Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерении концентрации Komagataella (Pichia)pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 в воздухе рабочей зоны
Методические указании МУК 4.2.3567—19
Издание официальное
Федеральная служба по надзору в сфере зашиты нрав потребителей и благополучия человека
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения концентрации Konwgataellu (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 в воздухе рабочей зоны
Методические указания МУК 4.2.3567—19
ББК 51.24я8 М54
М54 Метод микробиологического измерения концентрации Komagatae/la (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 в воздухе рабочеП зоны: Методические указания.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2020.—8 с.
ISBN 978-5-7508-1720-7
1. Ратработаны и подготовлены ФГБОУ ВО РИММУ им. II.И. Пирогова Минирава России (д.б.н. И. И. Шеина).
2. У гвсржлены 1*\ ководителем Федеральной службы но над юру в сфере танины прав погребите.чей и благополучия человека. Главным госу дарственным санитарным врачом Российской Федерации А. К). Ионовой 24 октября 2019 г.
3. Введены впервые.
Ы>К* 51.24я8
Ко.мнькнерная верстка Г. В. Ломановой Подписано в печать 28.01.20
Тираж 100 >кт.
Федеральная служба по нал юру в сфере ташнты прав 1К>требитслей и благополучия человека 127994. Москва. Ва «конским пер . д. 18. cip 5. 7
Орш инал-максI полю1ов.1ен к печати и тиражирован Федеральным центром i ж иены и тпилеммолотии Росногребмалтора 117105. Москва. Варшавское ш . I9A Рслнпания печатных тланий. тел /факс: 8 (495)633-86-59
С Росно фебнал шр, 2020
УТВЕРЖДАЮ I*)'ко вол июль Федеральной службы по нал юру в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
А. Ю. Попова
24 октября 2019 г.
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метол микробиологического измерения концентрации Komugataellu (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 в воздухе рабочей зоны
Методические указания МУК 4.2.3567—19 1 2
Штамм растет также на агаризованных средах - глюкозо-пептон-дрожжевом агаре (YPD). глицерин-ncm он-дрожжевом агаре (YPG), мя-сопегггонном агаре (МПЛ). ЛГВ среде, картофельный агаре (КА).
При росте на агартованной среде образуются гладкие, округлые колонии с матовой поверхностью светло-бежевого цвета, край ровный. При росте в жидкой среде клетки образуют ровную интенсивную муть, пристеночных пленок не образуют, наблюдается белый осадок, коагуляция отсутствует.
На среде YPD штамм образует клетки округлой, слегка овальной формы размером 3—4 мкм, клетки почкуются, почкование многостороннее, истинного мицелия не образуют.
Штамм Komaf>ataella (Pichia) pastor is депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером БРЦ ВКПМ Y-4394.
Штамм Komagalaella (Pichia) pastor is БРЦ ВКПМ Y-4394 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека согласно классификации микроорганизмов, приведенных в санитарных правилах1. Работа со штаммом Koma^atac/la (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 не требует специальных мер предосторожности.
Предельно допустимая концентрация (IIДК) Koniagatuella (Pichia) pastoris в воздухе рабочей зоны установлена в гигиенических нормативах'.
III. Пределы измерений
3.1. Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50 ООО клеток в 1 м’ воздуха при доверительной вероятности 0,95.
IV. Методы измерений
4.1. Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны клеток псевдомниелия и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы, указанные в табл.1. 3 4
|
Таблица 1
Средства итмеренин |
|
Наименование средств измерения |
11азвапия доку мен тов (ГОСТ, fy> |
|
Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5—790 мм рт. с г. и с пределом допустимой погрешности ± 2.5 мм рт. ст. |
ГУ 2504-1799 |
|
Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г. предел допустимой по-1 решности ± 0,2 mi |
ГОС Г Р 53228 |
|
Колбы мерные 2-100-2. 2-250-2. 2-IOOO-2 |
ГОС Г 1770 |
|
IliiiieiKii градуированные 2-io класса точности вместимостью 1.6. j.0, 5.0. 10 см3 |
юс:1 29227 |
|
Цилиндры мерные 2-ю класса точности вмест имостью 25 и 50 см5 |
ГОСТ 1770 |
|
Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0—55 °С |
ТУ 25-2021.003 |
|
Прибор для микробиологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кроюва)
Импакгор ноздуча микроб иол oi ический «Флора-100» |
ГУ 64-12791—77 ГУ 64-098-33—95 |
|
|
Примечание Допускаемся использование средств измерения с аналогич
ными или лучшими характеристиками. |
|
Таблица 2
Bciiomoi aie.ibiibie устройства и материалы |
|
Наименование аппаратуры и материалов |
Названия документов (ГОСТ, ГУ) |
|
1 |
2 |
|
Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий по;иерживать температуру (160± 5)°С |
I У 9452-010-00141798 |
|
Гермостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (28 ± 2) °С и (37 ± 2) °С |
ГУ 9452-002-00141798 |
|
Автоклав тлектрический |
ГОСТ 9586 |
|
С терилизаторы паровые медицинские |
гос: Г Pill 13060; ГОСТ Р 51935 |
|
Дистиллят ор |
ГУ 4952-007-33142130 |
|
Облучатель бактерицидный настенный |
| у 9444-015-03965956 |
|
Холодильник бытовой |
ГОСТ 26678 |
|
Микроскоп биологический с иммерсионной системой тина Виолам |
ГОСТ 28489 90 |
|
Лупа с увеличением х К) |
ГОСТ 25706 |
|
11робиркн типов III. 112 |
ГОСТ 25336 |
|
Спиртовки лабораторные стеклянные |
ГОСТ 23932 |
|
Чашки биологические (Петри) или одноразовые ит полимерных материалов |
ГОСТ 23932 |
|
|
Продолжение табл. 2 |
|
1 |
2 |
|
Воронки конусные лиамсгром 40—45 мм |
ГОС Г 25336 |
|
1 ру ша резиновая |
ГУ 9398-005-0576 |
|
1 lei ля бакзериоло! ическая |
|
|
Марля медицинская |
ГОСТ 9412 |
|
Вата медицинская i ш роскопичсская |
ГОС Г 25556 |
|
Бумага фильтровальная лабораторная |
ГОСТ 12026 |
|
|
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. |
|
Таблица 3
Реактивы и ниппельные среды |
|
Наименование реактивов и питательных сред |
1 кивания докхментов (К К-Г) |
|
Агар микробиологический |
ГОСТ 17206 |
|
Вола дистиллированная |
1 ОСТ 6709 |
|
Глюкоза |
ГОСТ 6038 |
|
1 lemon сухой ферментативный |
ГОСТ 13805 |
|
Спирт этиловый технический |
ГОСТ 17299 |
|
('пир| л иловый ректификованный |
ГОСТ 1» 51652: ГОСТ 18300 |
|
Дрожжевой экстракт, сухой |
ГОСТ 17206-84 |
|
|
Примечание. Допускается использование других питательных сред и ди-ai ноаичсских препаратов с ana.ioi ичными характерно иками. |
VI. Требования безопасности
6.1. Измерение концентрации клеток гриба в воздухе рабочей зоны осуществляется в соответствии с санитарными правилами'. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005. Элекгробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019 и инструкции но эксплуатации прибора.
6.2. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
VII. Требования к квалификации операторов
7.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим пли средним профессиональным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
СП I 3.2322—ОХ «Безопасность работы с микроорганизмами III—IV ipynn uaroiсиности (опасное! и) и шлбу ли гелями пира пиарных болезней».
VIII. Ус.ювия измерений
8.1. Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
- температу ра воздуха (20 ± 5) °С;
- атмосферное давление 760 ± 20 мм рт. ст.;
- влажность воздуха не более 80 °'о.
IX. Приготовление глюкозо-пеитон-лрожжевого агара (YPD)
9.1. Для приготовления глюкозо-пептон-дрожжевого агара используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1 ООО см ’): пептон - 10,0 г. глюкоза 10.0 г, дрожжевой экстракт 10,0 г. агар-агар -15.0 г, дистиллированная вода - I 000 см5.
Сухие компоненты растворяют в 1 000 см’ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.
Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250— 500 см' и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.
Г отовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С не более 10 дней.
X. Проведение измерении
Отбор проб воздуха
10.1. Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005 и ГОСТ Р 8.563.
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемою воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную н внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с Инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
Выполнение типи ш
10.2. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду (YPD) расплавляют, остужают до 50—60 °С и разливают в чашки 11етри.
Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методическими указаниями*. Для этого чашки с застывшей средой помещают в
термостат при температуре 37 °С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2—8)°С не более 10 дней.
После отбора проб воздуха чашки Петри помешают в термостат с температурой (28±2)°С. Через 1—3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии методическими указаниями . Для этого эталонный музейный штамм Komugataellu (Pichia) pastoris БРЦ BKI1M Y-4394 высевается на 2—3 чашки используемой среды.
Лиофнлизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
XI. Вычисление результатов измерения
11.1. Расчет концентрации клеток производят по формуле:
К = (// х 1000) / С * /', кл м\ где
К- концентрация штамма в воздухе, кл/м ';
II - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 - коэффициент пересчета на 1 м' воздуха;
- скорость аспирации возду ха, л/мин;
7 - время аспирации, мин.
XII. Оформление результатов измерений
12.1. По окончании измерения и расчета концентрации клеток микроорганизма в воздухе должен быть составлен протокол (отчет), в котором представлена необходимая информация:
-о месте отбора пробы (название и адрес организации, производство. технологическая стадия, точка отбора пробы)
-о марке пробоотборника, который использовался исследователями. питательной среде и времени инкубации
-о лицах, производивших отбор проб воздуха, идентификацию штамма и расчет концентрации штамма.
Основные качественные и количественные параметры измерения представляются в виде табл. 4.
Таблица 4
|
Основные качес!венные и количес! венные параметры измерении |
|
Лата про-нелепия |
пробы |
Характеристика выросших колоний (количество ТИПИЧНЫХ колоний) |
Копнет рация. кл/м3 |
Соотношение с величиной 11ДК |
|
|
|
|
|
|
|
|
МУК 4.22316-08 ««Метлы контроля бактериологических iiiiiaic.iMiMx ере л» |
1
Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Koruagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50 ООО клеток в 1 м’ воздуха.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль микробиологического загрязнения воздушной среды, а также санитарных лабораторий биотехнологических предприятии, микробиологических лабораторий, научно-исследовательских организаций, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на проведение микробиологических исследований.
1.3. МУК носят рекомендательный характер.
2
Биологическая характеристика штамма КопшцШаеНа (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 и его гигиенический норматив в воздухе рабочей зоны
2.1. Штамм Komagalaellu (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394. включающий рекомбинантный фрагмент ДНК. предполагается использовать в промышленном производстве фермента ксиланазы для кормовых целей.
Мезофил. Хороший рост штамма наблюдается через 24 часа при 25—28 °С на глюкозо-пептонном агаре (ГПА).
3
' СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроор1анигмачи III—IV ipynii патогенности (опасности) и возбудителями мара гитарных оологией».
4
ГН 2.2.6.3538—18 ««Предельно допустимые коние1прамии (НДК) микрооргаингмов-прод\ пептон. бактериальных препаратов и их компонентов в воздухе рабочей гоны».
5
1 Пу мм 7.1.1 МУК422316- 08«Мею iw контроля оамерноло! ичсских мигательных срсл».
