Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указании МУК 4.2.3436—17

Издание официальное

Москва • 2017

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации Puenibacillus mucHaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания МУК 4.2.3436—17

МУК 4.2.3436—17

Протокол №_

количественного микробиологического анализа штамма Paenibacillus mucihginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 в атмосферном воздухе населенных мест

1.    Дата проведения анализа _

2.    Рабочее место (профессия работающего)_

3.    Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы)_

4.    Вид пробоотборника_

5.    Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб_

6.    Питательная среда, время инкубации_

7.    Результаты испытания ростовых свойств питательной среды _

8.    Количественная и качественней! характеристика выросших колоний (количество

типичных колоний)_

9.    Результаты идентификации микроорганизмов Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906

ВКПМ В-12259 (микроморфологичсские признаки)_

10.    Результаты расчета концентрации штамма_

11.    Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК_Л, _

12.    Отбор пробы проведен (Ф. И. О., должность, дата, подпись)_

13. Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф. И. О., должность, дата, подпись)_

Микробиологическое измерение концентрации Paenibacillus mucUaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания МУК 4.2.3436—17

Ответственный за выпуск Н. В. Карташева

Редактор Л. С. Кучурова Компьютерная верстка Е. В. Ломановой

Подписано в печать 09.10.17 Формат 60x84/16    Печ.    л.    0,75

Тираж 125 экз.    Заказ

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека 127994. Москва. Вадковский пер., д. 18. сгр. 5,7

Оригинал-макет подготовлен к печал! и тиражирован отделением юдательского обеспечения отдела научно-методического обеспечения Федерального центра гигиены н эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва. Варшавское ш.. 19а Реализация печатных изданий, тел./факс: 8 (495) 952-50-89

ББК 51.21 М59

М59 Микробиологическое измерение концентрации Paeniba-cil/us mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 в атмосферном воздухе населенных мест: Методические указания.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2017.—10 с.

1.    Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Минздрава России (Н. И. Шеина).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. IO. Поповой 22 февраля 2017 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.21

1*1 Роспотребнадзор, 2017

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

22 февраля 2017 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания _МУК    4.2.3436—17_

1. Общие положения и область применения

1.1.    Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м ³ воздуха.

1.2.    Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Биологическая характеристика штамма Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 и его гигиенический норматив в атмосферном воздухе населенных мест

Штамм Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 выделен из окультуренных почв методом многоступенчатой аналитической селекции, не является генетически модифицированным штаммом. Предполагается использовать для производства бактериальных удобрений, а также для профилактики и лечения грибковых заболеваний в растениеводстве. Производственная активность штамма не менее 1,2 х 10⁸ кл/мл.

Таксономическое положение штамма Царство    Bacteria

Подцарство    Firmicutes

Класс    Bacilli

Порядок    Bacillales

Семейство    Paenibacillaceae

Род    Paenibacillus (Ash et al. 1994)

Вид    mucilaginosus

Штамм    Pm 2906

Paenibacillus (лат.) - род аэробных грамположительных спорообразующих палочковидных бактерий. Ранее представители этого рода входили в рРНК третью группу рода Bacillus, в 1993 году Эш, Прист и Коллинс предложили вывести представителей группы 3 в отдельный род Paenibacillus. Название рода произошло от латинского слова «раепе» («почти») - в названии рода отражено сходство с родом Bacillus (название рода можно буквально перевести как «почти бациллы»).

Род представлен палочковидными бактериями, образующими термоустойчивые эндоспоры. Некоторые виды подвижны и имеют жгутики. Большинство представителей - мезофилы, есть термофильные представители. Представители рода обитают в почве, ризосфере растений, есть эндофитные представители, колонизирующие ткани растений. Многие представители продуцируют антимикробиальные вещества, проявляющие бактерицидное и фунгицидное действие.

Штамм Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками: на среде Эшби наблюдаются слизистые, прозрачные, бесцветные или светло-серые колонии, выпуклые или слегка приплюснутые, блестящие с ровными краями.

Микроскопически различаются неподвижные крупные палочковидные клетки правильной формы с округлыми краями, располагаются одиночно или парами, окруженные слизистой оболочкой, образуют эндоспоры.

Для культивирования используется агаризованная среда Эшби, оптимальная температура (30 ± 2) °С.

Физиолого-биохимические признаки: в качестве углерода усваивает глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, гидролизует крахмал. В качестве источника азота может быть использован аммонийный азот, карбамид, нитраты. Штамм обладает способностью растворять нерастворимые или малорастворимые соединения фосфора и калия (трикалышй-фосфат, силикаты).

Штамм Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 не является зоо- и фитопатогенным, не относится к микроорганизмам, патогенным для чело-

века (СП 1.3.2322—08), депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-12259.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 5 ООО кл/м³.

3.    Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества штамма в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50 ООО клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4.    Методы измерений

Прямой метод основан на аспирации из атмосферного воздуха населенных мест бактерий на агаризованную среду Эшби и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

5.1. Средства измерений

Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5—790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности ± 2,5 мм рт. ст.

Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ± 0,2 мг Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0,2,0, 5,0, 10 см³ Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см³

Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0—55 °С

Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 ± 5) °С Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (30 ± 2) °С и (37 ± 2) °С Автоклав электрический Стерилизаторы паровые медицинские

Дистиллятор

Облучатель бактерицидный настенный Холодильник бытовой

Микроскоп биологический с иммерсионной системой

Лупа с увеличением х10 Пробирки типов П1, П2 Спиртовки лабораторные стеклянные Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов Воронки конусные диаметром 40—45 мм Груша резиновая Петля бактериологическая Марля медицинская Вата медицинская гигроскопическая Бумага фильтровальная лабораторная

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды

Агар микробиологический Вода дистиллированная Глюкоза

Калий сернокислый, хч

Калий фосфорнокислый двузамещенный, хч

Кальций углекислый, хч

Магний сернокислый, хч

Маннит

Натрий хлористый, хч

Сахароза    ГОСТ 5833-75

Спирт этиловый технический    ГОСТ 17299-78

Спирт этиловый ректификованный    ГОСТ Р 51652-2000 или

ГОСТ 18300-87

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации штамма в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают требования, изложенные в следующих документах.

6.1.    Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней: СП 1.3.2322—08.

6.2.    Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322—08: СП 1.3.2518—09.

6.3.    Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4.    Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку' к анализу проводят в следующих условиях:

-    температура воздуха (20 ± 5) °С;

-    атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;

-    влажность воздуха    не    более    80    %.

9. Приготовление питательных сред

Для приготовления агарнзованной среды Эшби используют компоненты следующего состава: маннит, сахароза или глюкоза - 20,0 г, калий сернокислый - 0,2 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,2 г, кальций углекислый - 5,0 г, магний сернокислый - 0,2 г, натрий хлористый - 0,2 г, агар-агар - 15,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1 000 см³ дистиллированной воды, перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250— 500 см³ и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней, не более.

10. Проведение измерения

10.1. Отбор проб eosdyxa

Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563—96 «Методики выполнения измерений».

Д1Я этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависят от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96%-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенки крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную авизованную среду Эшби расплавляют, остужают до 50—60 °С и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК

4.2.2316— Ю8. Для этого чашки с застывшей средой помешают в термостат при температуре 37 °С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре 2—8 °С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (30 ± 2) °С. Через 1—2 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК

4.2.2316— 08. Для этого эталонный музейный штамм Paenibacillus muci-laginostis Pni 2906 ВКПМ В-12259 высевается на 2—3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2—3 пассажа во избежание потери заданных ей ростовых свойств.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток проводят по формуле:

„ Я-1000

А. =-----

ст

К - концентрация Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 в воздухе, кл/м³;

Я - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1 000 - коэффициент перерасчета на 1 м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т- время аспирации, мин.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по следующей форме.