КАЗАХСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫЦ УЛТТЬЩ СТАНДАРТЫ

3 АЛ АЛ СЫЗ ДАНДЫРЫ JIF АН CYT

Кдоамындагы лаутулоза мелшерш аныктау Жогары эсерл1 суйыктык хроматографиясын колданып жасалатын эдк

МОЛОКО СТЕРИЛИЗОВАННОЕ

Определение содержания лактулозы Метод с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения

Щ* СТ ISO 11868-2013

ISO 11868:2007 Heat-treated milk - Determination of lactulose content - Method using high-performance liquid chromatography (IDT)

Ресми басылым

К^азацстан Республикасы Индустрия жэне жара технологиялар министрлйтнщ Техника лык реттеу жэне метрология комитет!

(Мемстандарт)

КАЗАХСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫЦ УЛТТЬЩ СТАНДАРТЫ

3 АЛ АЛ СЫЗ ДАНДЫРЫ JIF АН CYT

К|урамындагы лаутулоза молшерш аныцтау Жогары accpjii срыктьщ хроматографиясын колданмп жасалатын эдк

Щ* СТ ISO 11868-2013

ISO 11868:2007 Heat-treated milk - Determination of lactulose content - Method using high-performance liquid chromatography (IDT)

Ресми басылым

К^азацстан Республикасы Индустрия жэне жаца технологиялар министрлйтнщ Техника лык реттеу жэне метрология комитет!

(Мемстандарт)

к;р СТ ISO 11868-2013

В косымшасы

(ацпараттыц)

Зертхана аралык сынактардыц корытындылары

Эр турл1 бес елдщ тогыз зертханасында oipirin еткдзшген хальщаральщ сынакдар, алты сут сынамаларында жузеге асты. Алынган нэтижелер [2] жэне [3] сэйкес статистикальщ анализ жасалды жэне В 1 кестесшде керсетшген прецизиондьщ мэл1меттерге алып келд1.

В.1 кесте - Кдоамындаты лаутулоза мелшерш аныктаудагы зертхана аралык

сынактардын корытындылары

Сынама 1 2 3 4 5 6 Орта О рта к мош. мг/л 357,07 362,82 376,98 273,09 331,78 331,11 Ататтьщты жоюдан кейшп катысушылар саны3 9 9 8 9 9 9 Кайталану nieri, г (2,8 sr), мг/л 16,217 20,187 11,521 14,483 14,344 16,509 15,543 Кайталанудын стандартты а\ыткуы. .V,, мг/л 5,792 7,210 4,115 5,172 5,123 5,896 5,550 Кайталанудын eircpic коэффициент, % 1,622 1,987 1,091 1,894 1,544 1,781 1,536 Калпына кслпру nieri, R (2,8 sr), мг/л 47,737 52,783 49,214 48,091 43,230 44,541 47,599 Калпына келпруд1ц стнадарттьщ ауытцуы, у, мг/л 17,049 18,851 17,567 17,175 15,439 15,908 16,998 Калпына келттрудщ 03repic коэффициенту % 4,775 5,196 4,662 6,289 4,653 4,804 5,064

а Кайталану мен калпына келттрудщ о рта к мэш жэне стандартты ауыткулары. [4]-те керсетшгендей 2-де емес, З-сынамадагы 6ip ататтьщтан баскасы есептелшген. Агаттьщ мэшн жоюдан кешн алынтан корытындылар бойынша кайтадан сынакты жузеге асыруга жол бер1лмейд1._

9

Библиография

[1]    ISO 707|IDF 50 Milk and milk products - Guidance on sampling (Сут жэне мут ешмдерк Сынаманы ipiKTey бойынша нускаулык).

[2]    ISO 5725-1 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -Part 1: General principles and definitions (Эдютер мен елшеу нэтижелершщ накдылыты (дурыстыльщ жэне прецизиондьщ) . 1 -бел1м Жалпы кагидалар мен аньщтамалар).

[3]    ISO 5725-2 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method (Эдютер мен елшеу нэтижелершщ накдылыгы (дурыстыльщ жэне прецизиондьщ) ,2-бел1м Кайталануды аньщтаудаты непзп эдю жэне елшеудеп стандартты калпына келЛру эдю1).

[4]    Моттар, Дж. Milk - Determination of lactulose. Bulletin of the International Dairy

Federation, 285,    1993,    pp.    86-97    (Сут.    Лактулозаны аньщтау. Хальщаральщ сут

федерациясыныц бюллетеш, 285, 1993, 86-97 бет)

Э0Ж 637.12.04/.07    МКС    67.100.10

Туши сездер: сут, залалсыздандырылтан сут, майсыздандырылтан сут, лаутулоза курамы, сынамаларды ipiicrey, лактулоза шыцы, сыналатын сынама, мембралды фильтр, ультрадыбыстьщ монша.

10

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

МОЛОКО СТЕРИЛИЗОВАННОЕ

Определение содержания лактулозы Метод с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения

СТРК ISO 11868-2013

ISO 11868:2007 Heat-treated milk - Determination of lactulose content - Method using high-performance liquid chromatography (IDT)

Издание официальное

Комитет технического регулирования и метрологии Министерства индустрии и новых технологий Республики Казахстан

(Г осстандарт)

Астана

Предисловие

1    ПОДГОТОВЛЕН И ВНЕСЕН Республиканским государственным предприятием «Казахстанский институт стандартизации и сертификации» и Техническим комитетом по стандартизации 44 «Технолог»

2    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Председателя Комитета технического регулирования и метрологии Министерства индустрии и новых технологий Республики Казахстан от 13 ноября 2013 года за № 526-од

3    Настоящий стандарт идентичен по отношению к международному стандарту ISO 11868:2007 Heat-treated milk - Determination of lactulose content - Method using high-performance liquid chromatography (Молоко стерилизованное. Определение содержания лактулозы. Метод с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения).

В настоящий стандарт внесены изменения в связи с особенностями построения Государственного системы технического регулирования, которые выделены по тексту курсивом.

Международный стандарт ISO 11868:2007 Heat-treated milk - Determination of lactulose content - Method using high-performance liquid chromatography разработан Техническим комитетом ISO/TK 34, Пищевые продукты, Подкомитет ПК 5, Молоко и молочные продукты, и Международной федерацией молочной продукции (IDF).

Перевод с английского(ей)

Степень соответствия - идентичная (ШТ)

4    СРОК ПЕРВОЙ ПРОВЕРКИ ПЕРИОДИЧНОСТЬ ПРОВЕРКИ

5    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему Стандарту публикуется в указателе «Нормативные документы по стандартизации», а текст изменений - в ежемесячных информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (отмены) или замены настоящего Стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе «Национальные стандарты»

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Комитета технического регулирования и метрологии Министерства индустрии и новых технологий Республики Казахстан

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

МОЛОКО СТЕРИЛИЗОВАННОЕ

Определение содержания лактулозы Метод с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения

Дата введения 2014.07.01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания лактулозы стерилизованного молока, обезжиренного молока, частично обезжиренного или цельного молока методом высокоэффективной жидкостной хроматографии для различения молока, стерилизованного при помощи высокотемпературной обработки (ВТО), от молока, стерилизованного в бутылках.

Метод испытан в диапазоне содержания лактулозы от 200 мг/л до 1500 мг/л и применим ко всем видам стерилизованного молока.

Метод, описанный в настоящем стандарте, должен использоваться в случае спорных вопросов.

2    Термины и определения

В настоящем стандарте применяется следующий термин с соответствующим определением:

2.1    Содержание лактулозы в обезжиренном, частично обезжиренном или цельном молоке (lactulose content of skimmed, partially skimmed or whole milk): Масса вещества, определенная по процедуре, установленной в настоящем стандарте.

ПРИМЕЧАНИЕ Содержание лактулозы выражается в миллиграммах на литр пробы.

3    Сущность метода

Жиры и протеины удаляются из пробы молока, которая далее фильтруется. Содержание латулозы в фильтрате определяется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ). Результат, полученный для пробы, оценивается сравнением с результатами для стандартных образцов, состоящих из обезжиренного молока, не содержащего лактулозы, с известным количеством добавленной лактулозы.

4    Реактивы

Применяют только реактивы квалификации «чистый для анализа», если не обусловлено иначе, и бидистиллированную или воду эквивалентной чистоты.

4.1    Моногидрат лактулозы

4.2    Лактулоза, не менее 99 % чистоты.

4.3    Раствор для предварительной обработки пробы

Издание официальное

Растворяют 91,0 г дигидрата ацетата цинка, Zn(CH3C00)2^-2H20,    54,6    г

тетракозагидрата фосфорновольфрамовой кислоты, Нз[Р(\Уз0ю)4]‘24Н₂0, и 58,1 мл ледяной (безводной) уксусной кислоты в воде в мерной колбе на 1000 мл и доводят до метки водой.

4.4    Элюэнт

Фильтруют воду класса ВЭЖХ через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (см. 5.8) и перед использованием кипятят для удаления растворенного воздуха.

Для удаления растворенного воздуха вместо кипячения воды могут использоваться другие методы, дающие идентичные результаты (например, гелиевый барботаж).

ПРИМЕЧАНИЕ Такие методы, как правило, более дорогостоящие.

4.5    Стандартные образцы

4.5.1    Стандартный раствор лактулозы

Взвешивают, с точностью до 0,1 мг, 75 мг лактулозы (см. 4.2), количественно переносят в мерную колбу на 100 мл (см. 5.6). Растворяют в воде и доводят до метки водой.

4.5.2    Пастеризованное обезжиренное молоко, не содержащее лактулозы в соответствии с определением по методу, установленному ниже.

Используют пробы идентичного пастеризованного обезжиренного молока, содержащего приблизительно 250; 500; 750 и 1000 мг лактулозы на литр, полученные добавлением 5; 10; 15 и 20 мл, соответственно, стандартного раствора лактулозы (см. 8.2) к пастеризованному обезжиренному молоку.

5 Аппаратура и материалы

Для применения настоящего метода используют следующее лабораторное оборудование.

5.1    Аналитические весы, специального класса I.

5.2    Стеклянная воронка, диаметром 7 см.

5.3    Фильтры.

5.3.1    Фильтровальная бумага, среднепористая, диаметром 12,5 см.

5.3.2    Целлюлозно-ацетатные мембраны, с диаметром пор 0,45 мкм.

5.4    Мерный цилиндр, вместимостью 25 мл.

5.5    Градуированная пипетка, вместимостью 10 мл, с ценой деления 0,1 мл.

5.6    Мерные колбы с одной меткой, вместимостью 50 мл, 100 мл и 1000 мл.

5.7    Пипетки с одной меткой, вместимостью 5 мл, 10 мл и 20 мл.

5.8    Стеклянная фильтрационная установка, с диаметром пор фильтра 0,45 мкм.

5.9    Стеклянные колбы, вместимостью 20 мл, с пробкой.

5.10    Ультразвуковая водяная баня.

5.11    Водяной вакуумный насос.

5.12    Оборудование ВЭЖХ, указанное ниже.

5.12.1    Магнитная мешалка и нагреватель, для поддержания температуры элюента 90 °С ± 2 °С до подачи его в предколонку для анализа.

5.12.2    Насос, дающий расход объема от 0,3 мл/мин до 0,6 мл/мин, с пульсацией менее, чем 1 % падения давления в колонке (от 1,5 МПа до 4 МПа).

2

CT РК ISO 11868-2013

5.12.3    НРХ-87 Р (Bio-Rad, 30 см х 0,78 см)¹^, или эквивалентная колонка, заполненная свинец-сульфоновым катионитом на полистирол-дивинилбензольном сополимере со степенью сшитости 8 %. Предколонка состоит из системы деозоления Био - Рад¹-* (кассета, 3 см х 0,46 см, наполненная Н⁺-катионитом, и кассета, 3 см х 0,46 см, наполненная карбонат-анионитом) или системы эквивалентной эффективности.

Предколонки увеличивают срок службы и длину аналитической колонки, уменьшая проблемы и значительно понижая ошибки разделения. Когда система ВЭЖХ начинает терять разрешение, заменяют использованную предколонку до того, как помехи достигнут основной колонки.

5.12.4    Печь термостатической колонны, способная поддерживать температуру 75 °С ± 1 °С.

Предколонки должны размещаться за пределами печи. Подводящая к основной колонке трубка в печи должна иметь длину от 10 см до 15 см для доведения температуры элюента до 75 °С, иначе могут произойти значительные общие погрешности.

5.12.5    Детектор по показателю преломления, высокочувствительный, с уровнем шума менее 5 х 10"⁹ единицы показателя преломления, измеренного в воде.

Внутренний термостат должен устанавливаться на температуру выше комнатной, достаточную для получения устойчивой базовой линии. Чаще всего рекомендуется температура от 35 °С до 40 °С.

ПРИМЕЧАНИЕ Высокочувствительный мониторинг показателя преломления затрудняется дрейфом базовой линии вследствие тепловых изменений. Для понижения дрейфа базовой линии, рекомендуется располагать оборудование ВЭЖХ в кондиционированном помещении с целью недопущения изменений температуры.

5.12.6    Интегратор для измерения высоты пика

Параметры управления интеграции (например, ширина пика, смещение наклона, пороговая величина пика) должны выбираться тщательно.

Интегратор должен быть отрегулирован так, чтобы опускать перпендикуляр между пиками лактозы и лактулозы. (Обезжиривание приводит к неточности вследствие присутствия различных количеств глюкозы в молоке). Интегратор должен останавливаться при выходе на базовою линию между пиками лактозы и лактулозы, если снижение достигнет базовой линии, при всех концентрациях лактулозы.

Многие интеграторы автоматически изменяют параметры пиковой интеграции при прогоне. По возможности, эта функция должна отключаться для получения более воспроизводимых результатов.

ПРИМЕЧАНИЕ Допускается использовать аппаратуру, мерную посуду, реактивы, имеющие аналогичные метрологические характеристики или выше. Применяемые средства измерений подлежат испытаниям с целью утверждения типа или метрологической аттестации, поверки средств измерений и внесению в реестр Республики Казахстан в соответствии с законодательством в области обеспечения единства измерений.

6 Отбор проб

В лабораторию должна быть направлена представительная проба. Она не должна быть повреждена или изменена при транспортировке или хранении.

¹¹ НРХ-87 Р (Bio-Rad, 30 см х 0,78 см) и системы деозоления Био - Рад являются примерами подходящего оборудования, доступного коммерчески. Информация приводится для удобства пользователей настоящим стандартом и не является требованием ISO и IDF.

3

Осуществление отбора проб не указано в настоящем стандарте. Рекомендации по отбору проб указаны в [1].

Хранят пробу таким образом, чтобы не допускать повреждения и изменения.

7    Подготовка испытуемой пробы

Пробу доводят до 25 °С ± 5 °С и тщательно перемешивают. Если жир распределен неравномерно, медленно нагревают до 40 °С, осторожно перемешивают только переворачиванием и быстро охлаждают до 20 °С ± 2 °С.

8    Методика

8.1    Подготовка рабочей части (пробы)

8.1.1    Отмерить пипеткой 15 мл испытуемой пробы (см. Раздел 7), перенести в мерную колбу на 50 мл (см. 5.6). Добавить 20 мл воды мерным цилиндром (см. 5.4) и перемешивать, создавая водоворот. Добавить 5,5 мл раствора для предварительной обработки пробы (см. 4.3) градуированной пипеткой (см. 5.5) и перемешать. Добавить воды до метки и перемешать.

8.1.2    Оставить на 1 час при температуре 25 °С ± 5 °С, профильтровать с использованием стеклянной воронки (см. 5.2) через фильтр (см. 5.3.1 или 5.3.2). Отбросить первые 5 мл фильтрата. Собрать остатки фильтрата в чистый стеклянный сосуд.

8.2    Подготовка калибровочных образцов

8.2.1    Общие положения

Отобрать пипеткой по 15 мл обезжиренного молока, не содержащего лактулозы (см.

4.5.2) , перенести в каждую из четырех мерных колб на 50 мл.

8.2.2    Калибровочный образец А

8.2.2.1    Отмерить пипеткой 5 мл стандартного раствора лактулозы (см. 4.5.1) в первую мерную колбу на 50 мл, содержащую обезжиренное молоко без лактулозы (см. 8.2.1), и перемешать.

8.2.2.2    Добавить 15 мл воды мерным цилиндром (см. 5.4) и перемешать.

8.2.2.3    Добавить 5,5 мл раствора для предварительной обработки пробы (см. 4.3) градуированной пипеткой (см. 5.5) и перемешать. Довести до метки водой и перемешать. После выдерживания раствора в течение 1 часа при температуре 25 °С ± 5 °С профильтровать при помощи стеклянной воронки (см. 5.2) через фильтр (см. 5.3.1 или

5.3.2) . Отбросить первые 5 мл фильтрата. Собирать остатки фильтрата в чистый стеклянный сосуд.

8.2.3    Калибровочный образец В

Отмерить пипеткой 10 мл стандартного раствора лактулозы (см. 4.5.1) во вторую мерную колбу на 50 мл, содержащую обезжиренное молоко без лактулозы (см. 8.2.1), и перемешать.

Добавить 10 мл воды мерным цилиндром (см. 5.4) и перемешать.

Продолжить по 8.2.2.3.

8.2.4    Калибровочный образец С

Отмерить пипеткой 15 мл стандартного раствора лактулозы (см. 4.5.1) в третью мерную колбу на 50 мл, содержащую обезжиренное молоко без лактулозы (см. 8.2.1), и перемешать.

Добавить 5 мл воды мерным цилиндром (см. 5.4) и перемешать.

4

CT РК ISO 11868-2013

Продолжить по 8.2.2.3.

8.2.5 Калибровочный образец D

Отмерить пипеткой стандартный раствор лактулозы (см. 4.5.1) в четвертую мерную колбу на 50 мл, содержащую обезжиренное молоко без лактулозы (см. 8.2.1).

Продолжить по в 8.2.2.3.

8.3 Хроматографическое определение

8.3.1    Отмерить пипеткой 3 мл фильтрата испытуемой пробы (см. 8.1.2) и калибровочных образцов (см. 8.2) в отдельные стеклянные колбы (см. 5.9). Удалить растворенный воздух из фильтрата, прикрепив колбу к водяному вакуум-насосу (см. 5.11) и выдерживая в ультразвуковой водяной бане (см. 5.10) в течение 30 секунд при комнатной температуре. Не допускать пенообразования.

ПРИМЕЧАНИЕ Содержание воздуха в пробе может вызвать появление отрицательного пика после времени удержания лактулозы.

8.3.2    Ввести от 10 мкл до 30 мкл (точно измеренных) фильтрата в аппарат ВЭЖХ (см. 5.12), работающий с расходом 0,3 мл/мин.

Если содержание лактулозы менее 200 мг/кг молока, необходимо выполнить анализ с использованием двух последовательно соединенных колонок, увеличивая расход до 0,6 мл/мин.

ПРИМЕЧАНИЕ Хроматограмма (см. Приложение А) показывает мощный зашкаливающий пик лактозы с временем удерживания 19 минут, как в случае стандартных проб (см. 8.2.2, 8.2.3, 8.2.4 и 8.2.5), так и стерилизованного молока, и относительно малый пик лактулозы с временем удерживания 24 минуты.

Отрегулировать регистрирующее устройство (плоттер), обеспечивающее минимальную высоту пика лактулозы 5 мм для стандартного образца А (см. 8.2.2). В зависимости от качества используемой колонки и пред колонки (см. 5.12.3), получить четко разделенный или нечетко разделенный пик лактулозы (см. 5.12.6). Для определения минимально необходимого разрешения между лактозой и лактулозой, приготовить стандартный раствор, содержащий 0,69 г лактозы (см. 4.1) и 3,75 мг лактулозы (см. 4.2) на 50 мл.

Вычислить степень разделения, R_s, (должна быть не менее 5) по формуле (1):

(1)

где /?2 - высота пика лактулозы;

Иу - ширина зоны между пиками лактозы и лактулозы.

Рекомендуется шестидесятиминутный интервал между введением последующих

проб.

8.3.3 Интегратор регистрирует высоту каждого пика, hi и /?2, где hj- это высота пика лактозы и /?2 — это высота пика лактулозы.

Проба должна быть повторно введена, если дрейф базовой линии превышает 10 % полной шкалы.

5

к;р СТ ISO 11868-2013

Алгысез

1    «Казакстан стандарттау жэне сертификаттау институты» Республикальщ мемлекетпк кэсторны мен стандарттау женшдеп 44 «Технолог» техникальщ комитет! ЭЗГРЛЕП ЕНГ13Д1

2    Казакстан Республикасы Индустрия жэне жана технологиялар министрлш Техникальщ реттеу жэне метрология комитет! Тератасыньщ 2013 жылты 13 карашадаты № 526-од буйрытымен БЕК1ТШ1П КОЛДАНЫСКА ЕНГ13ШД1

3    Осы стандарт ISO 11868:2007Heat-treatedmilk-Determinationoflactulosecontent -Methodusinghigh-performanceliquidchromatography (Залалсыздандырылтан сут. Лактулоза мелшер1н аньщтау. Жотары эсерл1 суйьщтьщ хроматографиясын колданып жасалатын эд1с) хальщаральщ стандартына катынасы бойынша б1рдей.

Осы стандартка мэтшде курсивпен бел1нген, Мемлекетпк техникальщ реттеу жуйесшщ курылу ерекшел1ктер1не байланысты редакцияльщ езгертулер енгтзшдт

ISO 11868:2007Heat-treatedmilk -Determinationoflactulosecontent -Methodusinghigh-perfonnanceliquidchromatography хальщаральщ стандартын ISO/TK 34, Тамак ен1мдер1 техникальщ комитет!, IK 5, Сут жэне сут ешмдер iuiKi комитет! мен Хальщаральщ сут ешмдер1 федерациясы (IDF) эз!рледт Аударма атылшын тшнен (еп)

Сэйкеспк дэрежес! - б1рдей (ШТ)

4 Б1Р1НШ1 ТЕКСЕРУ MEP3IMI ТЕКСЕРУ KI 3I II II III I

5 АЛЕАШ РЕТ ЕНГТЗТЛДТ

Осы стандартца енггилетт езгержтер туралы ацпарат «Стандарттау жвтндегi нормативтт цужаттар» ацпараттыц кврсеттштертде жыл сайын, сондай-ац мэтт взгерттер мен тузетулер ай сайын басылатын «¥лттыц стандарттар» ацпараттыц корсеткпшнОе жария emiaedi. Осы стандартты цайта царау (взгертту) жою жагдайында, muicmi хабарлар ай сайын басылатын «¥лттыц стандарттар» ацпараттыц корсеткпшнОе жария emiaeOi».

Осы стандарт Казакстан Республикасы Индустрия жэне жана технологиялар министрлшнщ Техникальщ реттеу жэне метрология комитет! Hi н руксатынсыз ресми басылым ретшде тольщтай жэне белшектелш басылып шытарыла, кебейтше жэне таратыла алмайды.

CT РК ISO 11868-2013

Важно до количественного определения проверить вид хроматограммы для выявления любых аномалий вследствие ухудшения работы аппаратуры или особенностей происхождения и природы анализируемой пробы. При сомнениях повторяют анализ.

Высота пика лактозы в испытуемой пробе не должна отклоняться более, чем на 10 % по сравнению с калибровочными образцами. Иначе должны быть приготовлены другие калибровочные образцы.

Всегда при анализе каждой серии испытуемых проб включать калибровочные образцы. Повторно калибровать каждые 10-15 проб.

8.4 Восстановление

При необходимости провести восстановление, дополняя стандартную процедуру. Если в пробах с содержанием лактулозы, равным или превышающим 200 мг/л, восстановление менее 99 %, анализ должен быть повторен.

9 Расчет и выражение результатов

9.1 Калибровка

После введения каждого стандартного образца и разделения аппаратом ВЭЖХ, интегратор должен регистрировать высоту следующих пиков:

йга - численное значение высоты пика лактулозы стандартного образца А;

йгь - численное значение высоты пика лактулозы стандартного образца В;

Й2_С- численное значение высоты пика лактулозы стандартного образца С;

h2d - численное значение высоты пика лактулозы стандартного образца D.

Рассчитать концентрацию с_а_d лактулозы в стандартных образцах А, В, С и D (см. 8.2) в миллиграммах на 50 мл по формулам (2) - (5):

с_а = ^ть ^х 5/100, с_ъ = m_L х 10/100, с_с = m_L х 15/100, ^cd ^{= m}L ^х 20/100,

где mi - масса лактулозы в стандартном растворе (см. 4.5.1).

Линейный регрессионный анализ регрессии по методу наименьших квадратов для пар h_2a ~ с _а,, Ь₂ъ ~ съ, h_2c - с_с и h₂,j - cj, где с_а, съ, с_с и с а - независимые переменные, дает коэффициенты регрессии, а и 6, в формуле (6):

h₂ = а + Ъ х c_L

где h₂ - численное значение высоты пика лактулозы, являющейся зависимой переменной в регрессии;

cl - численное значение концентрации лактулозы, в миллиграммах на 50 мл, являющейся независимой переменной в регрессии.

9.2 Расчет содержания лактулозы

Рассчитать содержание лактулозы, wl, выраженное в миллиграммах на литр, в испытуемой пробе, с использованием формулы (7):

к;р СТ ISO 11868-2013

КАЗАХСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫН, ¥ЛТТЬЩ СТАНДАРТЫ_

ЗАДАЛСЫЗДАНДЫРЫЛГАН CYT

Курамындагы лаутулоза мелшерш аныктау Жогары эсерл1 суйыктык хроматографиясын колданып жасалатын эд1с

Енпзшген куш 2014.07.01

1    Е^олданылу саласы

Осы стандарт залалсыдандырылтан сут, майсыздандрылтан сут, iniiHapa майсыздандырылытан сут немесе шелмектерде заласыздандырылтан суттен, жогары температурамен ендеу (ЖТО) кемепмен эр турл1 cyrri заласыздандыру yniiH жогары эсерл1 суйьщтьщ хроматографиясын колданып жасалатын эдюпен алынган майы алынбаган сут курамындагы лактулоза мелшерш аньщтау эд1сш аньщтайды

0дю лактулоза мелшерш 200 мг/л-ден 1500 мг/л-ге дешнп epicTe жэне залалсыздандырылган суттщ барльщ тур1не колданумен сыналган.

Осы стандартта сипатталган эдю, даулы мэселелер туындаган жагдайларда колданылуы керек.

2    Терминдер мен аныктамалар

Осы стандартта теменде керсеЛ л гендер тенге сэйкестелген аньщтамалармен келеа терминдер колданылады:

2.1    Майсызданган, iuiiHapa майсызданган жэне майы алынбаган суттер курамындагы лактулоза мелшер1 (lactulose content of skimmed, partially skimmed or whole milk): Осы стандартта белпленген процедуралар бойынша аньщталган зат массасы

ЕСКЕРТПЕ Лактулоза кура мы сынаманыц 6ip литр1не миллиграмда керсетшедт

3    Эд1с мэш

Майлар мен протеиндер сут сынамасынан шыгарылады, эр! карай ол сузшедт Сузбедеп латулоза мелшер1 жогары эсерл1 суйьщтьщ хроматографиясын (будан эр! -Ж0СХ) эдюмен аньщталады. Сынама угшн алынган нэтиже, курамында лактулоза жок, майсыздандырылган суттен туратын белгш мелшерде лактулоза косу аркылы стандартты сынамага арналган нэтижелермен салыстырмалы турде багаланады.

4    Реактивтер

Егер баскаша келюшмеген болса «таза анализге арналган» бшкЛ реактивтерд1 гана жэне тазаланбаган немесебаламалы тазаланган су колданады

4.1    Лактулоза моногидраты

4.2    Лактулоза, тазалыгы 99 % кем емес.

4.3    Сынаманы алдын ала ендеуге арналган ертщр

Мырыш ацетат дигидратыныц 91,0 г, фосфорлы вольфрам кынщылыныц Zn(CH3C00)2^-2H20, 54,6 г, Нз[Р(\Уз0ю)4]'24Н20 жэне 58,1 мл музды (сусыз) cipKe кышкылын елшеуш! шыны сауытында 1000 мл суда ер1тед1 жэне белпге дешн сумей жетклзедг

Ресми басылым

к;р СТ ISO 11868-2013

4.4    Элюэнт

0,45 мкм (5.8 карау) диаметрл! мембранды сузбеден ЖЭСХ топтаты суды сузед1 жэне ертлген ауаны жою унпн колданар алдында кайнатады.

EpireH ауаны жою yniiH кайнатылган судьщ орнына, oipaefi нэтиже берет! н баска эдютер (мысалта, гелд1 барботаж) колданылуы мумкш.

ЕСКЕРТПЕ Одетте мундай одютср кымбат турады.

4.5    Стандартты улгшер

4.5.1    Лактулозаньщ стандартты epiTiнд1 ci

0,1 мг дешнп дэлд1л1кпен 75 мг лактулоза (4.2 карау) елшеп 100 мл (5.6 карау) елшеунп шыны сауытына елшеп салады. Суда ер1тед1 жэне белпге дешн сумей жетюзедт

4.5.2    Теменде керсетшген эд1с бойынша аньщталтанта сэйкес курамында лактулоза жок залалсыздандырылтан майсыздандырылтан сут.

Курамында залалсыздандырылтан майсыздандырылтан сутке лактулозаньщ стандартты ертщцсше (8.2 карау) сэйкес 5; 10; 15 жэне 20 мл косу аркылы алынган лактулозаны 1 литрге 250; 500; 750 жэнеЮОО мг шамасында залалсыздандырылтан майсыздандырылтан сутпен б1рдей сынаманы колданады.

5 Аспаптар мен материалдар

Осы эдют1 колдану уш1н келес1 зертханальщ аспаптарды колданады:

5.1    Арнайы I топты аналитикальщ таразы.

5.2    7 см диаметрл1 шыны куйгыш.

5.3    Сузпштер:

5.3.1    12,5 см диаметрл1 орташаусак теакил сузпш кагаз.

5.3.2    Teciri 0,45 мкм диаметрл1 целлюлоза-ацетатты мембраналар.

5.4    25 мл сыйымдыльщты елшеуш1 цилиндр.

5.5    0,1 мл белшд1амен 10 мл сыйымдылыгы бар градуирленген тамызгыш.

5.6    50 мл, 10 мл жэне 1000 мл сыйымдыльщты 6ip белпа бар елшеуш1 шыны сауыты.

5.7    5 мл, 10 мл жэне 20 мл сыйымдыльщты бш белпа бар тамызгыш.

5.8    TeciK диаметр! 0,45 мкм сузпшпен шыны сушпшп курылгы.

5.9    Тыгыны бар 20 мл сыйымдыльщты шыны сауыт.

5.10    Ультрадыбысты монша.

5.11    Сулы вакуумдьщ соргыш.

5.12    Теменде керсетшген ЖЭСХ курылгысы.

5.12.1    Анализ утшн колонка алдына берерге дешн 90 °С ± 2 °С элюент температурасын устап туруга арналган кыздыргыш пен магнитт! булгаушы.

5.12.2    Колонкадагы кысымыныц 1 % тускен (1,5 Мпа-ден 4 Мпа дешн) аз пульстаумен 0,3 мл/мин-тен 0,6 мл/мин дешн шыгын кеоемш берет! н соргыш.

5.12.3    НРХ-87 Р (Bio-Rad, 30 см х 0,78 см)¹^, немесе 8 % тшлу децгешмен полистирол-дивинилбензолды сополимерде корганыс-сульфатты катионитпен толтырылган колонка. Колонка алды Био - Рад^{1 J} (Н -катионитпен толтырылган 3 см х 0,46 см таспа жэне карбонат-анионитпен толтырылган 3 см х 0,46 см таспа) деозол жуйесшен немесе тшмд1 эквивалент жуйесшен турады.

к;р СТ ISO 11868-2013

Колонка алды кызмет ету кезенш улгайтады жэне аналитикальщ колонкаларды узартады, сонымен коса проблемаларды азайтады жэне белу кателштерш айтарльщтай темендетедг ЖЭСХ жуйеа орналастыруды жогалта бастаганда, кедерп непзп колонкага жеткенге дешн колданылган колонка алдын езгертедг

5.12.4    Термостатикальщ колонка пени температураны 75 °С ± 1 °С устаута кдбшетп.

Колонка алды пеш сыртында орнатылуы Tuic. Непзп колонкага тартылган пештеп

туп к 75 °С дешнп элюент температурасыньщ кысымы уш1н 10 см-ден 15 см дешнп узындьщта болуы керек, езгеше болган жагдайда айтарльщтай жалпы олкылыктар орын алуы мумкзн.

5.12.5    Бугшу децгешн керсетепн детектор суда елшенген бугшу керсетклш б1рл1ктер1н 5 х 10"⁹ кем шу децгешмен жогары сез1мтел болуы керек.

1шк1 термостат белпленген базальщ сызьщтарды алу уш1н кажетп белме температурасынан жогары белплену1 тшс. Кеп жагдайда 35 °С-ден 40 °С дешнп температура усынылады.

ЕСКЕРТПЕ Буплу керсеткшпнщ жогары сс лмтал мониторинг! жылу езгерштершщ салдарынан базальщ сызьщтар дрсй(|нмсн кедерп жасалады. Базальщ сызьщтар дрсйфш темендету yniiH температураныц езгеру!не жол бермеу максатында жайды конлиуионирлеуде ЖЭСХ курылысын колдануга кецес бср1лсд1.

5.12.6    Жогары шьщыньщ елшеуге арналган интегратор

Интеграцияньщ баскару параметрлер1 (мысалга, шьщ жалпактыгы, келбеу козгалуы, шьщньщ табалдырьщ келем1) мукият тандалуы ти1с.

Интегратор лактоза мен лактулоза шьщдарыньщ арасында перпендикулярды туИрепндей дэрежеде ретке келпршу1 ти1с. (Майсыздандыру cyrreri глюкозаньщ эр турл1 мелшерде болу салдарынан дэлаздшке алып келед1). Интегратор лактулозаньщ барльщ концентрациялары кез1нде темендеу базальщ сызыкка дешн жетсе, лактоза жэне лактулоза шьщдары арасында базальщ сызыкка шыгар кезде токтауы ти1с.

Кептеген интеграторлар автоматты турде сынак кез1нде интеграция шьщыньщ параметрле1рн езгертед1. Мумк1нд1пне карай, бул функция айтарльщтай колданыска жарамды нэтижелерд1 алу уш1н сену1 тшс.

ЕСКЕРТПЕ Аспап, елшеунп ьщыс, реактивтер, аналогияльщ метрологияльщ сиппаттагы немесе одан да жогарыларды колдануга руксат бершедг К°лданыстагы елшеуш! куралдар елшеу тутастыгын камтамасыз ету саласындагы зацнамамен сэйкес келуде Казакстан Республикасыныц реестрше енпзу жэне елшеу куралдарын тексеру, тишт бешту немесе метрологияльщ аттестация максатында сынактан етуге сэйкес келед!.

6    Сынаманы ipiKTey

Зерханага тшсп сынама ж1бер1лу1 тшс. Оган закым келмеу1 керек немесе сактау немесе жеткззу барасында кандайда 6ip езгер1ске ушырамауы керек.

7    Сыналатын сынаманы дайындау

Сынаманы 25 °С ± 5 °С дей1н жеткззед1 жэне мукият араластырады. Егер май б1ркелкз улеспр1лмесе, акырын 40 °С дей1н кыздырылады, тек аудару аркылы араластырады да, тез арада 20 °С ± 2 °С дей1н салкындатады.

¹¹ НРХ-87 Р (Bio-Rad, 30 см х 0,78 см) жэне Био - Рад деозолен жуйсЭ саудальщ турде кол жст1мд1 тшсп куралда колданылады. Акпарат осы стандартты колдану ыцгайлыгы ymiH кслт1р1лсд1 жэне ISO жэне IDF талаптары болып табылмайды.

3

к;р СТ ISO 11868-2013

Сынамаларды ipiicreyAi жузеге асыру осы стандартта керсетшмеген. Сынаманы ipiKTey бойынша усыныстар [1] керсетшген.

Сынаманы енщандай закым келпрмей жэне езгертппей сактайды.

8 Эдктеме

8.1    Жумыс белшш даярлау (сынама)

8.1.1    Сыналатын сынамадан 15 мл тупкшемен елшеп алу (7 бел1мд1 карау), 50 мл елшеуш1 шыны сауытына салу (5.6 карау). 0лшеуш1 цилиндрмен 20 мл су косу (5.4 карау) жэне nipiM жасау аркылы араластыру. Сынаманы алдын ала ендеп алу унйн 5,5 мл ертщйш (4.3 карау) градуирленген тупкгемен косу (5.5 карау) жэне араластыру. Белпле дешн су косу жэне араластыру.

8.1.2    1 сататка 25 °С ± 5 °С температурасында калдыру, суйзпш аркылы (5.3.1 немесе

5.3.2 карау) шыны куйтышты (5.2 карау) колданумен сузу. Бастапкы 5 мл сузбеш алып тастау керек. Сузбе калдьщтарын таза шыны сауытына жинау.

8.2    Курамалы сынамаларды дайындау

8.2.1    Жалпы ережелер

Курамында лактулоза жок майсыздантан суттен 15 мл тут1кшемен алу (4.5.2), оны 50 мл терт елшеунй сауытьщ эр кайсысына салу.

8.2.2    А курамалы ynrici

8.2.2.1    Лактулозасыз (8.2.1) курамында майсыздантан сут бар 50 мл 6ipiHini елшеуш1 сауытка лактулозаньщ стандартты ер1т1нд1с1н (4.5.1 карау) тупкшемен 5 мл елшеу жэне араластыру.

8.2.2.2    Олшеунй цилиндрмен 15 мл су косу (5.4 карау) жэне араластыру.

8.2.2.3    Градуирленген тупкшемен (5.5 карау) алдын ала ецделген сынама унйн (4.3 карау)5,5 мл ертщй косу жэне араластыру. Белпге дешн сумей жеткдзу жэне араластыру. 25 °С ± 5 °С температурада 1 сагаттай ертщйш устаганнан кешн сузпш аркылы (5.3.1 немесе 5.3.2 карау) шыны куйтыш кемепмен (5.2 карау) сузбеден отказу. Сузбе калдьщтарын таза шыны сауытка жинау.

8.2.3    В курамалы улпс1

Лактулозасыз (8.2.1) курамында майсызданган сут бар 50 мл екшнй елшеунй сауытка лактулозаньщ стандартты ертщцсш (4.5.1 карау) тупкшемен 10 мл елшеу жэне араластыру.

Олшеунй цилиндрмен 10 мл су косу (5.4 карау) жэне араластыру.

8.2.2.3    бойынша жалгастыру

8.2.4    С курамалы улпс1

Лактулозасыз (8.2.1) курамында майсызданган сут бар 50 мл унпннй елшеунй сауытка лактулозаньщ стандартты ертщйсш (4.5.1 карау) тупкшемен 15 мл елшеу жэне араластыру.

Олшеунй цилиндрмен 5 мл су косу (5.4 карау) жэне араластыру.

8.2.2.3    бойынша жалгастыру

8.2.5    D курамалы улп

Лактулозасыз (8.2.1) курамында майсызданган сут бар 50 мл терпннй елшеунй сауытка лактулозаньщ стандартты ертщйсш (4.5.1 карау) тупкшемен елшеу.

8.2.2.3. бойынша жалгастыру.

4

к;р СТ ISO 11868-2013

8.3 Хроматографиялык; аныктамалар

8.3.1    Сыналатын сынама сузшдш (8.1.2-ш карацыз) мен калибрленген улгшерд1 (8.2-ш караныз) 3 мл тамшуырмен елшеп, жеке шыны кутыга (5.9-ды караныз) салады. Кутыны су вакуум-соргыга беютт (5.11-д1 караныз), ультрадыбыстык су моншасында (5.10-ды караныз) белме температурасында 30 секунд бойы устап турады да, сузпден ершлген ауаны кепредк Kenipyre жол бершмейдт

ЕСКЕРТПЕ Сынамада ауаныц болуы лактулозаны устап туру уакытынан кешн Tepic шыцнныц пайыда болуына алып ксл\т мумшн.

8.3.2    0,3 мл/мин шыгындармен жумыс ютейтш ЖЭСХ аспабына (5.12 карау) 10 мклден 30 мклге дешн (дэл елшенген) сузбе енпзу.

Егер лактулоза курамы 200 мг/кг суттен аз болса, шыгынды 0,6 мл/мин дешн арттырумен косылган ею колонконы дэйекп турде колданумен анализ жасау кажет.

ЕСКЕРТПЕ Хроматограмма (А косымшасын карау) стандарт™ сынамалар жагдайында да (8.2.2, 8.2.3, 8.2.4 жэне 8.2.5 карау) жэне заласыздандырылтан сутте де 19 минут устау уакытымен лактозаныц куатты шэкшден аскан шыцын жэне 24 минут устау уакытындаты лактулозаныц минмалды шыцын керсетед1.

А стандарт улпа унпн 5 мм лактулоза шьщыньщ минималды бшктшн камтамасыз етет1н т1ркеуш1 курылгыны реттеу (плоттер) (8.2.2 карау). Колданыстагы колонка мен колонка алдыньщ сапасына байланысты (5.12.3 карау), лактулозаньщ дэл белетш немесе дэлс1з белет1н шьщын алу. Лактоза мен лактулоза арасындагы минималды кажетп шеш1мд1 аньщтау унпн, 50 млге 0,69 г лактоза (4.1 карау) жэне 3,75 мг лактулоза (4.2 карау) курамды стандарт™ ертнд1 дайындау керек.

Белу децгешн аньщтау, R_s, (1) формула бойынша (5 кем болмауы ти1с):

h₂

^RS =    (1)

I Lii

h2 - лактулоза шьщыньщ бшктш;

hy - лактоза жэне лактулоза шьщдары арасындагы аймак жалпактыгы.

Keneci сынамаларды арасына алты/он минутты аральщпен енпзу абзал.

8.3.3 Интегратор эр шьщньщ бшкппн т1ркейд1, hi жэне h-₂\ hi - бул лактоза шьщыньщ бшктш жэне h₂ - бул лактулоза шьщыньщ бшкпп.

Егер базальщ сызьщ дрейф1 тольщ шэюлд1н 10 % жогары болса сынама кайтадан енпз1лу1 тшс.

Мелшерл1к аньщтауга дей1н аспап жумысыньщ бузылуынан немесеанализ жасалып жаткан сынаманьщ шыгу теп мен табиги езгешел1ктер1 салдарынан кез келген ауыткуларды аньщтау уш1н хроматограмма турш аньщтау аса манызды.

Сыналып жаткан сынамадагы лактоза шьщыньщ бшктш курамалы улплермен салыстырганда 10 % кеб1рек ауыткумауы ти1с. 0згеше жагдайда баска курамалы сынамалар дайын болуы кажет.

Унем1 анализ кез1нде эр сыналып жаткан сынама топтамасында курамалы сынамалар болуы тшс.Эр 10-15 сынаманы кайталап курамалау.

8.4 1^алпына келпру

5

к;р СТ ISO 11868-2013

Кажеттшп туындаган жагдайда стандарттьщ процедураны тольщтыра отырып, калпына келт1руд1 журпзу. Егер сынама курамында лактулоза мелшер1 тен немесе 200 мг/л жогары болса, калпы на келт1ру 99 % кем, анализ кайтадан еткнзшу1 Tuic.

9 Нэтижедер керсетк1штер1 мен ece6i

9.1 Калибрлеу

Эр стандартны улпш енпзуден жэне ЖЭСХ аспабымен белуден кешн, интегратор келеа шьщдар бшкттпн т1ркеп отыруы тшс:

А стандартты улпсшщ лактулоза шьщы бшкттнщ сандьщ мэш - йг_а;

В стандартты улпсшщ лактулоза шьщы бшкттнщ сандьщ мэш - йгь;

С стандартты улпсшщ лактулоза шьщы бшкттнщ сандьщ мэш - йг_с;

D стандартты улпс1н1ц лактулоза шьщы бшкттнщ сандьщ мэш - йгd;

(2) - (5) формуласы бойынша 50 млге миллиграмда А, В, С жэне D стандарттарында лактулоза концентрациясын с_а-d есептеу (8.2 карау):

са = mL Х 5/100,	(2)
съ = mL х 10/100,	(3)
сс = mL х 15/100,	(4)
cd = mL х 20/100,	(5)

ть - стандартты ер1т1нд1деп лактулоза массасы (4.5.1 карау).

h2a ~ С_а„ h₂b ~ съ, h_2c - с_с жэне h₂d - Cd,\ С а, Съ, С_с жэне с А жуптарына арналган ен аз квадраттар эд1стер1 бойынша регрессиясыньщ сьщызты регрессияльщ анализ! - теменде керсет1лген (6) формуладатэуелаз ауыспалы а жэне b регрессия коэффициенттер1 н бередг

h₂ = а + Ъ х c_L    (6)

h₂ - регрессияда тэуелд1 ауыспалы болып табылатын лактулоза шьщы би1кт1пн1ц сандьщ мэш;

cl - регрессияда тэуелс1з ауыспалы болып табылатын 50 млге миллиграмда лактулоз концентрациясыньщ сандьщ мэш.

9.2 Лактулоза мелшерш есептеу

Сут курамындагы литрде миллиграммен керсет1лген лактулоза мелшерш есептеу мщ, сыналатын сынамада келес1 формула пайдаланылады (7):

где h_2s - сыналатын сынаманьщ лактулоза шьщыньщ би1кт1пн сандьщ мэн1;

V_s - миллиметрде сыналатын сынама келемшщ сандьщ мэш (8.1.1 карау); d - литрге миллиграммды керсетк1ш алу угшн араластыру коэффициент!Hi н сандьщ мэш (d= 10³).

6

к;р СТ ISO 11868-2013

10    Нактылык

10.1    Зертхана аралык сынактар

Зертхана аральщ сынактар эдютщ нактылыгымен В косымшасы мен [4] керсетшген. Зертхана аральщ сынактардан алынган мэндер келт1ршгендерден баска, концентрация жэне матрица epicme колданылуы мумкш емес.

10.2    1^айталану (Жинактылык)

Крыска мерз1м 1шшде б1рдей курылгыларды кол даны, 6ip оператор, 6ip зертханада, 6ip эдют1 колдана отырып б1рдей сынамалардан алынган ею тэуелаз уксас нэтижелер арасындагы абсолютах айырмашыльщ 5 % жагдайдан, 47,6 мг/л жогары болмауы Tuic.

10.3    Жацгырту

Эр турл1 зертханалрда эр турл1 операторлармен эр турл1 куралдарды пайдалана отырып б1рдей сынамада б1рдей эдюю колданудан алынган сынак нэтижелершщ езара б1ркелкш п арасындагы абсолютах айырмашыльщ 5 % жагдайдан, 47,6 мг/л жогары болмауы тшс.

11    Сынак хаттамасы

Сынак хаттамасы келесшерд1 белплеу1 тшс:

a) сынаманы тольщ идентификациялау ушш кажета барльщ акпарат;

b)    сынаманы ipixTeyaeri колданылатын эдю;

c)    рсы стандартка сштеме жасай отырып сынак эдюш пайдалану;

d)    сынактыц нэтижесше эсер eTyi мумкш кез келген ркиганы нактыльщтарымен 6ipre, осы стандаррта бейнеленбеген немесе косымша болып табылатынбарльщ кызметак нактыльщтар;

e)    сынактан алынган нэтиже.

7