4.1. Методы контроля. Химические факторы
Методические указания МУК 4.1.1966-05
"Определение остаточных количеств протиоконазола
по его основному метаболиту протиоконазол-дестио в
зерне и соломе зерновых колосовых культур методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 апреля 2005
г.)
Дата введения: 1 июля
2005 г.
Введены впервые
1. Вводная часть
Действующее вещество: протиоконазол
(JAU 6476)
2-[(2К8)-2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-2Н-1,2,
4- триазол-3(4Н)-тион
(ИЮПАК)
2-[2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-1,2-дигидро-3
Н-1,2,4- триазол-3-тион (С.А.).
Структурная формула:
Эмпирическая формула: C14H15Cl2N3OS.
Молекулярная масса: 344,3.
Бесцветное или светло-бежевое твердое вещество без запаха.
Температура плавления: 139,1 - 144,5 °С.
Давление паров при 20 °С: <<
4 × 10-7 Па.
Коэффициент распределения н-октанол/вода:
KowlogP = 4,16 (рН 4), 3,82(рН 7) и 2,0(рН 9).
Растворимость (г/л) при 20 °С:
ацетон - более 250, этилацетат - более 250, дихлорметан
- 88, ацетонитрил - 69; растворимость в воде - 0,005
(рН 4), 0,3 (рН 8) и 2,0 (рН 9).
Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой (DT50
= 120 дней) и щелочной (DT50
= > 1 года) средах.
В присутствии света в водных фотолитических
условиях протиоконазол достаточно быстро деградирует
с периодом полураспада 47,7 ч.
Краткая токсикологическая характеристика
Острая пероральная токсичность (LD50) для крыс -
более 6200 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD50) для крыс -
более 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LD50) для крыс - более 4990
мг/м3 воздуха.
Протиоконазол не оказывает
раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз, не обладает эмбриотоксическим или тератогенным
действием. LC50 для рыб - 1,83 мг/л (96
ч).
Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей, дафний
и почвенных микроорганизмов.
Основной метаболит протиоконазола:
протиоконазол-дестио (SXX 0665).
α-(1-хлорциклопропил)-α-(2-хлорфенил)метил-1Н-1,2,4-триазол-1-этанол
(С.А.).
Эмпирическая формула: C14H15Cl2N3O.
Молекулярная масса: 312,2.
Бесцветный порошок без запаха.
Температура плавления: 108,5 °С.
Давление паров при 20 °С: 2,7
× 10-7 Па.
Коэффициент распределения н-октанол/вода:
KowlogP = 3,04.
Растворимость (г/л) при 20 °С: гексан - 3, толуол - 84, ацетон - 100, ацетонитрил
- 43, дихлорметан - более 200, вода - 0,051.
Метаболит стабилен в кислой и
щелочной средах (DT50
= > 500 ч).
Другие физико-химические и токсикологические характеристики протиоконазол-дестио отсутствуют.
Гигиенические нормативы для протиоконазола
и протиоконазол-дестио в России не установлены.
Область применения препарата
Протиоконазол - фунгицид
системного действия из группы ингибиторов синтеза эргостерина. Вещество
обладает защитным, искореняющим и лечебным действием. При обработке
вегетирующих растений оно эффективно подавляет развитие возбудителей ржавчины,
мучнистой росы, септориоза, фузариоза колоса, ломкости стеблей и пятнистостей
листьев на посевах ячменя, пшеницы и других культур, а при протравливании семян
защищает последние от заражения твердой и пыльной головней и фузариозной корневой гнилью.
Протиоконазол весьма лабильное
вещество и при поступлении в растение очень быстро метаболизируется
до более устойчивого соединения - протиоконазол-дестио
(α-(1-хлорциклопропил)-α-(2-хлорфенил)
метил-1Н-1,2,4-1-этанол) /SXX 0665/. В связи с этим разработан метод,
позволяющий осуществлять контроль за содержанием
остаточных количеств протиоконазола в зерне и соломе
зерновых колосовых культур по протиоконазол-дестио.
2. Методика определения остаточных количеств протиоконазола
по его основному метаболиту протиоконазол-дестио в
зерне и соломе зерновых колосовых культур методом газожидкостной хроматографии
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Методика основана на газохроматографическом определении протиоконазол-дестио (SXX 0665) с ЭЗД на неподвижной фазе
OV-17 после экстракции его из растительного материала водным ацетоном, очистки
экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также
на колонке с оксидом алюминия и концентрирующем патроне Диапак-диол.
Количественное определение проводится методом абсолютной
калибровки.
2.1.2. Избирательность метода
В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии
пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания зерновых колосовых
культур.
2.1.3. Метрологическая характеристика метода
Таблица
Метрологические параметры метода
Анализируемый объект
|
Метрологические параметры, Р
= 0,95, n = 20
|
предел обнаружения, мг/кг
|
диапазон определяемых концентраций, мг/кг
|
среднее значение определения, %
|
стандартное отклонение S, %
|
относительное отклонение DS, %
|
доверительный интервал среднего, %
|
Зерно
|
0,02
|
0,02 - 0,2
|
88,6
|
5,3
|
2,4
|
±4,9
|
Солома
|
0,1
|
0,1 - 1,0
|
83,6
|
3,6
|
1,6
|
±3,4
|
2.2. Реактивы, растворы, материалы
Протиоконазол-дестио
с содержанием д.в. 98,5 % (Байер, Германия)
|
|
Ацетон, чда
|
ГОСТ 2603-79
|
Вода бидистиллированная
|
ГОСТ 7602-72
|
Гексан,
ч
|
ТУ 6-09-3375-78
|
Дихлорметан
|
ГОСТ
12794-80
|
Калия перманганат
|
ГОСТ 20490-75
|
Кальция хлорид, хч
|
ГОСТ 4161-77
|
Калий углекислый, хч
|
ГОСТ 4221-76
|
Кислота серная, хч
|
ГОСТ 4204-77
|
Натрия гидроксид,
хч
|
ГОСТ 4328-77
|
Натрий двууглекислый
|
ГОСТ 83-79
|
Натрия сульфат безводный, хч
|
ГОСТ
4166-76
|
Этилацетат
|
ГОСТ
22300-76
|
Элюент № 1 для колоночной
хроматографии: смесь гексан-этилацетат (85:15, по
объему)
|
|
Элюент № 2 для колоночной
хроматографии: смесь гексан-этилацетат (70:30, по
объему)
|
|
Элюент № 1 для Диапак-диола:
смесь гексан-дихлорметан (1:1, по объему)
|
|
Алюминия оксид 90 (0,063 - 0,2
мм), нейтральный для адсорбционной хроматографии (Мерк, Германия) I степени
активности по Брокману Концентрирующий патрон Диапак-диол (ЗАО БиоХимМак СТ, Москва, Ленинские горы, МГУ)
|
|
Азот газообразный, осч
|
ГОСТ 0203-74
|
Стекловата
|
|
Фильтры бумажные "синяя
лента"
|
ТУ 6-09-1678
|
2.3. Приборы, аппаратура, посуда
Хроматограф газовый "Кристалл
2000М" с ЭЗД с пределом детектирования по линдану
не выше 3,18 × 10-14 г/с или
аналогичный
|
|
Колонка хроматографическая,
набивная, стеклянная, 1000 × 3 мм, неподвижная фаза - 3 % OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 - 0,15 мм)
|
|
Микрошприц
емкостью 10 мкл МШ-10Ф
|
ТУ 64-1-2850
|
Аппарат для встряхивания АВУ
|
ТУ 64-1-1081-83
|
Весы аналитические типа ВЛР-200
|
ГОСТ 19401-74
|
Водоструйный насос
|
ГОСТ 10696-75
|
Колонка для адсорбционной
хроматографии
|
|
Мельница электрическая,
лабораторная или аналогичная
|
ТУ 46-22-236-79
|
Ротационный испаритель, тип ИР-1М
|
ТУ 25-11-917-76
|
Баня ультразвуковая, модель D 50
|
|
Branson Instr.Co, США
|
|
Баня водяная
|
ТУ 46-22-603-75
|
Воронка Бюхнера
|
ГОСТ 0147-73
|
Воронки делительные, вместимостью
100 мл
|
ГОСТ
25336-82
|
Воронки для фильтрования
стеклянные
|
ГОСТ 8613-75
|
Колба Бунзена
|
ГОСТ 5614-75
|
Колбы круглодонные
на шлифе, вместимостью 100, 250 мл
|
ГОСТ 9737-70
|
Колбы конические с притертыми пробками
вместимостью 250 мл
|
ГОСТ
25336-82
|
Колбы мерные, вместимостью 25, 50
и 100 мл
|
ГОСТ
1770-74
|
Колбы грушевидные, вместимостью 50
и 100 мл
|
ГОСТ
25336-82
|
Пипетки мерные вместимостью 1, 2,
5 и 10 мл
|
ГОСТ 20292-74Е
|
Пробирки
градуированные с притертыми пробками, вместимостью 5 мл
|
ГОСТ 10515-75
|
Цилиндры мерные, вместимостью 25,
50 и 100 мл
|
ГОСТ
1770-74
|
2.4 Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с
"Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции,
продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 № 2051-79).
Отобранные пробы зерна и соломы досушивают до стандартной
влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной
температуре или в холодной комнате при температуре 4 °С. Перед анализом зерно и
солому размалывают на лабораторной мельнице.
2.5. Подготовка к определению
2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей
Органические растворители перед началом работы очищают,
сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан
и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной
кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться.
Затем растворители последовательно промывают водой, 2 %-ным
раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего
сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.
Ацетон перегоняют над перманганатом калия
и поташом (на 1 л ацетона 10 г KMnO4 и 2 г K2CO3.
Этилацетат промывают равным объемом 5 %-го раствора
двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.
Оксид алюминия III степени активности по Брокману
получают добавлением 4,6 % воды к навеске оксида алюминия фирмы Мерк (Германия) I степени активности.
2.5.2. Подготовка и кондиционирование колонки
Готовую насадку (3 % OV-17 на Хромосорбе
W/HP) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку
устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и
стабилизируют в токе азота при температуре 250 °С в
течение 8 - 10 ч.
2.5.3. Приготовление стандартных растворов
Основной стандартный раствор протиоконазол-дестио
с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,0102 г вещества, содержащего
98,5 % д.в., в этилацетате в
мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12 °С не более месяца.
Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,05; 0,1;
0,25 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора метаболита
соответствующим последовательным разведением этилацетатом.
При изучении полноты открывания протиоконазол-дестио
в модельных матрицах используются ацетоновые растворы вещества.
2.5.4. Построение калибровочного графика
Для построения калибровочного графика в инжектор
хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора протиоконазол-дестио
с концентрацией 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл. Осуществляют не менее 5
параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического
пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ × с
от концентрации протиоконазол-дестио
в растворе в мкг/мл.
2.5.5. Подготовка колонки с оксидом алюминия и
концентрирующего патрона Диапак-диол для очистки
экстракта
В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним
диаметром 0,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят
суспензию 5 г оксида алюминия III степени активности по Брокману
в 20 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему).
Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой
безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 - 2
капли в секунду, после чего она готова к работе.
Концентрирующий патрон Диапак-диол
промывают сначала с помощью медицинского шприца 10 мл смеси дихлорметан-ацетон
(1:1, по объему), а затем 8 мл смеси гексан-дихлорметан
(7:3, по объему) со скоростью 5 мл/мин.
2.5.6. Проверка хроматографического поведения протиоконазол-дестио на колонке с оксидом алюминия
В круглодонную колбу емкостью 10
мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора протиоконазол-дестио
с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель потоком теплого воздуха,
остаток растворяют в 3 мл смеси гексан-этилацетат
(85:15, по объему) и наносят на подготовленную хроматографическую
колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 30 мл элюента № 1 (смесь гексан-этилацетат, 85:15) и затем 30 мл элюента № 2 (смесь гексан-этилацетат, 70:30) со скоростью 1 -
2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают досуха,
остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют на содержание протиоконазол-дестио по п. 2.7.
Фракции, содержащие протиоконазол-дестио,
объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл этилацетата и вновь
анализируют по п. 2.7. Рассчитывают
содержание вещества в элюате, определяют полноту
смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.
Примечание: Профиль вымывания протиоконазол-дестио может
меняться при использовании новых партий сорбента и растворителей.
2.6. Описание определения
2.6.1. Экстракция протиоконазол-дестио
К навеске размолотого зерна (20 г) или соломы (5 г)
добавляют 100 мл 70 %-го водного ацетона и суспензию перемешивают в течение 1
часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл.
Осадок на фильтре промывают 50 мл 70 %-ного водного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (соответственно около 35 и 25 мл), эквивалентную 5 г зерна или 1 г соломы. Дальнейшую очистку
проводят по пп. 2.6.2, 2.6.3 и 2.6.4.
2.6.2. Очистка экстракта
Отобранные аликвоты растительного
экстракта (из п. 2.6.1) упаривают до водной фазы (объем около 5 мл) на роторном
испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку
емкостью 100 мл, приливают 20 мл бидистиллированной
воды, 30 мл дихлорметана и смесь встряхивают в
течение 1 минуты. После разделения слоев собирают органическую фракцию, а
водную фазу обрабатывают дихлорметаном еще два раза
(30 + 20 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт
пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном
испарителе при температуре 30 °С.
2.6.3. Очистка на колонке с оксидом алюминия
К остатку в колбе, полученному при упаривании очищенных по
п. 2.6.2 экстрактов растительного материала, приливают 3 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) и помещают в
ультразвуковую баню на 3 минуты. Раствор переносят в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 25 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 25
мл смеси гексан-этилацетат (70:30, по объему) в
грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха
на роторном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток экстракта зерна
растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют по п. 2.7. Экстракт соломы подвергают дополнительной очистке на
концентрирующем патроне Диапак-диол.
2.6.4. Очистка на концентрирующем патроне Диапак-диол
Сухой остаток экстракта соломы из п. 2.6.3 переносят двумя
1-мл порциями смеси гексан-дихлорметан (7:3, по
объему) в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол
(п. 2.5.5). Патрон промывают 5 мл смеси
гексан-дихлорметан (1:1, по объему) со скоростью 5
мл/мин, которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 12 мл дихлорметана. Элюат упаривают досуха в грушевидной
колбе емкостью 50 мл на роторном испарителе при температуре 30 °С. Для удаления
следовых количеств дихлорметана в колбу приливают
5 мл гексана и упаривают досуха на роторном
испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл этилацетата и
анализируют по п. 2.7.
2.7. Условия хроматографирования
Газовый хроматограф "Кристалл 2000М" с
электронозахватным детектором (Ni63)
с пределом детектирования по линдану не выше 3,18
× 10-14 г/с.
Колонка хроматографическая,
стеклянная, 1000×3 мм, неподвижная фаза - 3 % OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 - 0,15 мм).
Температура детектора - 320 °С,
испарителя - 270 °С, термостата колонки - 230 °С.
Скорость потока газа-носителя (азот) - 30 мл/мин; поддув -
25 мл/мин.
Объем вводимой пробы - 2 мкл.
Время удерживания протиоконазол-дестио
- 2 мин 28 с.
Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 1 нг.
Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и
вычисляют среднюю площадь пика.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с
концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют этилацетатом.
2.8. Обработка результатов анализа
Содержание протиоконазол-дестио
рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
где
Х - содержание протиоконазол-дестио в пробе, мг/кг;
H1 - площадь пика
образца, мВ х с;
H0 - площадь пика стандарта,
мВ х с;
А - концентрация
стандартного раствора протиоконазол-дестио, мкг/мл;
V - объем
экстракта, подготовленного для хроматографирования,
мл;
m
- масса анализируемой части образца, г (для зерна - 5
г, для соломы - 1 г).
При установлении уровня протиоконазола полученное значение содержания протиоконазола-дестио (X) умножают на 1,1.
3. Требования техники безопасности
Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при
работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными
приборами.
4. Контроль погрешности измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости
измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 "Точность
(правильность и прецизионность) методов и результатов
измерений".
5. Разработчики
Дубовая Л.В., Макеев А.М.
ВНИИ фитопатологии, 143050 Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел.
592-92-20.
Руководитель
Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
|
Г.Г.
Онищенко
|