм.

98

ГОСТ 30087-93

Эго условие необходимо выполнять при сканировании всех проб для компенсации влиянии фона, который создают присутствующие в экстракте пробы люминесцирующие примеси, содержащиеся в одинаковых количествах во всех трех пробирках.

Запись спектра повторяют 2—3 раза, добиваясь хорошей сходимости.

Затем последовательно замораживают в жидком азоте вторую и первую пробирки и записывают спектры флуоресценции в области длин волн 401—404 нм. обязательно выставляя перо самописца при длине волны 401 нм в то же положение, что и при сканировании пробы в третьей пробирке, добиваясь этого регулировкой размера щели и коэффициента усиления спектрофотометра.

Концентрацию 3.4-бензпирена в анализируемом экстракте определяют по графику, на котором по оси абсцисс откладывают значение добавки 3.4-бензпирена в микрограммах, а по оси ординат — высот>' пика максимума характеристической линии 3.4-бензпирена при 403 нм. измеренную по полученным спектрограммам в миллиметрах.

Если концентрация исследуемого раствора попадает в область, пригодную для измерений, то полученные экспериментальные точки лежат на одной прямой. Экстраполяция этой прямой до пересечения с осью абсцисс дает на ней отрезок, соответствующий содержанию 3.4-бснзинрсна в растворе с нулевой добавкой, т.е. в 1 см' исследуемого экстракта.

2.3.1.2 Количественное определение содержания 3.4-бензпирена методом внутреннего стандарта

В качестве внутреннего стандарта используют 1,12-бензперилен. В пробирку наливают 3 см' экстракта 3.4-бензпирена в «-октане, приготовленного, как указано в и. 2.3 или 2.3.1 и помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом перед входной щелью спектрофотометра, юстируют пробирку на линии 403 нм при дшне волны возбуждающего света 367 нм. а затем производят запись спектра исходного экстракта в области дшн волн 401—409 нм. По интенсивности линии (по высоте ника максимума характеристической линии 3.4-бензпирсна при 403 нм), ширине щели и коэффициенту усиления прибор;» оценивают приблизительное содержание 3.4-бензпирсна в пробе. В соответствии с этой оценкой в пробирку с 3 см' экстракта добавляют 1.12-бензперилена в таком количестве, чтобы в спектре пробы интенсивность линии 1.12-бензпсрилсна при 406.3 нм была в 3—5 раз больше интенсивности линии 3.4-бензинрсна при 403 нм.

Проводят запись спектра в области длин волн 401-409 нм дважды.

Интенсивности характеристических линий 3.4-бен зпирена при 403 нм и 1.12-бензиерилена при 406.3 нм (Н, и Н₃ соответственно) определяют но сиектрофамме. измеряя в миллиметрах высоты пикон максимумов характеристических линий этих соединений. В расчет принимают среднее значение. Далее рассчитывают коэффициент отношения (К) интенсивности линии 3.4-бснзиирена (И,) к интенсивности линии 1.12-бензиерилена (Hi). К= H,/Hi.

Далее определяют этот коэффициент для стандартных растворов 3.4-бензпирена (А^). Для этого в две пробирки наливают по 3 см' стандартных растворов 3.4-бензпирсна концентрацией 0.02 и 0.04 мкг/см'. В каждую из пробирок наливают такое же количество 1.12-бен зперилена. что и в пробирку с пробой. Проводят запись спектров дважды для каждого раствора 3.4-бензнирена в области длин волн 401—409 нм.

При этом обязательно следят за тем, чтобы положение пера самописца на длине волны 401 нм во всех случаях фиксировалось на одном уровне.

Далее но спектрофаммам определяют интенсивности характеристических линий 3.4-бснзин-рена при 403 нм и 1.12-бен зперилена при 406.3 нм (Н, и Н> соответственно). В расчет принимают среднее значение. Рассчитывают A^_T=H,/Hj для каждой концентрации 3.4-бензнирсна.

Конценфацию 3.4-бснзпирсна (с) в анализируемом растворе в микрограммах на кубический сантимеф вычисляют но формуле

где с_ст — конценфлиия 3.4-бснзпирсна в стандартном растворе, мкг/см³;

К — коэффициент, найденный по сиектрофамме анализируемого раствора;

К^ — коэффициент, найденный по спектрограмме стандартного раствора, значение которого ближе по значению к коэффициенту анализируемого раствора.

Проводят два параллельных определения и одновременно контрольный опыт, который проводят через все стадии анализа с использованием всех реактивов согласно прописи методик, но без навески продукта.

99

2.4 Обработка результатов

Содержание 3.4-бензпирена (Л",) в микро ipa мм ах на килограмм вычисляют по формуле

V _ (f-<•,»)• Г (/и, ♦«,)    1000

Л\ —    —

¹    /и,    т

где с — концентрация 3.4-бензпирена в исходном экстракте, мкг/см³;

с₀ — концентрация 3.4-бензпирена в контрольном опыте, найденная по п. 2.3.1.1 или 2.3.1.2. мкг/см³;

V — объем исходною экстракта, см³;

/Я]. т₂ — массы экстрактов, нанесенных на широкую (/я,) и узкую (/яО части хроматографической пластинки, г;

1000 — коэффициент пересчета граммов в килограммы:

/я — масса навески продукта, г.

Результат округляют до второго десятичного знака.

Из результатов двух параыельных определений вычисляют среднее арифметическое значение с тем же числом знаков после запятой и определяют расхождение между каждым результатом и средним арифметическим значением. Допускаемое относительное расхождение не должно превышать 40 %. рассчитанных и округленных до целого числа.

За окончательный результат определения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, увеличенное на значение систематической составляющей погрешности измерений, равное 0.3 Х\. Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.

Минимальная концентрация 3.4-бензпирена. определяемая этим методом, составляет 0.001 мкг/см'.

3 Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии

и С11екгроф.|уориметрии при комнатной температуре

Сущность метода заключается в экстракции углеводородов, в том числе 3.4-бензпирена, гексаном из продукта, предварительно обработанного спиртовым раствором едкого калия, выделении фракции полициклических ароматических углеводородов колоночной хроматографией на сефадексе и количественном определении в полученной фракции 3.4-бензпирена высокоэффективной жидкостной хроматографией или спектрофлуориметрней при комнатной температуре.

3.1 А п н а р а т у р а, материалы и реактивы

Спектрофлуоримегр типа MPF-43A.

Хроматограф высокоэ<|м|>сктииный жидкостной с детектором но флуоресценции и колонкой с обращенной фазой типа C_1(i.

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные технические любого тина.

Испаритель ротационный типа ИР-1М.

Насос водоструйный лабораторный.

Мешалка магнитная.

Облучатель ультрафиолетовый типа ОЛД или хроматоскоп.

Камера хроматографическая стеклянная 40x40x40 см.

Пластинки стеклянные для тонкослойной хроматографии 5x20 и 20x20 см.

Колонка стеклянная хроматофафическая длиной 500 мм и диаметром 20 мм с оттянутым внизу концом и резервуаром вместимостью 50—60 см³ НШ 14/23.

Холодильник XГГГ-2-400-29/32 ХС или ХШ-1-400-29/32 ХС по ГОСТ 25336.

Алонж типа ЛИО-14/23-50 ТС или ЛИО-14/23-14/23-65 ТС по ГОСТ 25336.

Дефлегматор 250-19/26-29/32 ТС или 300-19/26-29/32 ТС но ГОСТ 25336.

Насадка Н-1-19/26-14/23-14/23 ТС или Н-2-19/26-14/23 ТС по ГОСТ 25336.

Воронка делительная ВД-1—500 или ВД-3—500 по ГОСТ 25336.

Воронка ВФО-32—ПОР 100-14/23 ХС или ВФО-32-ПОР 160-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Цилиндры мерные 1 — 100. 1—250 или 3—100. 3—250 по ГОСТ 25336.

Стакан химический В-1—100 или В-1 — 150 но ГОСТ 25336.

Колба 1-500 по ГОСТ 25336.

100

ГОСТ 30087-93

Колба Гр 50-14/23 но ГОСТ 25336.

Колбы К-1-100-29/32 ТХС. К-1-25Р-29/32 ТХС. К-1-500-29/32 ТХС или П-1-500-29/32 ТХС но ГОСТ 25336.

Колбы К„-1000-29/32 ТХС по ГОСТ 25336. К.,-250-34 ТХС но ГОСТ 25336.

Колбы мерные 2—100—2 по ГОСТ 25336.

Воронка Бюхнер;! 1 или 2. или 3 но ГОСТ 9147.

Стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-14/8 или СВ-19/9. или СВ-24/10. или СВ-34/12 но ГОСТ 25336.

Микрошприцы типов МШ-1, МШ-10 или стеклянные капилляры.

Пипетки градуированные вместимостью 0,5; 1; 2.5 см³ по ГОСТ 29228 и ГОСТ 29229.

Бумага индикаторная универсальная.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Скальпель или тонкий шпатель.

Гексан, ч.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962 или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300, или спирт этиловый технический по ГОСТ 17299.

Бензо;! по ГОСТ 5955 или толуол по ГОСТ 5789.

Кислота серная но ГОСТ 4204.

Ацетон по ГОСТ 2603. ч. или ос.ч.

Ангидрид уксусный но ГОСТ 5815. ч.

Днметилформамнд по ГОСТ 20289. ч.д.а.

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии ОП-3. ос. ч.

Вода дистиллированная.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363.

Целлюлоза микрокристаллическая для хроматофафии ЛК.

3,4-бензиирен.

Бенз(в)хризен.

Сефадекс о Н-20.

Силикагель марки АСКГ или молекулярные сита типа 5А.

3.2 П о д г о т о в к а к испытанию

3.2.1    Подготовка растворите. гей

Растворители (гексан, этиловый спирт, ацетон, бензол) перегоняют общепринятым способом с елочным дефлегматором.

3.2.2    Приготовление оцет и. трона иной це.ию.юш

(50±0.2) г микрокристаллической целлюлозы помешают в плоскодонную колбу вместимостью 500 см³. добавляют приготовленную в отдельной колбе смесь 150 см³ бензола или толуола. 70 см³ уксусного ангидрида и 0,3 см³ серной кислоты. Реакционную смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 6—8 ч. оставляют еше на 18 ч посте чего декантируют жидкую фазу, а осадок заливают 300 см³ этилового спирта, перемешивают и оставляют на 24 ч. затем осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают 100 см³ этилового спирта и дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге).

Затем проверяют хроматографическую активность ацетилированной целлюлозы. Для этого за 3—4 ч до проведения хроматографии готовят смесь этилового спирта, ацетона и воды, взятых в объемном соотношении 60:25:15. и выливают ее в выстланную полосками фильтровальной бумаги хроматографическую камеру. Высота слоя растворителя должна составлять 1.5—2 см. 1,5 г ацетилированной целлюлозы суспензируют в 7 см' этилового спирта и выливают суспензию ровным слоем на стеклянную пластинку 5x20 см. дают растворителю полностью испариться на воздухе и наносят на пластинку микроширицем или стеклянным капилляром в точку 5 мкдм³ раствора 3.4-бензпирена концентрации 1 мкг/см³. Пластинку помешают в хроматофафическую камеру и оставляют в камере до тех пор. пока уровень растворите.ж поднимется нс менее чем на 100 мм от линии старта. По окончании хромато1рафическую пластинку вынимают, высушивают на воздухе и иод лампой ультрафиолетового облучателя отмечают флуоресцирующее голубым цветом пятно 3.4-бензпирена. Измеряют расстояние от стартовой линии до фронта растворителя и до середины пятна 3.4-бенз-

пирена. Вычисляют значение, оценивающее скорость перемещения 3.4-бензпирена но пластинке (R/). по формуле

кг=

тле /._г>п — расстояние от стартовой линии ло серелины пятна 3.4-бензпирена, мм;

I. — расстояние от стартовой линии ло фронта растворителя, мм.

Значение Rf 3.4-бензпирена лолжно составлять 0.1.

Для приготовления рабочей пластины 5 г ацетилированной целлюлозы суспензируют в 20 см' этилового спирта и выливают ровным слоем на пластинку 20x20 см.

3.2.3 Приготовление стандартных растворов 3,4-бензпирена и бенз(в)хризена

3.2.3.1    Приготовление раствора А. содержащего 100 мкг/см³

3.4-бензпирена

В стаканчик для взвешивания (бюксу) отвешивают (10±0.2) мг 3,4-бензпирена, навеску количественно переносят бензолом в мерную колбу вместимостью 100 см’, объем раствора ло водят ло метки бензолом.

3.2.3.2    Приготовление рабочих растворов 3.4-бензпирена

При использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии из раствора А отбирают пипетками соответствующей вместимости 0.25; 1,0 и 5 см’, переносят в мерные колбы вместимостью 100 см’, доводят ло метки ацетонитрилом и перемешивают. Полученные растворы содержат соответственно 0.25; 1.0 и 5.0 мкг/см’ 3.4-бензпирена.

При спектрофлуориметрическом определении 3.4-бензпирена из раствора А отбирают I см’ раствора и переносят в мерную колбу вместимостью 100 см’, добавляют ло метки бензол и перемешивают. Полученный раствор содержит 1.0 мкг/см’ 3.4-бензпирена.

3.2.3.3    Приготовление раствора Б, содержащего ИХ) мкг/см’ бенз(в)хризена

В стаканчик для взвешивания (бюксу) отвешивают (10±0.2) мг бснз(в)хризсна. количественно ацетонитрилом переносят в мерную колбу вместимостью 100 см’, объем раствора доводят до метки ацетонитрилом и перемешивают.

3.2.3.4    Приготовление рабочего раствора бенз(в) хризена

Из раствора Б пипеткой соответствующей вместимости отбирают 0.5 см’, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют до метки ацетонитрил и перемешивают. Полученный раствор содержит 0.5 мкг/см’ бснз(в)хризсна.

3.2.4    Условия высоком/ярективной жидкостной хроматографии

Рекомендуются следующие условия, которые Moiyr быть уточнены в процессе работы в зависимости от типа хроматографа, устройства детектора и инжектора:

колонка Supcrcosil LC-PA1I 150x4.6 мм. подвижная фаза — смесь ацетонитрила и воды, взятых в объемном соотношении 9:1. скорость потока 1 см’/мин. Перед проведением смесь дегазируют под вакуумом, создаваемым водоструйным насосом. Детектор флуориметрический, длина волны возбуждающего света 360 нм. эмиссионный фильтр — 418 нм. Объем вводимой в инжектор пробы 20 мкдм³, из него на колонку — 10 мкдм’. Чувствительность усилителя подбирают таким образом, чтобы интенсивность сигнала 3.4-бензпирена и внутреннего стандарта — бенз(в)хризена не превышала 95 % шкалы амперметра, гак как при сигнале более 100 % нарушается линейность показаний детектора.

Плошали ников 3.4-бензпирена и бенз(в)хризена измеряют с номошью интефагора или вручную по высоте ника и его ширине на патовине высоты.

3.2.5    Определение калибровочного кок/х/шциента для расчета по методу внутреннего стандарта

Калибровочный коэффициент рассчитывают но результатам анализа трех растворов, содержащих смесь 3.4-бензпирена и бенз(в)хризена. взятых в соотношении 10:1. 2:1, 1:1. Для приготовления растворов в три стаканчика для взвешивания (бюксы) с точностью до 0.2 мг отвешивают 3.4-бензпирен и бенз(в)хризен в количествах, указанных в таблице I.

1

В Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000 (здесь и далее).