Мук 4.2.2788-10 для МУК 4.2.1955-05
Метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа

Федеральная служба по напору в сфере защиты нрав погребите, н б. iai оно. iyчин че. ювека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа

Дополнение 1 к МУК 4.2.1955—05 «Метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа»

Методические указания МУК 4.2.2788—10

ББК 51.23 М54

М54 Метод выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах на основе гибрид изацио иного ДНК-РНК анализа: Методические указания. —М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2011.—12 с.

1.    Разработаны ГУ Научно-исследовательским институтом питания РАМН (С. Л. Шевелева. Н. Р. Ефимочкина, И. Б. Быкова. И. М. Нитяга);

ГУ Научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМИ (В. Г. Нестеренко); при участии фирмы (XX) «Ниармедик плюс» (Т. Б. Макарова. Д. Л.Хрульков, В. В. Милитицкий.

А. Б. Швецов).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 № 2).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потреби телей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 6 декабря 2010 г.

4.    Введены в действие с момента утверждения.

5.    Введены впервые.

ББК 51.23

Редактор Н. В. Кожока Технический редактор Е. В. Ломанова

Подписано в печать 01.02.11 Формат 60x88/16    Псч.    л. 0,75

Тираж 200 экз.    Заказ    20

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18, стр. 5, 7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105. Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, тел. факс 952-50-89

© Роспотребнадзор, 2011 < Федеральный центр пн иены и эпидемиологии Роспо требнадзора, 2011

Порядок заполнения пробирок промывочным буфером:

Первую и третью промывки начинают с первой пробирки, вторую и четвертую промывки - с последней пробирки.

После четвертой промывки содержимое пробирок энергично сливают в раковину, переворачивают штатив с пробирками и помещают на фильтровальную бумагу, слегка встряхивая до тех пор. пока пробирки нс осушатся (4—5 раз), и оставляют их в перевернутом состоянии на несколько секунд.

11.5.8.3.    Во все пробирки вносят раствор конъюгата по 100 мкл. Покрывают пробирки новой уплотняющей защитной пленкой и сильно встряхивают штатив. Инкубируют в водяной бане при (37 ± 1) °С в течение 15 мин. Штатив вынимают из водяной бани, удаляют защитную пленку и быстро выливают содержимое всех пробирок одновременно, нс вынимая их из штатива.

11.5.8.4.    Пробирки промывают 4 раза, выдерживая каждый раз нс менее 30 с (для этого быстро опустошают пробирки и затем полностью заполняют их промывочным буфером). Следует обратить внимание на то. что. промывая пробирки в четвертый раз. буфер необходимо вносить медленно. нс дотекая образования пены, а после его удаления на стенках пробирок не должно оставаться пены от промывочного буфера (пробирки должны быть абсолютно прозрачными).

По окончании промывки пробирки помещают на фильтровальную бумагу и оставляют в перевернутом состоянии несколько секунд, пока они полностью нс осушатся.

11.5.8.5.    Во все пробирки вносят раствор субстрата по 100 мкл. и осторожно встряхивают. Инкубируют в темноте при температу ре нс выше 20 °С в течение 15 мин. Для внесения раствора субстрата следует пользоваться отдельной пипеткой для предотвращения его контаминации.

11.5.9. Измеряют уровень хемилюминесценции в каждой пробирке на люминометре «Люмлайт» или «Люмлайт мини» с интеграционным временем 5 с в соответствии с инструкцией к прибору.

Перед измерением каждую пробирку осторожно протирают для удаления капель жидкости. Следует обратить внимание, что во время измерения хемилюминесценции в пробирочном люминометре прибор не должен находиться под прямым источником света.

Примечания.

•    Стадия гибридизации должна начинаться нс позднее 45 мин после стадии лизиса.

•    Качество гибридизации и фиксации конъюгата зависят от времени и температуры инкубации, которые необходимо строго соблюдать.

• Низкий уровень pH (<5) в обогатительном бульоне после внесения высококислотных продуктов (фруктовые соки, кисло-молочные продукты и др.) может приводить к ложноотрицательным результатам; необходимо нейтрализовать пробы (раздел 5).

11.5.10.    Учет результатов.

Результат прямого измерения хемилюминесценции в пробах выражают в относительных люминесцирующих единицах в секунду (ОЛЕ/с).

Определение пороговой величины измерения:

пороговая величина (отсекающее значение) определяется как уровень хемилюминесценции пробы с отрицательным контролем (ОК). умноженный на коэффициент 3 («Cut-off» фактор).

11.5.10.1. Интерпретация полученных результатов: результат измерения считается положительным, если уровень хемилюминесценции в исследуемой пробе превышает уровень пороговой величины измерения (отсекающего значения).

Результат измерения считается отрицательным, если уровень хемилюминесценции в исследуемой пробе ниже или равен уровню пороговой величины измерения (отсекающего значения).

11.5.11.    Результаты выявления Listeria monocytogenes в определенной навеске продукта записывают: «бактерии Listeria monocytogenes обнаружены в 25 г (см³) (в 50—100 г (см³) для продуктов детского, лечебного и специализированного питания) продукта» или «бактерии Listeria monocytogenes не обнаружены в 25 г (см³) (в 50—100 г (см³) для продуктов детского, лечебного и специализированного питания) продукта».

11.5.12.    Резу льтаты оценивают по каждой пробе отдельно.

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзор) в с(|>ере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный гос> дарственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

6 декабря 2010 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах на основе гибридтационного ДНК-РНК анализа

Дополнение 1 к МУК 4.2.1955—05 «Метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes на основе гибрнднзационного ДНК-РНК анализа»

Методические указания МУК 4.2.2788—10

Внести дополнения в МУК 4.2.1955—05:

1. Раздел 2. «Общие положения и область применения» дополнить пунктами 2.7 и 2.8 следующего содержания:

2.7.    Настоящие методические указания устанавливают также метод ускоренного выявления бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах на основе твердофазного гетерогенного гибриднзаци-онного ДНК-РНК анализа с хемилюминесцентным детектированием. Метод может применяться в качестве дополнительного к классическим бактериологическим методам лабораторных исследований для целей выявления бактерий Listeria monocytogenes при контроле пищевых продуктов.

2.8.    Метод ускоренного выявления бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах предусматривает определение наличия

или отсутствия указанных микроорганизмов в определенной массе (объеме) продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078—2001 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе.

2.    Раздел 3. «Сущность метода» дополнить пунктами 3.6, 3.7 и 3.8 следующего содержания:

3.6.    Метод выявления бактерий Listeria monocytogenes предусматривает высев определенных количеств исследуемых образцов молока и молочных продуктов в специальную селективную питательную среду, инкубирование посевов для накопления микроорганизмов, обработку культуральной жидкости лизирующим буфером, денатурацию бактериальной рибосомальной РНК. гибридизацию фрагментов денатурированной рРНК с комплементарным ей меченым зондом, входящим в набор «Люмипроб-24 Listeria monocy togenes», хемилюминесцентным детектированием продуктов реакции.

3.7.    При обнаружении положительных результатов присутствие бактерий Listeria monocytogenes должно подтверждаться в соответствии с методами ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes» или МУК 4.2.1122— 02 «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах».

3.8.    Мишенью в реакции ДНК-РНК гибридизации для Listeria monocytogenes является последовательность ДНК. кодирующая токсический белок листериолизин-0 - основной фактор патогенности Listeria monocytogenes.

3.    Раздел 10. «Нормативные ссылки» дополнить пунктом 10.19 следующего содержания:

10.19. МУК 4.2.1955—05 «Метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes на основе гибридизацион-ного ДНК-РНК анализа».

4.    Методические указания дополнить разделом 11 с названием «Проведение анализа но обнаружению бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах» следующего содержания:

11. Проведение анализа по обнаружению бактерии Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах

11.1. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды

11.1.1. Аппаратура и инструментарии

Анализатор потенциометрический, погрешность

измерений pH ± 0,01    ГОСТ 19881-74

Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П

или других марок, позволяющий поддерживать

температуру (160 ± 5) °С    ТУ 64-1 -28-70—76

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую

температуру 37 °С с отклонением от заданной

±1°С '    ТУ 64-1-1382—83

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 41,5 °С с отклонением от заданной ±1°С ’    ТУ 64-1-1382—83

Баня водяная с подогревом (37 ± 1) °С Баня водяная с терморегу лятором, позволяющая поддерживать температуру от 0 до 100 °С Весы лабораторные общего назначения. 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г

Микроскоп биологический МБИ-1. МБИ-2. МБИ-3. МБР-1. МБР-3. МБС Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72 Гомогенизатор перистальтического типа «Микс-2». «Стомайкер» или других наименований AES Lab.. Cat. N AESAP 1066 Гомогенизатор типа «вортскс»

Штатив дзя 12 мм пробирок с держателем Europrobc. Cat. N Р08363086 Микропипетки на 100—1 000 мкл BIOHIT.

Cat. N 725070 или «Ленпипет»

Мультистеппер BIOHIT. Cat. N 730101 Диспенсер BIOHIT. Cat. N 723046 Распределительная емкость - объем 1.0—2.5 л BIOHIT

Люминометр хтя пробирок «Люмлайт» или «Люмлайт мини» Europrobc. Cat. N EBLL01 Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов

Холодильник бытовой электрический Пинцет медицинский Ножницы медицинские Скальпель хирургический, 15 см Часы механические сигнальные Электроплитка

Аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках (или другая аппаратура хтя встряхивания)

П.1.2. Лабораторная посуда и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная Марля медицинская

Колбы плоскодонные конические или круглые

ратной вместимости

Воронки стеклянные

Вата медицинская гигроскопическая

Пипетки вместимостью 1. 2. 5 и 10 см³

Пробирки типов П1. П2

Стекла предметные для микропрепаратов

Спиртовки лабораторные стеклянные

Термометр ртутный с диапазоном измерения от

0 до 100 °С (цена деления шкалы 1 °С)

Чашки биологические (Петри) или одноразовые

из полимерных материалов

Пакеты стерильные для гомогенизатора AES

Lab.. Cat. N AES400/50G

Отраслевой стандарт хтя визуальной оценки

мутности № 10 ГИСК им. Л. А. Тарасовича.

М3 РФ

Денситометр для бактериальных суспензий типа «Dcnsi-La-Meter» или «Денсимат». ф. «Лахема». «BioMcricax»

Стандарт Макфарланда №№ 1.2.3 ф. «BioMerieux» Петля бактериологическая, калиброванная на 1 мкл AES Lab.. Cat. N AESDI100

11.1.3. Реактивы и питательные среды

Broth RM L «Europrobe». (Ref. ЕВ 2157.

ЕВ 21502. ЕВ 21504)

Тест-система «Lumiprobe 24 Listeria monocytogenes» «ЕигоргоЬс». (Ref. 11055)

Тест-штамм Listeria monocytogenes. типичный по культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам. ГИСК им. Л. А. Тарасевнча

11.1.4. Набор для проведения твердофазного гибридизационного ДНК-РНК анализа

Набор «Lumiprobe 24 Listeria monocytogenes» на 50 тестов в составе:

пробирки с фиксированным на них зондом (5 пакетов х 10 пробирок) лизирующий буфер (1 флакон х 5 мл) гибридизационный буфер (1 флакон х 12 мл) 20-кратный промывочный буфер (4 флакона х 30 мл) конъюгат (1 флакон х 5 мл) субстрат (1 флакон х 5 мл) защитная пленка (6 шт.)

Примечание. Допускается использование других питательных сред, реактивов, диагностических препаратов, аппаратуры и инструментария с аналогич-нмми характеристиками, прошедших регистрацию в Российской Федерации в установленном порядке, после процедуры их стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа. Питательные среды и биологические препараты отечественного и зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по нормативной документации. утвержденной в установленном порядке.

11.2. Подготовка к анализу

11.2.1. Приготовление растворов и реактивов

1.    Изотонический (0.85 %-й водный) раствор хлорида натрия (ГОСТ 26669-85).

2.    Стерильный фосфатный буфер с pH 7.210.1 КН₂РО., - 0.45 г. Na₂HPO., - 5.34 г в 1 000 см³ дистиллированной Н₂0. стерилизовать при температуре 121 °С в течение 30 мин.

П.2.2. Приготовление питательных сред

Приготовление среды RM L Broth: навеску 52 г растворяют в 1 ООО см³ дистиллированной воды, осторожно перемешивают до растворения (при необходимости немного подогревают), устанавливают pH 7.2 ±0.2 при 25 °С и автоклавируют при 115 °С в течение 15 мин. Простс-рилиюванную горячую среду (70—80) °С быстро охлаждают до температуры 10—12 °С в холодной воде. Готовую среду хранят при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней.

11.3. Подготовка к проведению твердофазного гибриди рационного ДНК-PH К анализа

11.3.1.    Все реагенты наборов перед использованием необходимо прогреть при комнатной температуре в течение 30 мин. перед использованием содержимое флаконов необходимо аккуратно перемешать легким переворачиванием флакона. Пробирки с сенсибилизированными олиго нуклеотидными ДНК-зондами извлекают из упаковки в количестве. соответствующем общему числу исследуемых и контрольных проб.

11.3.2.    Перед началом работы необходимо проверить индикаторы уровня влажности: индикаторная полоска на пакетах с сорбентом должна иметь синий цвет, при высокой влажности она приобретает розовую окраску, что говорит о непригодности к использованию пробирок, находящихся в данном комплекте наборов.

11.3.3.    Приготовление промывочного буфера: 1 флакон, содержащий 30 мл концентрированного (х20) промывочного буфера, вносят в 570 см³ свежеприготовленной стерильной дистиллированной воды (или 1 объем концентрированного буфера на 19 объемов стерильной дистиллированной воды). Приготовление буфера рекомендуется проводить в мерном цилиндре: сначала количественно переносят содержимое флакона с концентрированным буфером, после чего постепенно по стенке цилиндра вливают дистиллированную воду, доводя общий объем до 600с\г. и тщательно перемешивают, избегая образования пены на поверхности смеси. Хранение готового буфера: 1 месяц при комнатной температуре.

Примечания.

•    Содержимое гибридизационного буфера является едким веществом, и не должно попадать в глаза и на кожу. В случае контакта немедленно обильно нро-мьпъ и обратиться к врачу.

•    11ри проведении анализа необходимо надеть защитную одежду и перчатки.

•    Большинство реаг ентов содержат азид натрия в качестве консерванта.

11.4. Отбор и подготовка проб к анализу

11.4.1. Общие положения по отбору и подготовке проб

Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 «Методы отбора проб для микробиологических анализов», ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов». МУК 4.2.577—96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов». ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218—96), ГОСТ Р 51921— 2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes», МУК 4.2.1122—02 «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах». ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты. Отбор и подготовка их к испытанию» и ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа».

11.4.2. Кисло-молочные продукты и сыры тщательно измельчают с помощью гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых и подвергают нейтрализации до pH 7,2 ±0.2 1N раствором NaOH. Топленое масло или молочный жир расплавляют при температу ре 40—15 °С и перемешивают до получения однородной эмульсии, масло сливочное и мороженое расплавляют до сметанообразной консистенции.

11.5. Проведение анализа по обнаружению бактерии Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах

11.5.1.    Подготовленную в соответствии с разделом 5 пробу исследуемого продукта (гомогената) вносят в среду накопления - обогатительный бульон RM L по п. 4.2. предварительно прогретом в течение 15 мин при температуре 45 °С. для первичного обогащения в соотношении 1 : 3 (25 г продукта в 75 см³ среды). При необходимости анализа других масс продукта их посев проводят в среду также в соотношении 1 : 3 по объему. Пробы гомогенизируют с использованием гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых.

11.5.2.    Гомогенизированную пробу в RM L бульоне термостатиру-ют при температуре (37 ± 1) °С в течение 6 ч.

11.5.3.    Переносят 10 см³ инкубированной в RM L бульоне пробы в 90 мл обогатительного бульона RM L. предварительно нагретого до температу ры 41 °С. Посевы инкубируют при температу ре (37 ± 1)°С в течение 16 ч.

11.5.4.    Маркируют пробирки, входящие в набор «Lumiprobc 24 Listeria monocytogenes» в соответствии с номерами исследуемых проб и

помещают в штатив для 12 мм пробирок с держателем. Нс рекомендуется одновременно анализировать более 20 проб.

11.5.5.    Внесение проб (после инкубации в течение 16 ч) и всех реагентов (лизирующего и гибридизацио иного буферов, конъюгата, субстрата) необходимо производить быстро и нс касаясь наконечником краев пробирки. Не допускается использование одного наконечника для внесения разных проб или растворов буферов.

11.5.6.    Проведение лизиса бактериальных клеток: в каждую промаркированную пробирку добавляют, строго соблюдая очередность, как изложено ниже, следующие компоненты набора:

11.5.6.1.    Лизирующий буфер в количестве 100 мкл.

11.5.6.2.    Исследуемую пробу в обогатительном бульоне RM L в количестве 100 мкл.

В качестве отрицательного контроля (ОК) используют стерильный бульон RM L - 100 мкл. Пробу стерильного бульона RM L. используемого в качестве отрицательного контроля, тсрмостатируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 16 ч.

В качестве положительного контроля (ПК) используют тест-культуру Listeria monocytogenes. выращенную на бульоне RM L при 37 °С также в количестве 100 мкл.

11.5.6.3.    Пробирки закрывают адгезивной уплотнительной защитной пленкой (из набора), быстро перемешивают и помещают хзя инкубирования в водяную баню при температу ре (37 ± 1) °С на 15 мин.

11.5.7.    Проведение гибридизации: вынимают штатив из водяной бани, у даляют защитну ю пленку и добавляют в кажду ю пробирку ги-бридизационный буфер по 250 мкл. закрывают пробирки новой защитной пленкой и интенсивно встряхивают. Пробирки с внесенным гибри-дизационным бу фером инку биру ют в водяной бане при температуре (50 ± 1) °С в течение 60 мин.

11.5.8.    Выявление гибридов.

11.5.8.1.    Удаляют защитну ю пленку и быстро выливают содержимое всех пробирок одновременно, нс вынимая их из штатива.

11.5.8.2.    Не вынимая пробирки из штатива, быстро заполняют каждую пробирку промывочным буфером по п. 4.3.3 в количестве 5 см³, использу я диспенсер, после чего быстро опу стошают пробирки. Процедуру промывки проводят еще три раза. При проведении второй промывки также быстро полностью опу стошают пробирки сразу после заполнения их промывочным буфером. Третий и четвертый раз промывают пробирки следу ющим образом: после заполнения пробирок промывочным бу фером жду т 30 с перед тем. как полностью их опу стошить.