CYT

Фосфатаза сштйнгш аньщтау

МОЛОКО Определение фосфатазы щелочи

К? СТ ISO 3356-2013

(ISO3356:2009, ЮТ)

Ресми басылым

Ь^азакстан Республикасы Индустрия жэне жаца технологиялар министрлнтнщ Техникалык; реттеу жэне метрология комитет!

(Мемстандарт)

CYT

Фосфатаза сштипгш аныцтау

1<Р СТ ISO 3356-2013

(ШОЗ356:2009, IDT)

Ресми басылым

Ь^азацстан Республикасы Индустрия жэне жаца технологиялар министрлйтнщ Техника лык; реттеу жэне метрология комитет!

(Мемстандарт)

Астана

Библиография

[1]    ISO 648:2008 Laboratoryglassware - Single-volumepipettes (Зертханальщ шыны ыдыс. Eip танбалы тамызгыштар).

[2]    ISO 707:2008 | IDF 50 Milk and milk products - Guidance on sampling (Сут жэне сут ешмдерт Сынамаларды ipiicrey женшдеп нускаулык).

[3]    ISO 1042:1998Laboratory glassware - One-mark volumetric flasks ((Зертханальщ шыны ыдыс. Eip танбалы елшейтш кутылар).

[4]    ISO 5725-1:1994Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part l.Generalprinciplesanddefmitions (Олшеу нэтижелер1 мен эдютершщ дэлме-дэлдтт(туралыты мен дэлд1к) 1.Бел1м Жалпы катидалар мен аньщтамалар).

[5]    ISO 5725-2:1994Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 2.Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method () олшеу эдютер1 мен нэтижелершщ дэлме дэлдЫ (туралыты мен дэлдш 2 Бел1м. Кдйталануды аньщтаудыц непзп эд!с! мен елшеудщ стандартты эдюшщ кайталантыштыты).

[6]    ISO 11816-1:2006 | IDF 155-1 Milk and milk products - Determination of alkaline phosphatase activity - Part 1: Fluorimetric method for milk and milk-based drinks (Сут жэне сут ешмдерт Фосфатаза сштшк белсендшпн аньщтау. 2 Бел1м. Сут жэне сут сусындарына арналтан флуориметрикальщ эдю).

[7]    ISO 22160:2007 | IDF 209 Milk and milkbased drinks - Determination of alkaline phosphatase activity - Enzymatic photo-activated system (EPAS) method (Сут жэне сут сусындары. Фосфатаза сштюшщ эсерш аньщтау. Энзиматикальщ жэне фото белсендшк жуйелерш колдану oflici).

0ОЖ 637.054-637.04    МСЖ    67.100.10

Туши сездергсут, фосфатаза сшт1л1к белсендшп , реактивтер, курал жабдьщтар,сына ipiicreMeci, сынак; журпзу, нэтижелерд1 есептеу жэне ернектеу, дэлме-дэлд1к, сынак; хаттамасы

МОЛОКО Определение фосфатазы щелочи

СТ РК ISO 3356-2013

(ШОЗ356:2009, IDT)

Издание официальное

Комитет технического регулирования и метрологии Министерства индустрии и новых технологий Республики Казахстан

(Г осстандарт)

Предисловие

1    ПОДГОТОВЛЕН И ВНЕСЕН Республиканским государственным предприятием «Казахстанский институт стандартизации и сертификации» и Техническим комитетом по стандартизации 44 «Технолог»

2    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Председателя Комитета технического регулирования и метрологии Министерства индустрии и новых технологий Республики Казахстан от 13 ноября 2013 года за № 526-од

3    Настоящий стандарт идентичен по отношению к международному стандарту ISO 3356:2009 Milk - determination of alkaline phosphatase (Молоко. Определение фосфатазы щелочи)

Международный стандарт ISO 3356:2009 Milk - determination of alkaline phosphatase подготовлен Техническим комитетом ISO/ТС 34 «Пищевые продукты», подкомитетом SC 5 «Молоко и молочные продукты». Он публикуется совместно ISO и ПЖ

Перевод с английского (еп)

Степень соответствия - идентичная (IDT)

4 СРОК ПЕРВОЙ проверки ПЕРИОДИЧНОСТЬ ПРОВЕРКИ

5 ВВЕДЕН ВПЕРЫЕ

Информация об изменениях к настоящему Стандарту публикуется в указателе «Нормативные документы по стандартизации», а текст изменений - в ежемесячных информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (отмены) или замены настоящего Стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе «Национальные стандарты»

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Комитета технического регулирования и метрологии Министерства индустрии и новых технологий Республики Казахстан

МОЛОКО Определение фосфатазы щелочи

Дата введения 2014-07-01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения активности щелочной фосфатазы молока.

Метод применяется к активности щелочной фосфатазы не менее 1 мкг фенола на миллилитр.

Метод также применим для определения активности щелочной фосфатазы в порошковом молоке, пахте и в сухой пахте, сыворотке и сухой сыворотке.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ Использование настоящего стандарта может включать в себя опасные материалы, операции и оборудование. Настоящий стандарт не имеет целью рассмотрение всех проблем, касающихся безопасности, связанных с его использованием. Установление требований по охране труда и технике безопасности, а также определение применимости нормативных ограничений является ответственностью пользователя.

2    Термины и определения

В настоящем Стандарте применяются следующие термины с соответствующими определениями:

2.1 Активность щелочной фосфатазы Активность АЩФМ(активность щелочной фосфатазы в молоке) (alkalinephosphataseactivity AL Pactivity (alkalinephosphataseactivityinmilk))- количество фенола, высвобождаемого пробой, определяемое в соответствии с процедурой, устанавливаемой в настоящем стандарте.

ПРИМЕЧАНИЕ Активность щелочной фосфатазы выражается как количество фенола в микрограммах, высвобожденное 1 мл пробы или восстановленной пробы, при условиях, указанных в настоящем стандарте. Другие стандарты (например, [6], [7]) выражают активность щелочной фосфатазы в миллиединицах на литр. В литературе приведена информация по эквивалентности разных единиц, используемых для выражения активности щелочной фосфатазы.

3    Сущность метода

Пробу разбавить буферным раствором при pH 10,6 и выдерживать при температуре 37 °С в течение 1 часа. При таких условиях любая щелочная фосфатаза, присутствующая в пробе, высвобождает фенол добавляемого из фенилфосфата натрия. Высвобождаемый фенол вступает в реакцию с хинонимидом (дибромхинонхлоримидом), даваядибромоиндофенол (синего цвета), который определяется фотометрически при 610 нм.

Издание официальное

4 Реактивы

Использовать только реактивы квалификации «чистый для анализа», если только не указано иное, и только дистиллированную воду или воду эквивалентной степени чистоты.

4.1    Буферный раствор гидроксида и бората бария

Растворить 25,0 г гидроксида бария [Ва(ОН)₂ 8Н₂0], не содержащего карбонат, в воде в мерной колбе с одной меткой на 500 мл (см. 5.8). Довести до метки водой и перемешать.

Растворить 11,0 грамм борной кислоты (Н3ВО3) в воде в другой мерной колбе с одной меткой на 500 мл (см. 5.8). Довести до метки водой и перемешать.

Нагреть оба раствора до 50 °С. Добавить один к другому и перемешать встряхиванием. Быстро охладить полученный раствор до температуры 20 °С. Довести pH раствора, при необходимости, до (10,6 ± 0,1) дополнительным количеством раствора гидроксида бария. Фильтровать раствор через фильтровальную бумагу (см. 5.10).

Хранить профильтрованный буферный раствор гидроксида и бората бария в плотно закрываемом пробкой контейнере. Перед использованием разбавить буферный раствор равным объемом воды.

4.2    Цветные буферные растворы

4.2.1    Цветной буферный раствор I

Растворить 6,0 г метабората натрия (NaB0₂) или 12,6 г NaB0₂ 4Н₂0 и 20,0 грамм хлорида натрия (NaCl) в воде в мерной колбе с одной меткой на 1000 мл (см. 5.8). Довести до метки водой и перемешать.

4.2.2Цветной буферный раствор II

Перенести 10 мл буферного раствора I (см. 4.2.1) в мерную колбу с одной меткой на 100 мл (см. 5.8). Довести до метки водой и перемешать.

4.3    Раствор субстратного буфера

4.3.1Дигидратдвунатриевогофенилфосфата (№₂СбН₅Р04'2Н₂0), содержащий массовую долю фенола не более 0,01 %.

4.3.2    Растворить 0,1 г дигидратадвунатриевогофенилфосфата (см. 4.3.1) в 100 мл разбавленного буферного раствора гидроксида и бората бария (см. 4.1).

4.4    Осаждающий раствор цинка-меди

Растворить 3,0 г сульфата цинка (ZnS04 7Н₂0) и 0,6 г сульфата меди (CUSO4 5Н₂0) в воде в мерной колбе с одной меткой на 100 мл (см. 5.8). Довести до метки водой и перемешать.

4.5    Раствор 2,6-дибромхинонхлоримида (далее - БХХИ), реактив Гиббса

Растворить(40 ± 1) мг БХХИ (СбН₂Вг₂СШО) в 10 мл этанола с объемной

концентрацией 96 %.

Хранить раствор в бутылке из темного стекла при (4 ± 2) °С. Отбраковать при обесцвечивании или по истечении 1 месяца.

2

CT РК ISO 3356-2013

4.6    Раствор сульфата меди

Растворить 0,05 г сульфата меди (CuS04 5НгО) в воде в мерной колбе с одной меткой на 100 мл (см. 5.8). Довести до метки 100 мл водой и перемешать.

4.7    Раствор гидроксида натрия, c(NaOH) = 0,5 моль/л.

4.8    Стандартные растворы фенола

4.8.1    Исходный стандартный раствор фенола

Перенести отвешенное количество (200 ± 2) мг безводного фенола чистотой не менее,чем 99,5% в мерную колбу с меткой на 100 мл (см. 5.8). Растворить фенол в воде. Довести до метки водой и перемешать.

Исходный стандартный раствор фенола остается устойчивым при(4 ± 2) °Св течение 6 недель.

4.8.2    Рабочие стандартные растворы фенола

Отобрать пипеткой 10 мл исходного стандартного раствора фенола (см. 4.8.1) в мерную колбу с одной меткой на 100 мл (см. 5.8). Довести до метки водой и перемешать (1 мл содержит 200 мкг фенола).

Использовать разбавленный стандартный раствор для приготовления соответствующих рабочих стандартных растворов фенола, содержащих 2; 5; 10 и 20 мкг фенола на миллилитр соответственно.

5    Аппаратура

Обычное лабораторное оборудование и, в частности, нижеследующее:

5.1    Аналитические весы, специального класса I.

5.2    Фотометр, подходящий для измерения при длине волны 610 нм,точность длины волны ± 1 нм.

5.3    Водяная баня, в которой может поддерживаться температура (37±1) °С при термостатическом контроле.

5.4Водяная баня, с температурой кипения (100 ± 1) °С.

5.5    Вихревая мешалка.

5.6    Пипетки, емкостью 0,1; 1; 5 и 10 мл, [1], класс А.

5.7    Стеклянные пробирки, соответствующих объемов, с пробками, изготовленными из безфенольных прокладок.

5.8    Мерные колбы с одной меткой, емкостями 100; 500 и 1000 мл, [3], класс А.

5.9    Стеклянные воронки, диаметрами 60 мм и 100 мм.

5.10    Фильтровальная бумага, быстрого фильтрования, диаметрами 110 мми 185 мм.

6    Отбор проб

Представительную пробу следует отправить в лабораторию. Во время транспортировки и хранения она не должна быть повреждена или изменена.

Отбор проб не является частью метода, указанного в настоящем стандарте. Рекомендованный метод отбора проб представлен в [2].

Пробу для испытаний хранить таким образом, чтобы предотвратить ухудшение и изменение состава пробы.

3

7 Подготовка испытуемой пробы

7.1 Перемешивание

Перед использованием испытуемую пробу осторожно перемешать. Обычно, для надлежащего перемешивания, нет необходимости в предварительном нагреве испытуемой пробы. Если требуется предварительное нагревание, температура не должна превышать 3 5 °С.

7.2    Порошковое молоко, сухая пахта и сухая сыворотка

Растворить 10 г испытуемой пробы в 90 мл воды при нагревании, если это необходимо. Тем не менее, температура, применяемая для полного растворения испытуемой пробы, не должна превышать 35°С.

7.3    Нейтрализация кислых испытуемых проб

Если испытуемая проба является кислой (pH < 7,0), довести до нейтрального pH раствором гидроксида натрия (см. 4.7)

8 Методика

8.1    Построение градуировочной кривой

8.1.1    Приготовить диапазон стандартных растворов в пяти стеклянных пробирках (см. 5.7), отбирая пипеткой 1 мл воды на пробирку с контрольной или холостой пробой и 1 мл каждого из четырех рабочих стандартных растворов фенола (см. 4.8.2) в каждую из оставшихся четырех пробирок соответственно. Пробирки со стандартными пробами содержат 0(контрольная или холостая проба); 2; 5 и 20 мкг фенола соответственно.

8.1.2    Добавить в каждую пробирку (см. 8.1.1) 1 мл раствора сульфата меди (см. 4.6), 5 мл цветного буферного раствора II (см. 4.2.2), 3 мл воды и 0,1 мл раствора БХХИ (см. 4.5) и перемешать. Дать цвету проявиться (сформироваться) при комнатной температуре в течение 30 минут.

8.1.3    Определить оптическую плотность стандартных растворов относительно оптической плотности контрольного или холостого раствора при длине волны 610 нм.

8.1.4Построить график зависимости оптической плотности от количествафенола в микрограммах (см. 8.1.1). Определить уравнение градуировочной кривой.

8.2 Определение

8.2.1    Во время определения избегать воздействия прямого солнечного света. Загрязнение со следами слюны или пота может давать ложноположительные результаты и его следует избегать.

8.2.2    Пипеткой отобрать в каждую из двух пробирок (см. 5.7) 1 мл испытуемой пробы или восстановленной пробы. Использовать одну из пробирок в качестве контрольной или холостой пробы.

8.2.3Закрыть пробкой пробирку с холостой пробой. Поместить ее в химический стакан с кипящей водой. Накрыть химический стакан алюминиевой фольгой. Нагреть пробирку в кипящей воде в течение 2 минут, оставляя химический стакан накрытым

4

CT РК ISO 3356-2013

фольгой для гарантии нагрева всей пробирки. Затем пробирку охладить до комнатной температуры в холодной воде.

После этого аналогичным образом поступить с пробиркой с холостой пробой и пробиркой с испытуемой пробой.

8.2.4    Добавить 10 мл субстратного буферного раствора (см. 4.3) как в пробирку с испытуемой пробой (см. 8.2.2), так и в пробирку с холостой пробой (см. 8.2.2) и перемешать.

8.2.5    Нагретьсразу обе пробирки на водяной бане (см. 5.3) при 37 °С в течение 60 минут, время от времени перемешивая содержимое.

8.2.6    Поместить обе пробирки в химический стакан с кипящей водой. Накрыть химический стакан алюминиевой фольгой. Нагреть обе пробирки в кипящей воде в течение 2 минут и охладить их до комнатной температуры в холодной воде.

8.2.7    Добавить 1 мл осаждающего раствора цинка-меди (см. 4.4) в каждую пробирку и тщательно перемешать.

8.2.8    Профильтровать содержимое каждой пробирки через фильтровальную бумагу (см. 5.10), сливая первые несколько миллилитров. Пипеткой отобрать 5 мл каждого фильтрата в другую стеклянную пробирку (см. 5.7).

8.2.9    Добавить в каждую пробирку (см. 8.2.8) 5 мл цветного буферного раствора I (см. 4.2.1) и перемешать.

8.2.10    Добавить 0,1 мл раствора БХХИ (см. 4.5) в каждую пробирку и перемешать. Дать цвету обоих растворов проявиться при комнатной температуре в течение 30 минут.

8.2.11    Определить оптическую плотность раствора испытуемой пробыотносительно оптической плотности раствора холостой пробы при длине волны 610 нм.

8.2.12    Если оптическая плотность пробы для испытаний, измеренная в 8.2.11, превышает оптическую плотность рабочего стандартного раствора фенола, содержащего 20 мкг фенола на миллилитр, в соответствии с измеренным в 8.1.3, то повторить определение с соответствующим разбавлением испытуемой пробы или восстановленной пробы нижеследующим образом.

Перемешатьодин объем испытуемой пробы или восстановленной пробы с соответствующим объемом той же самой испытуемой пробы или восстановленной пробы, которую осторожно нагревают до кипения для того, чтобы инактивировать фосфатазу. Продолжитьпо 8.2.2.

9 Расчет и выражение результатов

9.1 Расчет

9.1.1По оптической плотности, определенной в 8.2.11 определить количество фенола в микрограммах,используя градуировочную кривую (8.1.4).

9.1.2 Рассчитать активность фосфатазы Оф, выраженную в микрограммах фенола на миллилитр молока, используя формулу 1:

а_ф = 2,4 х т х /_р, (1)

гдет - масса, в микрограммах, фенола, полученная в 9.1.1;

f_v - коэффициент разбавления для испытуемой пробы или восстановленной пробы (8.2.12), при необходимости (если f_v не = 1).

5

CT РК ISO 3356-2013

9.2 Выражение результатов испытаний

Результаты испытаний выражают с точностью до первого десятичного знака.

10    Точность

10.1    Межлабораторное испытание

Значения пределов повторяемости и воспроизводимости были получены из результатов межлабораторных испытаний, проводимых в соответствии с [4]и [5]. Значения выражаются для уровня вероятности 95 % и не могут быть применимы для диапазонов концентрации и матриц, отличающихся от заданных.

10.2    Повторяемость (Сходимость)

Абсолютная разность между двумя отдельными результатами испытаний, полученная одним и тем же методом на идентичном испытуемом материале в одной и той же лаборатории одним и тем же лаборантом с помощью одного и того же оборудования в пределах короткого интервала времени может не более, чем в 5 % случаев, превышать 1,5 мкг/мл.

10.3    Воспроизводимость

Абсолютная разность между двумя отдельными независимыми результатами, полученная одним и тем же методом на идентичном испытуемом материале в разных лабораториях разными лаборантами с использованием разного оборудования, может не более, чем в 5 % случаев, превышать 3,9 мкг/мл.

11    Протокол испытаний

В протоколе испытаний должна содержаться, как минимум, следующая информация:

a)    вся информация, необходимая для полной идентификации пробы;

b)    использованный метод отбора проб;

c)    использованный метод испытаний, со ссылкой на настоящий стандарт;

d)    все рабочие детали, не указанные в настоящем стандарте, или считающиеся вспомогательными, вместе с деталями каких-либо инцидентов, которые могли повлиять на результат (-ы) испытаний;

e)    полученный результат (-ы) испытаний и, если была проверена сходимость, полученный конечный приведенный результат.

6

CT РК ISO 3356-2013

Приложение А

(информационное)

Межлабораторное испытание

Межлабораторное совместное испытание, включающее девять лабораторий из семи разных стран, проводилось на шести пробах цельного коровьего молока с разными количествами коровьего сырого молока, май 2005 г. Полученные результаты были подвергнуты статистическому анализу в соответствии с ISO 5725-1 [4] и ISO 5725-2[5] для получения данных по прецизионности, представленных в Таблице А. 1.

Служба Франции по контролю за качеством продуктов питания и продовольственной безопасности организовала этот опыт.

Таблица А.1 - Результаты межлабораторного испытания по щелочной

фосфатазе

Параметр Пробы Среднее3 ) 1 2 3 4 5 6 Заданное значение1ъ\ мкг/мл 2,3 4,2 6,5 9,9 11,9 35,7 Число участников после устранения 8 8 8 8 8 8 Предел повторяемости, г (= 2,8sr), мкг/мл 0,82 0,47 1,36 0,91 0,98 3,73 1,5 Среднеквадратическое отклонение повторяемости, sr, мкг/мл 0,29 0,17 0,48 0,32 0,35 1,32 0,5 Коэффициентвариации повторяемости, CV(r), % 12,78 3,94 7,47 3,24 2,92 3,69 4,3 Предел воспроизводимости, г (= 2,8 sr), мкг/мл 1,59 1,51 2,52 2,62 3,22 9,70 3,9 Среднеквадратическое отклонение воспроизводимости, sr, мкг/мл 0,56 0,54 0,89 0,93 1,14 3,43 1,4 Коэффициент вариации воспроизводимости, СУ(г), % 24,83 12,70 13,80 9,36 9,54 9,59 11,0

а)Среднее всех лабораторий после устранения всех выпадающих значений. ь) Пределы повторяемости и воспроизводимости и среднеквадратические отклонения рассчитывались с исключением результатов, полученных при заданном значении 2,3 мкг/мл.

7

Алгысез

1    «Казакстан стандарттау жэне сертификаттау инсти

туты» Республикальщ мемлекетпк кэсторны мен стандарттау женшдеп 44 «Технолог» техникальщ комитет! Э31РЛЕП ЕНГ13Д1

2    Казакстан Республикасы Индустрия жэне жана технологиялар министрл1п Техникальщ реттеу жэне метрология комитет! Тератасыньщ 2013 жылты 13 карашадаты № 526-од буйрытымен БЕК1ТШ1П КОЛДАНЫСКА ЕНГ131ЛД1

3    Осы стандарт ISO 3356:2009 Milk - determination of alkaline phosphatase (Сут. Фосфотаза сштшпн аныкгау) хальщаралык стандартына катынасы бойынша б1рдей.

ISO 3356:2009 Milk - determination of alkaline phosphatase хальщаралык стандартын ISO/ТС 34 «Тамак ешмдерЬ) техникальщ комитету SC 5 «Сут жэне сут ешмдерЬ) iiiiKi комитет! дайындады. Ол ISO жэне IDF б1рлесе жарияланады.

Аударма атылшын тшнен (еп)

Сэйкест!к дэрежес1 - б1рдей (IDT)

4 Б1Р1НШ1 ТЕКСЕРУ MEP3IMI ТЕКСЕРУ KI 3I II II III I

5 АЛЕАШ РЕТ ЕНГТЗТЛДТ

Осы стандартца енггилетт езгержтер туралы ацпарат «Стандарттау жвтндегi нормативтт к\ лсаттар» ацпараттыц кврсеттштертде жыл сайын, сондай-ац мэтт взгерттер мен тузетулер ай сайын басылатын «¥лттыц стандарттар» ацпараттыц корсеткпшнОе жария emiaedi. Осы стандартты цайта царау (взгертту) жою жагдайында, muicmi хабарлар ай сайын басылатын «¥лттыц стандарттар» ацпараттыц корсеткпшнОе жария emiaeOi».

Осы стандарт Казакстан Республикасы Индустрия жэне жана технологиялар министрлЫнщ Техникальщ реттеу жэне метрология комитетшщ руксатынсыз ресми басылым ретшде тольщтай жэне белшектелш басылып шытарыла, кебейтше жэне таратыла алмайды.

Библиография

[1]    ISO 648:2008 Laboratoryglassware -    Single-volumepipettes

(Посудалабораторнаястеклянная. Пипеткисоднойметкой).

[2]    ISO 707:2008 | IDF 50 Milk and milk products - Guidance on sampling (Молокоимолочныепродукты. Руководствопоотборупроб).

[3]    ISO 1042:1998Laboratory glassware - One-mark volumetric flasks (Посудалабораторнаястеклянная. Мерныеколбысоднойметкой).

[4]    ISO 5725-1:1994Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part l.Generalprinciplesanddefinitions (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Общиепринципыиопределения).

[5]    ISO 5725-2:1994Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 2.Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method (Точность (правильностьипрецизионность) методовирезультатовизмерений.Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерения).

[6]    ISO 11816-1:2006 | IDF 155-1 Milk and milk products - Determination of alkaline phosphatase activity - Part 1: Fluorimetric method for milk and milk-based drinks (Молокоимолочныепродукты. Определение активности щелочной фосфатазы. Часть 1. Флуориметрический метод для молока и молочных напитков).

[7]    ISO 22160:2007 | IDF 209 Milk and milkbased drinks - Determination of alkaline

phosphatase    activity - Enzymatic photo-activated system (EPAS) method

(Молокоимолочныенапитки. Определение действия щелочной фосфатазы. Метод с применением энзиматическихфотоактивированных систем).

УДК 637.054-637.04    МКС    67.100.10

Ключевыеслова:молоко, активность щелочной фосфатазы, реактивы, оборудование, отбор проб, проведение испытаний, расчет и выражение результатов, точность, протокол испытаний.

к;азак;стан республикасыныц ¥лттьщ стандарты

CYT

Фосфатаза сшткпгш аныктау

Енгтзшген куш 2014-07-01

1 Колданылу саласы

Осы стандарт суттщ фосфатаза сштшк белсендшгш аньщтау эдютерш белгшейдт.

Осы эдю 6ip миллилитрге фосфатаза сштшк белсендшгше 1 мкг фенолдан кем емес болып колданылады .

Осы эдю кургак суттщ, ipKrr немесе кургак ipKirrin, сарысу немесе куртак сарысудьщ фосфатаза сштшк белсендшгш аньщтаута колайлы.

ЕСКЕРТУ Осы стандарт™ колдану е й нс каутн материалдарды, операцияларды жэне жабдьщты косуы мумшн. осы стандарт оны колдануга байланысты каутспдщкс жататын барльщ проблемаларды карастыру максатын кездемейдг Ецбегат коргау жэне каутспдщ техникасы жешндеп талаптарды белплеу, сондай-ак нормативтщ шсктсулсрд1 колдануды аньщтау колданушынын жауапкершшп болып табылады.

2    Терминдер мен аныктамалар

Осы стандартта TuicTi аньщтамаларымен келеа терминдер колданылады:

2.1 Фосфатаза сштйпк белсендйпп Осы стандартта белгшенген процедурамен сэйкес аньщталтан белсендшк СФСБ (cyrreri фосфатаза сштшк белсендшп) (alkalinephosphatase activity ALPactivity (alkalinephosphatase activity in milk)) - сынамен белшген фенол мелшерт

ЕСКЕРТПЕ Осы стандартта белгшенген фосфатаза сштшк белсендшп фенолдыц , 1 мл сынаньщ босатылган немесе калпына кслпршгсн микрограммдагы мелшер1 рстшдс коршсдг Баска стандартарда (мысалы, [6], [7]) фосфатаза сштшк белсендшп 6ip литрге миллиедидицадан келедг эдебиетте эртурл1 oipniк эквивалент!ндс фосфатаза сштшк белсендшп уннн колданылатын акпарат келпршген.

3    Эдктщ iuiKi мэш

Сынаны буферл1 ертнд1мен pH 10,6 аркылы суйылту керек жэне 37 °С температурасында 1 сатат келем1нде устау керек. Осындай жатдайда сынадаты кез-келген фосфатаза currici косылтан фенилфосфат натрий эсер1нен фенол беледт Бел1нген фенол хинонимидпен (дибромхинонхлоримидпен) реакцията тусед1 610 нм дибромоиндофенол (кек туей) беред1.

Ресми басылым

к;р СТ ISO 3356-2013

4 Реактивтер

«Анализ унии таза» квалификациясы реактивтерш колдану керек баскаша керсетшмесе тек тазартылган суды немесе тазальщтьщ баламалы дэрежесш тана,.

4.1    Гидроксид пен борат барий буферлнс ертнд1

Курамында карбонаты жок 25,0 барий гидроксид!н [Ва(0Н)28Н20] 500 мл-та 6ip белпа бар елшеуш кутыдагы сута ерггед! (5.8 караныз). Белпге дешн сумей жеткдзт куяды жэне араластырады

500 мл (5.8 карацыз) баска 6ip белпс1 бар елшеуш кутыда. 11,0 грамм бор кышкылын (Н3ВО3) суда ер1тед1. Белг1ге дей1н сумей жетшзш куяды жэне араластырады.

Ек1 ертщцш 50 °С. температурага дей1н кыздырады. BipiHe 6ipiH куйып сшкш араластырады.Алынтан ертидЫ 20 °С температурага дешн тез арада суытады. Гидроксид барий ертщцсшщ косымша мелшер1мен кажет болганда (10,6 ± 0,1) дешн pH ертщцсше жетк1зед1. Ертндш! сузпш кагаздан суз1п алады (5.10 караныз).

Гидроксид пен борат барийдщ суз1лген ертнд1сш ныгыз жабылатын тыгыны бар контейнерде сактайды. К^одданар алдында буфер ертщцсш б1рдей мелшерл1 сумей араластырады.

4.2    Туст1 буфер ертндшер1

4.2.1    ТусН буфер epmHflici I

.6,0 г натрий метаборат (NaB0₂) жэне 12,6 г НаВОг АНгО жэне 20,0 грамм натрий хлоридш (NaCl) 1000 мл-га 6ip белпс1 бар елшеу1ш кутыда ер1тед1(5.8 карацыз). Белпге дей1н сумей жетк1з1п куяды жэне араластырады.

4.2. Туст1 буфер epiTiHflici II 1000 мл-га 6ip белпс1 бар елшеу1ш кутыга(5.8 карацыз) 10 мл буфер I ертнд1сш ауыстырады (4.2.1 карацыз). Белпге дешн сумей жепазш куяды жэне араластырады.

4.3    Субстратты буфер epiTnmici

4.3.1    К¥Р^амьшД^а 0,01 % артьщ емес фенолдыц массальщ улес1 бар кос натрийл1 фенил фосфатыныц дигидраты (Na2C6H₅P04'2H₂0).

4.3.2    Ертлген гидроксид жэне борат барий (4.1 карацыз) 100 мл-не 0,1 г кос натрийл1 фенил фосфатыныц дигидратын (4.3.1 карацыз) ерггедт

4.4    Мырыш-мыс ер1т1нд1 тунбасы

1000 мл-га 6ip белпс1 бар елшеу1ш кутыга(5.8 карацыз) 3,0 г мырыш сульфатын (ZnS04-7H₂0) жэне 0,6 г мыс сульфатын (CuS04'5H₂0) ерггед1). Белпге дей1н сумей жетк1з1п куяды жэне араластырады.

4.5    2,6-дибромхинонхлоримид epiTnmici (ары карай - БХХИ), Гиббс реактив!

10 мл этанолдыц 96 % келемд! шогырлануына (40 ± 1) мг БХХИ (СбН₂Вг₂СМО) ериед!.

(4 ± 2) °С температурадагы куцпрт шыны бетелкеде сактайды. Eip ай мерз1м еткенде немесе тусс!зденгенде бракка шыгарады.

2

к;р СТ ISO 3356-2013

4.6    Мыш сульфатыныц ертндш

1000 мл-га 6ip белпа бар елшеуш кутыга(5.8 караныз) 0,05 г мырыш сульфатын (CUSO4 5H2O) ер1тедт 100 мл белпге дешн сумей жетюзш куяды жэне араластырады.

4.7    c(NaOH) = 0,5 моль/л гидроксид натрий ертщцст

4.8    Фенолдьщ стандартты epixi нд1 ci

4.8.1    Фенолдьщ бастапкы стандартты epixiнд1 ci

100 мл белпа бар елшеу1ш кутыга (5.8 карацыз) (200 ± 2) мг сусыз таза 99,5% фенолдьщ елшенген келемш ауыстырады. Фенолды суда ер1тед1. Белпге дей1н сумей жеткззш куяды жэне араластырады.

Фенолдьщ бастапкы стандартты epixi нд1 ci калыпты жагдайда (4 ± 2) °С температурасында 6 апта турады.

4.8.2    Фенолдьщ жумыстык; стандартты ертндшер1

100 мл белпа бар елшеу1ш кутыга (5.8 караныз) 10 мл фенолдьщ бастапкы стандартты epiTiHfliciH (4.8.1 караныз) тамызгынща сорып алады. Белпге дешн сумей жеткззш куяды жэне араластырады. (1 мл курамында 200 мкг фенол бар).

Араласкан стандартты ертндш1 6ip милилитрге сэйкес 2; 5; 10 и 20 мкг фенолдан келет1н фенолдьщ жумыстык стандартты ертндшерш даярлау уш1н пайдаланады.

5    Аппаратура

Карапайым зертхана жабдьщтары жэне дербес жагдайда теменде айтылгандар:

5.1 Аналитикальщ таразылар, арнайы I класты.

5.2Толкынньщ 610 нм узындыгында елшеуге келетш фотометр, толкынньщ дэлме-дэл узындыгы ± 1 нм.

5.3    Термостаттык бакылауда (37±1) °С температура туракталатындай су моншасы.

5.4    Кайнау температурасы (100 ± 1) °С болатындай су моншасы.

5.5    Куйын тэр1зд1 араластыргыш.

5.6    Сыйымдылыгы 0,1; 1; 5 жэне 10 мл, [1], А класты тамызгыштар

5.7    Сыйымдыльщтарына сэйкес шыны тут1ктер, фенолды тесемс1з жасалынган тыгындар.

5.8    Bip белпа бар елшеу кутылары, сыйымдылыгы 100; 500 жэне 1000 мл, [3], А класты.

5.9    Диаметрлер1 60 мм жэне 100 мм болатын шыны куйгылар.

5.10    Диаметрлер1 110 мм жэне 185 мм болатын тез сузетш сузпш кагаз.

6    Сынаманы ipiicrey.

Тандалган сынаны зертханага женелтед1. Тасымалдауда жэне сактауда ол бул1нбеген немесе езгермеген болуы Tnic.

Осы стандартта керсет1лгендей сынаманы ipiKTey эд1ст1н белЫ болып табылмайды . ¥сынылган сынаманы ipiKTey эд!с1 [2] керсетшген.

Сынакка арналган сынаманы сына курамында темендеу мен езгерулер болмайтындай ет1п сактау керек.

3

к;р СТ ISO 3356-2013

7    Сыналатын сынаманы дайындау.

7.1    Араластыру

Колданар алдында сыналатын сынаманы абайлап араластырады. Эдетте TuiciHuie араластыру унйн сыналатын сынаманы алдын-ала кыздыру кажетпп жок.. Егер алдын-ала кыздыру к;ажет болатын болса температура 35 °С тан аспауы Tuic.

7.2    ¥нтак;талган сут, кургак; ipiTKi жэне кургак; сарысу.

Кажет болса кыздыртан уакытта 10 г сыналатын сынаманы 90 мл сута ерггедт Сыналатын сынаманьщ тутастай epin кету1 унпн колданылатын температура 35°С тан аспауы Tuic..

7.3    Кыпщыл сыналатын сынаманыц бейтараптануы.

Егер сыналатын сынама кышкыл болса (pH < 7,0), гидроксид натрий (4.7 караныз) ертщцамен бейтараптанута pH жеткззедг

8    Эдктеме

8.1    Градуирлеу кисытынын курылымы.

8.1.1    Стандартный ертндшердщ келемш бес шыны тупкке дайындайды ( 5.7 караныз), 1 мл суды бакылаушы немесе бос сынамата жэне 1 мл терт фенолдыц жумысты стандартты ер1т1нд1лер1н1ц эркайсысын ( 4.8.2 караныз) калган терт тупкшеге сэйкес тупкке сорып ал ад ы. Стандартты сынамалы тупкшелерде 0(бакылаушы немесе бос); 2; 5 жэне 20 мкг сэйкес фенол болады..

8.1.2    Эр тупкшеге (8.1.1 караныз) 1 мл мыс сульфат ертндюш (4.6 караныз), 5 мл II тусп буфер ертндюш (4.2.2 караныз), 3 мл су жэне 0,1 мл БХХИ ертндюш (4.5 караныз) косады жэне араластырады. Туе айкындалу уш1н (жет1лу) белме температурасында 30 мин уакыт аралыгына кояды.

8.1.3    Стандартты ертндшердщ оптикальщ тыгыздыгын бакылаушы немесе бос ер1т1нд1н1н 610 нм толкын узындыгындагы оптикальщ тыгыздыгына салыстырып аньщтау.

8.1.4    Микрограмдагы (8.1.1 караныз) фенол мелшерше байланысты оптикальщ тыгыздьщ тэуелд1г1н1н кестес1н куру. Ерадуирлеу кисыгыньщ тенесуш аньщтау.

8.2 Аныктау.

8.2.1    Аньщтау кез1нде кун сэулесшщ пкелей тусу1нен коргану. Сшекей жэне тер 1здер1мен ластану кез1нде жалган он нэтижелер 6epyi мумк1н жэне одан аулак болуы ти1с.

8.2.2    1 мл сыналатын немесе калпына келт1ршген сынама бар ек1 тупкшенщ эркайсысынан (5.7 караныз) тамызгышпен сорып алады. Тут1кшен1н 6ipeyiH бакылаушы немесе бос сынама ретшде пайдаланады.

8.2.3    Бос сынамасы бар тут1кшен1 тыгынмен жабады. Кайнап турган суы бар химияльщ стаканга орналастырады. Алюминд1 жукалтырмен стаканды жабады.Тут1кшен1н барлыгы кыздырылуы уш1н химияльщ стакан жукалтырмен жабулы куй1нде тут1кшен1 2 мин кайнаган суда кыздырады. Одан сон тупкшеш салкын суда белме температурасына дешн салкындатады.

к;р СТ ISO 3356-2013

Осыдан кешн бос сынама бар тупкше мен сыналатын сынама бар тупкшеш уксас амалмен жасайды.

8.2.4    Сыналатын сынама салынган тупкше (8.2.2 караныз) мен бос сынама салынган тупкше тэр1зд1 (8.2.2 караныз) 10 мл субстратты буф ер л i ертндЫ (4.3 караныз) косады жэне араластырады.

8.2.5    Мезгш-мезгш араластыра отырып ею тут1кшен1 де дереу су моншасында (5.3 караныз) 37 °С температурада 60 минут кыздырады.

8.2.6    Ею тут1кшен1 кайнап туртан суы бар стаканга салады. Алюминд1 жукалтырмен стаканды жабады. ею тут1кшен1 кайнатан суда 2 минут кыздырады жэне суьщ суда белме температурасына дешн салкындатады.

8.2.7    Эр тупкшеге мырыш-мыс ертнд1 тунбасыньщ (4.4 караныз) 1 мл косады жэне мукият араластырады.

8.2.8    Алтанщы 6ipHeuie миллилитр1н тегш эр тупкшенщ шшдепсш сузпш катаздан cy3in алады.(5.10 караныз). Тамызтышпен эр су сузбеден 5 мл сорып алады да баска шыны тупкшеге куяды.(5.7 караныз).

8.2.9    Эр тупкшеге (8.2.8 караныз) 5 мл I тусп буф ер л i ертщцш косады (4.2.1 караныз) жэне араластырады.

8.2.10    Эр тупкшеге 0,1 мл БХХИ (4.5 караныз) ертндюш косады жэне араластырады. Ею ертндшщ Tyci айкындалу уш1н белме температурасында 30 мин уакыт аралытына кояды.

8.2.11    Стандартты ертндшердщ оптикальщ тытыздытын бакылаушы немесе бос ер1т1нд1н1н 610 нм толкын узындытындаты оптикальщ тытыздытына салыстырып аньщтау.

8.2.12    Егер 8.1.3 сэйкес елшенген 8.2.11 елшенген сынакка арналтан сынаманьщ оптикальщ тытыздыты, 6ip миллилитрге 20 мкг фенолдан келетш фенолдьщ жумыстьщ стандартты epiriHfliciHiн оптикальщ тытыздытынан артып кетсе онда сыналатын сынама немесе калпына келпршген сынаманы теменде келпршген эдю бойынша аньщтауды кайталайды.

Сыналатын сынаманьщ 6ip келемш немесе калпына келпршген сынаманы сэйкес келем1мен абайлап кайнаута дешн апарады сондай сыналатын сынаманы немесе калпына келпршген сынаманы кайнату аркылы фосфатаза эсер1н жояды. 8.2.2. мен жалтастырады.

9 Нэтижелерд1ц ece6i мен магынасы

9.1    Есептеу

9.1.1    8.2.11 аньщталтандай оптикальщ тытыздьщта фенол мелшерш микрограмда градуирлеу кисыты аркылы(8.1.4). аньщтау.

9.1.2    1 формуланы колдана отырып суттщ милилитр1ндег1 айкындалтан фенол мелшер1мен фосфатаза белсенд1л1пн есептеу:

= 2,4 х m х f_v, q)

m - 9.1.1 алынтан микрограммдаты фенол массасы;

f

^J Р - суйылту коэффициент! сыналатын немесе калпына келпршген сынамада

(8.2.12), кажет болтанда (егер ^jfp = 1 болмаса).

9.1.1 Ерадуирлеу кисыты (8.1.4) кемепмен 8.2.11 аныкталтандай оптикальщ тытыздьщ аркылы микрограммдаты фенол келем1н аньщтау.

5

к;р СТ ISO 3356-2013

9.2 Нэтижелерд1 есептеу жэне ернектеу

Сынак нэтижелерш дэлме-дэлдшпен 6ipiHini ондьщ белпге дешн ернектейдт

10 Дэлдж

10.1    Зертхана аралык сынактар

[4] жэне [5] сэйкес еткззшген кайталанушылык жэне кайталангыштык шектершщ мэш зертхана аральщ сынактар нэтижесшде алынган. Е1ктималдьщ денгеш унпн 95 % дешн мэндер ернектелед1 жэне концентрация мен матрица диапазоны у™¹¹ колданылмайды, бершген мэннен ерекшеленедт.

10.2    кайталанушылык (ыктималдык)

Eip эдюпен уксас сыналатын материалдармен эртурл1 зертханада эртурл1 курал колдантан эртурл1 зертханашымен, 1,5 мкг/мл.арту кезшдеп 5 % жатдайдан артьщ емес екл белек тэуелс1з нэтижелер арасындаты абсолютт1к айырма.

10.3    кайталангыштык

Eip эдюпен уксас сыналатын материалдармен эртурл1 зертханада эртурл1 курал колдантан эртурл1 зертханашымен, 3,9 мкг/мл.арту кезшдеп 5 % жагдайдан артьщ емес екз белек тэуелаз нэтижелер арасындагы абсолютпк айырма.

11 Сынак хаттамасы

Сынак хаттамасында ец аз дегенде келеа акпараттар болуы керек:

a)    сынаманы тольщ идентификациялау унйн кажетп барльщ акпарат;

b)    пайдаланылган сынаманы ipiKTey эд1 ci;

c)    осы стандартка сштемелер1мен пайдаланылган сынак эд!с1;

d)    сынак нэтижелер!не эсер еткен осы стандартта керсетшмеген барльщ жумыс егжей-тегжейлер1 немесе кемекгш деп саналатын кактыгыстар;

e)    егер ьщтималдык тексершген болса алынган соцты келпршген нэтиже алынган сынак нэтижелер! болып табылады

6

к;р СТ ISO 3356-2013

А косымшасы

(ацпараттыц)

Зертхана аралык сынактар

2005 жылы алты сынамадагы тутас сиыр cyri мен эртурл1 келемдеп сиырдьщ шии сутше эртурл1 жеН елдщ тогыз зертханасын косатын зертхана аральщ б1рлескен сынактар жасалды. Алынган нэтижелер ISO 5725-1 [4] и ISO 5725-2[5] сэйкес А. Ккестесшде керсетшгендей дэлдш деректер алу унпн статистикалык сараптамага ушырады.

Бул тэждрибет Францияньщ азык-тулж сапасын жэне каутслздшш бакылау кызмеН у йымд астыр д ы.

Кесте А.1 Фосфатаза сштйпгшщ зертхана аралык сынак нэтижелер!

Параметр Сынамалар Ортаа) 1 2 3 4 5 6 Бершген мэндср1'. мкг/мл 2,3 4,2 6,5 9,9 11,9 35,7 Жоюдан KciiiHri катысушылар саны 8 8 8 8 8 8 Кайталану nieri, г (= 2,8sr), мкг/мл 0,82 0,47 1,36 0,91 0,98 3,73 1,5 Кайталанудын орта квадратты ауыткуы sr, мкг/мл 0,29 0,17 0,48 0,32 0,35 1,32 0,5 Кайталану вариациясыньщ коэффицснт1 CV(r), % 12,78 3,94 7,47 3,24 2,92 3,69 4,3 Кайталангыштьщ nieri, г (= 2,8 sr), мкг/мл 1,59 1,51 2,52 2,62 3,22 9,70 3,9 Кайталангыштьщ орта квадратты ауыткуы, sr, мкг/мл 0,56 0,54 0,89 0,93 1,14 3,43 1,4 кайталангыштык вариациясыньщ коэффицентг СУ(г), % 24,83 12,70 13,80 9,36 9,54 9,59 11,0

a)    барльщ тускен мондсрд1 шеттеткеннен кешнп барльщ зертханадагы ец орташа. b)    Бср1лгсн мэннен 2,3 мкг/мл алынган кайталану жэне кайталангыштык uiCKTcpi жэне орта квадратты ауыткулар нэтижелерд1ц алынуымен сссптслсд1 .

7