Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств ипконазола в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2476—09

Издание официальное

Москва • 2009

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств ипконазола в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2476—09

МУК 4.1.2476—09

при наличии взвеси раствор дополнительно фильтруют через бумажный фильтр «красная лента», фильтр промывают 3 мл воды и фильтраты объединяют). Дальнейшую очистку проводят на патроне Диапак С18. В кондиционированный по п. 2.5.6 патрон вносят водный раствор после центрифугирования, пробирку ополаскивают 2 см³ воды и тоже вносят в патрон. После этого промывают патрон двумя порциями по 5 см³ ацетонитрила. Все промывки отбрасывают. Ипконазол элюируют 5 см³ ацетона в чистую круглодонную колбу объемом 10 см³ и отдувают ацетон в токе азота. Сухой остаток растворяют в 3 см³ гексана и выдерживают колбочку в ультразвуковой бане в течение 5 мин. Дальнейшую очистку проводят на патроне, заполненном силикагелем 60. В концентрирующий патрон, промытый 3 см³ гексана, вносят полученный раствор. Патрон промывают два раза по 3 см³ гексаном и 1 раз 3 см³ смеси гек-сан-диэтиловый эфир (50 ; 50 по объему). Промывки отбрасывают. Ипконазол элюируют ацетоном двумя порциями по 5 см³. Ацетон удаляют из элюата током азота (с помощью испарителя одноканального). Полученный сухой остаток растворяют в 2,5 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4. Условия хроматографированш.Улътраэф^ъктттай жидкостной хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженном дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Колонка 1 - ACQUITY UPLC ВЕН Phenyl (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе воды и почвы и колонка 2 -ACQUITY UPLC ВЕН С-18 (100 * 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе проб зерна и соломы. Температура колонки 30 ± 1 °С. Подвижная фаза: ацетонитрил - 0.005М ортофосфорная кислота в соотношении 55 :45. Скорость потока элюента: 0,25 мл/мин. Рабочая длина волны 220 нм. Объем вводимой пробы 10 мкл. Время удерживания ипконазола 3,3 ± 0,1 мин (колонка 1) и 5,3 ±0,1 мин. (колонка 2).

Альтернативные условия хроматографирования: жидкостный хроматограф «Breeze» фирмы Waters с УФ-детектором и дегазатором. Рабочая длина волны 220 нм. Аналитическая колонка Spherisorb Phenyl (Waters) 150 х 4,6 мм, 5 мкм для анализа воды и почвы и Supelcosil С-18 (150 х 4,6) мм, 5 мкм (Sigma-Aldrich) для анализа проб зерна и соломы. Подвижная фаза ацетонитрил - 0,005М ортофосфорная кислота в соотношении 50 : 50.(pH 2,35). Скорость потока элюента 1 см³/мин. Дозируемый объем 20 мкл.

МУК 4.1.2476—09

3* Обработка результатов анализа

Содержание ипконазола в образцах воды, почвы, зерна и соломы зерновых колосовых культур (Х> мг/кг) вычисляют по формуле:

_v S₂xC*V

X =-:

S_xxP

Sj~ площадь пика ипконазола в стандартном растворе, (мВ • с);

Sг~ площадь пика ипконазола в анализируемой пробе, (мВ ■ с);

V— объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, cm^j; Р - навеска анализируемого образца, г

С - концентрация стандартного раствора ипконазола, мкг/см\ Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор ипконазола 1 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

4. Проверка приемлемости результатов параллельных определений За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает придела повторяемости(1):

Х_х и Х₂ — результаты параллельных определений, мг/кг; г - значение предела повторяемости (г- 2,8<т_г).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

5. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X ± А) мг/кг при вероятности Р = 0,95,

где X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Д- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

МУК 4.1.2476—09

S — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,005мг/кг*, где * - 0,005мг/кг — предел обнаружения).

б. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

6.L Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

С_д=Д — +Д ₇,где

^v я,Х п£

±Д^д:±Д^ р — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

Д^ = ±0,84Д, где

Д - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

A X ^Х

А-8х-, где

100

S - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к=Х-Т-С_А9где

где X^r, X, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания ком-

12

МУК 4 Л .2476—09

понента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

•к

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

(2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (/?):

X_lt Х₂ — результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг; R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

7. Требования техники безопасности.

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1,019—79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной    безопасности    по    ГОСТ    12 Л ,004—91.

13

МУК 4.1.2476—09

8. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.

9, Разработчики

Долженко В. И., Цибульская И. А., Журкович И. К., Луговки-наН. В., Ковров Н, Г.

Определение остаточных количеств ипконазола в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2476-—09

Технический редактор А. В. Терентьева

Подписано в печать 30.06.09 Формат 60x88/16    Печ.    л.    1,0

Тираж 200 экз.

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18/20

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, тел./факс 952-50-89

ББК 51.21 060

060 Определение остаточных количеств ипконазола в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009.—14 с.

1.    Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений (В. И. Долженко, И. А. Цибульская, И. К. Журкович, Н. В. Луговкина, Н. Г. Ковров).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. №3).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 6 февраля 2009 г.

4.    Введены в действие с 29 апреля 2009 г.

5.    Введены впервые.

ББК 51,21

© Роспотребнадзор,2009 © Федеральный центр гигиены н

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009

МУК 4.1.2476—09

(IRS, 2SR, 5RS; IRS, 2SR, 5 SR)-2-(4^op6eH3tui)-5-изопропил -1-(1H-1,2,4-триазол-1 -илметил)-циклопентанол (ШР АС).

Мол. масса: 333,9.

Брутто формула: Ci₈H₂4CiN₃0.

Ипконазол представляет собой бесцветные кристаллы.

Технический продукт состоит из смеси рацематов I (IRS, 2SR, 5RS) и II (IRS, 2SR, 5SR) с температурой плавления 88—90 °С. Давление пара I - 3,58 х 10'³ мПа (25 °С), давление пара II - 6,99 * 10’^J мПа (25 °С).

Растворимость в воде - 6.93 мг/дм³ (20 °С). Не подвергается термическому разложению и гидролизу. Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K<j_WlgP = 4,21 (25 °С).

Растворимость в воде - 6,93 мг/дм³.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность Ы>5о для крыс 1 338 мг/кг. Дермальная токсичность для крыс > 2000 мг/кг. Не раздражает кожу, слабо раздражает слизистую глаз кроликов. СК₅₀ (48 ч) для карпа 2,5 мг/дм³.

Область применения: фунгицид для борьбы с широким кругом болезней семян, эффективен против гельминтоспориозной пятнистости листьев и ржавчины. Рацематы I и II обладают одинаковой активностью. Механизм действия - ингибирование биосинтеза эргостерина.

Гигиеннческие нормативы для ипконазола в России не установлены.

2. Методика определения клокуинтоцет-мексила в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом ВЭЖХ

2.2. Основные положения

2.7.7. Область применения и принцип метода. Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств ипконазола в воде водоемов в диапазоне концентраций 0,001—0,01 мг/кг, в почве - 0,05—1,0 мг/кг, в зерне хлебных злаков - 0,01—0,1 мг/кг и в соломе - 0,050,5 мг/кг.

Методика основана на определении ипконазола методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов водн-ацетоновой смесью с последующей очисткой на концентрирующих патронах.

2.1.2. Метрологические характеристики. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов

4

МУК 4.1.2476—09

измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Показатель точности (граница относительной погрешности), =ьД% Стандартное отклонение повторяемости, оп % Предел повторяе мости, г,% Предел воспроизводимости, R,% Вода 0,001—0,01 100 5,6 15,7 22,0 Почва 0.05—0,1 50 6,8 19,0 26,6 Почва 0,1—1,0 25 6,5 18,2 25,5 Зерно 0,01—0,1 50 4,6 32,9 18,0 Солома 0,05—0,1 50 5,2 14,6 20,4 Солома 0,1—0,5 25 5,0 14,0 19,6

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (« - 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения ипконазола, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для п = 20, Р- 0.95

Анализи руемый объект Предел обнаружения, мг/кг Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Среднее значение определения, % Стандартное отклонение, S,% Доверительный интервал среднего результата, ±. % Вода 0,001 0,001—0,01 91,3 6,6 6,0 Почва 0,05 с? Y о °1 76,5 7,7 7,0 Зерно 0,01 0,03—0,1 87,5 5,1 4,6 Солома 0,05 0,05—0,5 86,2 6,5 5,9

2.1.3. Избирательность метода. Избирательность метода определения ипконазола достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.

2.2* Реактивы и материалы

Ацетон, осч    ТУ 6-09-3513—86

Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-200нм», сорт 5 или х.ч    ТУ 6-09-3 534—87

5

МУК 4.1.2476—09

Бумажные фильтры «красная лента»

Вода бидистиллирозанная, деионизированная Диэтиловый эфир, ч.д.а Ипконазол, аналитический стандарт с содержанием д.в. 97,4 %

Кислота ортофосфорная, хч

0.005 М водный раствор свежеперегнанный

н-Тексан, х.ч

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил -0,005М Н₃Р0₄ (55 : 45, по объему). Концентрирующие патроны, заполненные силикагелем 60 (0,040—0,063 mm), Merck. Концетрируюихие патроны Bond Elut Cl 8 (0,5 г), Varian.

Стекловата

2.3. Приборы и посуда Жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ-детектором, снабженном дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или «Breeze» фирмы «Waters» или аналогичный

Аналитические колонки ACQUITY UPLC ВЕН С-18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) и ACQUITY UPLC ВЕН Phenyl (150 х 3,9) мм,

4    мкм (Waters) или Spherisorb Phenyl (4,6 ^х 150) мм,

3 мкм (Waters) и Symmetry С-18 (250 * 4,6) мм,

5    мкм (Waters).

Баня ультразвуковая «Серьга» или аналогичная Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные Воронка Бюхнера

Мельница ножевая РМ -120 и лабораторная зерновая ЛМЗ

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, Buchi R-205 или аналогичный Насос водоструйный

Испаритель одноканальный «ПЭ-2300» для концентрирования экстрактов в токе азота Центрифуга ОПн-8УХЛ4.2

МУК 4.1.2476—09

Бидистиллятор

Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами) Шприц медицинский с разъемом Льюера PH-метр универсальный ЭВ-74 Насос водоструйный

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС Колбы круглодонные на шлифах KI.II50 29/32 ТС Воронки лабораторные В-75-110 Цилиндры мерные на 100,250 и 1 000 см³ Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1 000 см³ Пипетки на 1, 2, 5, 10 см³ Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1 000 мм³ и от 1 до 5 см³ Сито с диаметром ячеек 1 мм

2.4. Отбор и хранение проб Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб»; ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб». Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому измельчают на лабораторной мельнице.

2.5.Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей. Органические растворители при необходимости перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2 %-м раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 дм³ ацетона 10 г КМп0₄ и 2 г К₂С0₃). Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

МУК 4,1.2476—09

2.5.2.    Кондиционирование колонам. Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,25— 1 мл/мин) до стабилизации кулевой линии в течение 1—2 часов,

2.5.3.    Приготовление растворов. Для приготовления 2М раствора орто-фосфорной кислоты 200 г 98 % (или 225 г 87 %) кристаллической Н₃Р0₄ помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в 600 см³ дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Для приготовления 0,005М раствора орто-фосфорной кислоты 2,5 мл 2М раствора Н3РО4 вносят в мерную колбу на 1 л и доводят до метки деионизированным бидистиллятом.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску ипконазола (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 см³, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0.5 мг/см³). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 0,75 и 1,0 мкг/см"¹ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы ~ смесь ацетонитрил-0,005М орто-фосфорная кислота (55 : 45, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в силанизи-рованном или тефлоновом флаконе при температуре 0—4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.

При изучении полноты извлечения ипконазола используют ацетонитрильные растворы вещества.

2.5.4. Построение градуировочного графика. Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация ипконазола в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации ипконазола в градуировочном растворе.

2.5.5. Подготовка приборов и средств измерения. Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.5.6.    Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта

2.5.6.    L Кондиционирование патрона, заполненного октадецилсили-кагелем - Bond Elut Cl8 (0,5 г), осуществляют, пропуская через патрон последовательно по 3 мл ацетонитрила и воды. Элюат отбрасывают.

8

МУК 4 Л .2476—09

2.5.6.2. Кондиционирование патрона для повторной очистки экстрактов зерна и соломы, заполненного Силикагелем 60 (0,5 г), осуществляют пропусканием 3 мл гексана со скоростью 1—2 капли в секунду.

2.6*Проведение определения

2.6.1.    Определение ипконазола в пробах воды. Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 25 см³ пропускают через кондиционированный коцентрирующий патрон, заполненный октадецилсшш-кагелем, Фильтрат отбрасывают. Ипконазол элюируют 5 см³ ацетона. Элюат выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С и сухой остаток растворяют в 0,25 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ. 10 мм³ раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2.    Определение ипконазола в пробах почвы. Образец предварительно просеянной через сито почвы массой 10 г помещают в коническую колбу емкостью 100 см³ с притертой пробкой, добавляют 5 см³ воды и 35 см³ ацетона. Колбу помещают в ультразвуковую баню и экстрагируют ипконазол в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера (фильтр «красная лента»), осадок на фильтре промывают 5 см³ ацетона. Фидьтрат упаривают на ротационном испарителе (40 °С) до водного остатка. Водный остаток пропускают через подготовленный по п. 2.5.6 патрон с октадецилсиликагелем. Фильтрат отбрасывают. Колбу ополаскивают дважды порциями по 3 мл ацетонитрила и смывы также пропускают через тот же патрон. Фильтрат отбрасывают. Ипконазол элюируют 5 см³ ацетона. Элюат собирают, выпаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С) и сухой остаток растворяют в 5 см³ подвижной фазы. 10 мм³ вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3.    Определение ипконазола в пробах зерна и соломы зерновых колосовых культур. Навеску размолотого на лабораторной мельнице зерна массой 10 г или измельчённой на ножевой мельнице соломы массой 5 г помещают в коническую колбу емкостью 100 см³. В колбу добавляют 10 см³ воды и 40 см³ ацетона и экстрагируют ипконазол на ультразвуковой бане в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера с фильтром «красная лента». Экстракцию повторяют с 30 см³ ацетона, выдерживая в ультразвуковой ванне в течение 15 мин, суспензию фильтруют. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Объём водного остатка доводят до 10 см³ дистиллированной водой. Полученный раствор переносят во фторопластовую пробирку и центрифугируют при 8 тыс. об/мин в течение 10 мин. (или