МУК 4.1.1912-04
Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа

ГОСУДАРСТВЕННОЕ

САНИТАРНО-ЭПИДЕтОЛОтЧЕСКОЕ НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

L^JD._____^

ния

_3 МЕТОДИЧЕСНИХ необходимых]

ПРИМЕНЕНИЯ Ф1 ОТ 12.06.08 №#1

«Технический^*? регламент

Ш на молоко и молочную

продукцию» Часть 3

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Сборник

методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12 июня 2008 г. № 88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию»

Часть 3

ББК 51.23 С23

С23 Сборник методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12 июня 2008 г. № 88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию».—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009.—71 с.

ISBN 5—7508—0771—1

ББК 51.23

В сборник включены методические документы, содержащие правила и методы исследований (испытаний) и измерений, а также правила отбора образцов для проведения исследований (испытаний) и измерений, в соответствии с постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации Г. Г. Онищенко от 08.12.2008 № 67.

Формат 60x88/16

Технический редактор Г. И. Климова Подписано в печать 25 02.09 Тираж 200 экз.

Псч. л. 4,5 Заказ 14

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д 18/20

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш , 19а Отделение реализации, тсл./факс 952-50-89

© Роспотребнадзор, 2009 © Федеральный центр гигиены н

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа

Методические указания МУК 4.1.1912—04

1.    Разработаны:    ГУ    НИИ питания РАМН (В. А. Тутельян,

С. А. Хотимченко, С. А. Шевелева, В. К. Кирничная, Т. В. Киселева, Н. Г. Орлова, Н. Р. Ефимочкина, Н. В. Барбер), Московским государственным университетом им. М. В. Ломоносова (А. М. Егоров, А. Ю. Колосова, Ж. В. Самсонова).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Минздрава России.

3.    Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г. Г. Онищенко 6 марта 2004 г.

4.    Введены в действие 1 мая 2004 г.

5.    Введены впервые.

40

МУК 4.1.1912—04

УТВЕРЖДАЮ Главный государственный санитарный врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

6 марта 2004 г.

Дата введения: 1 мая 2004 г.

4.3. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормнцетина) в продуктах животного происхождения методом

высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа

Методические указания _МУК    4.1.1912—04_

1. Назначение и область применения

Настоящие методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078—01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

Методические указания распространяются на методы с различным целевым назначением (арбитраж, скрининг). Два метода определения остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения:

I    - высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);

II    - иммуноферментного анализа (ИФА).

2. Общие положения

Среди ряда веществ, которые могут контаминировать продовольственное сырье и пищевые продукты, важное место занимают ветеринарные препараты, используемые как для лечения животных, так и в каче-

41

стве стимуляторов роста. Сильнодействующими лекарственными препаратами, используемые в ветеринарии, остаются антибиотики. Известно большое число антибиотиков, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в организме животных, характером метаболизма и т. д.

Систематическое поступление в организм человека антибиотиков с продуктами питания крайне вредно, поскольку они могут оказывать нежелательные эффекты, чаше всего в виде возникновения аллергических реакций, дисбактериозов, подавлять активность некоторых ферментов, изменять микрофлору кишечника, способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т. д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов в переработке мяса, рыбы, молока (в частности, при получении кисломолочных продуктов) и других продуктов. Кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.

Хлорамфеникол (далее - ХАФ) является антибиотиком широкого спектра действия, обладающим высокой активностью в отношении бактерий и риккетсий. В отличие от многих антибиотиков ХАФ обладает довольно простым химическим строением.

Формула хлорамфеникола

Хлорамфеникол малорастворим в воде, но хорошо в спирте. Установлено, что ХАФ медленно выводится из организма животных и сравнительно долго сохраняет свою активность при хранении продуктов.

В настоящее время для определения ХАФ в продуктах питания применяют ряд методов, в их числе микробиологические методы, которые являются сравнительно простыми и дешевыми, однако отличаются недостаточной специфичностью и воспроизводимостью результатов.

Для арбитражных исследований вводятся хроматографические методы, в частности ВЭЖХ, позволяющий раздельно определять как ХАФ, так и его метаболиты.

42

МУК 4.1.1912—04

Количественный метод определения ХАФ при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сельскохозяйственных продуктах, отличается низким пределом обнаружения (0,01 мг/кг), хорошей воспроизводимостью (относительное стандартное отклонение 0,15— 0,21) и надежностью.

Для скрининговых целей в мире широко применяют методы нмму-нохимического анализа, обеспечивающие высокую чувствительность, специфичность и точность. Для контроля пищевой продукции предпочтение отдается методам твердофазного иммуноферментного анализа, которые являются высокочувствительными (предел обнаружения -0,00008 мг/кг).

Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Согласно СанПиН 2.3.2.1078—01 содержание левомиуетина в продуктах животного происхождения не допускается.

3. Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб аналогичен для обоих методов исследования.

Отбор продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 «Мясо», ГОСТ 7202.0-74 «Мясо птицы». ГОС Т 3622—68 «Молоко и молочные продукты».

Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками или укладывают в коробки. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, хранят на холоде. а для скоропортящихся продуктов осуществляют замораживание -4—10 °С, используя для этой цели холодильники или соответствующие приспособления.

К исследованию скоропортящихся образцов следует приступать в день их доставки в лабораторию. При отсутствии такой возможности образны должны хранить при указанной выше температуре не более олух недель со времени отбора среднего образца.

43

4. Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.1. Принцип метода Метод основан на извлечении хлорамфеникола экстракцией этил-ацетатом, последовательной промывке экстракта разбавленным раствором щелочи и кислоты, обезжиривании петролейным эфиром и хроматографическом разделении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазном варианте.

4.2. Аппаратура, материалы, реактивы

Жидкостный хроматограф с УФ детектором, длина волны 278 нм, любой марки Колонка с обращенной фазой (ODS, С18) длина 25 см, диаметр 4,6 мм, диаметр сорбента 5 мкм

Г омогенизатор тканей

ГОСТ 15906

Центрифуга настольная или аналогичная

ТУ 5.375-4261

Ротационный испаритель с ловушкой

ТУ 25-11-917

Азот, поверочный нулевой газ

ГОСТ 9293-74

Весы технические

ГОСТ 19491

Весы аналитические

ГОСТ 24104—88Е

Цилиндры мерные, объемом 50 и 100 см³ Колбы плоскодонные на 50 и 100 см³ с

ГОСТ 1770

НШ№ 14,5

ТУ 48-52

Колбы мерные на 25, 50 и 100 см^

ГОСТ 1770

Пипетки 1Д 2,0, 5 и 10 см³ Колбы для упаривания с круглым или

ГОСТ 29227-91

коническим дном на 50 и 100 см³ с НШ № 14.5

ГОСТ 10394

Воронка делительная на 100 см³

ГОСТ 2536

Натрий серно-кислый, безводный

ГОСТ 4166

Этилацетат, хч

ГОСТ 5.1070

Натрий хлористый, насыщенный раствор в воде

Гидроокись натрия, хч

10 %-ный раствор щелочи (NaOH, КОН)

ГОСТ 4233

Уксусная кислота

10 %-ный раствор уксусной кислоты

ГОСТ 61-75

МУК 4.1.1912—04

Серная кислота

Калий фосфорно-кислый однозамещенный

0,025 М раствор КН₂Р0₄

Ацетонитрил

Петролейный эфир, фракция 40—70 °С Метанол (спирт метиловый)

Дециламин, импорт.

Вода дистиллированная Левомицетина сукцинат растворимый

ГОСТ 14262-78

ТУ 6-09-5324—87 ТУ 6-09-3534

ГОСТ 6995-77

ГОСТ 6709

4.3. Требования техники безопасности при проведении испытаний

Помещение, в котором проводится определение хлорамфеникола, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции анализа необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты.

4.4. Подготовка к испытанию

4.4.1. Приготовление растворов

Взвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 см³ и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина 1 мг/мл. В мерную колбу на 25 см³ помещают 0,25 см³ полученного раствора и разбавляют метанолом до метки. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.

4.5. Проведение испытания методом ВЭЖХ

4.5.1. Подготовка образца для определения левомицетина в молоке

Смешивают 25 см³ молока с 12 г безводного сульфата натрия и экстрагируют (3 раза по 15 см³ этилацетата). Полученную смесь центрифугируют 15 мин со скоростью 4 000 об./мин и декантируют. Этилацетат-ный слой промывают последовательно 5 см³ насыщенного раствора NaCI с добавлением в него 0,2 см³ 10 % NaOH; 5 см³ насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 см³ 10% СН₃СООН; 5 см³ насыщенного раствора NaCl. Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе (при 50 °С) до возможно минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха органических растворителей, добавляют 3 см³ смеси ацетонитрил-вода (I : 4) и экстрагируют 3 раза по 5 см³ петролейным эфиром. Петролейный эфир отбрасывают и извлека-

45

ют лсвомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 см³). Этилаце-татный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 см³ метанола.

4.5.2.    Подготовка образца для определения левомицетина в мясе

Гомогенизируют Юг мяса с 15 см³ фосфатного буфера (0,025 М КН₂Р0₄ + 0,025 М Na₂HP0₄) pH = 6,88 и экстрагируют 3 раза по 30 см³ этилацетата. Полученную взвесь центрифугируют 15 мин при

4    000 об./мин и декантиуют этилацетатный слой, промывают последовательно 5 см³ насыщенного раствора NaCI с добавлением 0,2 мл 10 %-ного NaOH; 5 мл насыщенного раствора NaCI с добавлением 0,2 мл 10 %-ного СНзСООН и 5 см* насыщенного раствора NaCI. Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе (при 50 °С) до возможно минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха органических растворителей, добавляют 3 см³ смеси ацетонитрил-вода (1 : 4) и экстрагируют 3 раза по 5 см³ петролейного эфира, петролейный эфир отбрасывают и извлекают лсвомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 см³). Этилацетатный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 см³ метанола.

4.5.3.    Подготовка образца для определения левомицетина в яйцах

Перетирают 10 г гомогената яйца с 5 г Na₂S0₄ приливают 40 см³ этилацетата и 5 см³ 1Н H₂S0₄ перемешивают и центрифугируют 5— 10 мин при 4 000 об./мин, этилацетатный слой декантируют, водную часть экстрагируют последовательно 30 и 20 см³ этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование для расслоения. Объединенные этилацетатные слои промывают последовательно 10 см¹ 2-процентного раствора Na₂C0₃ насыщенною NaCI; 10 см³ насыщенного раствором NaCI.

4.6. Условия хроматографирования (ВЭЖХ)

В жидкостной хроматограф с колонкой (Ультрасфер ODS. С_!8)

5    мкм (250 х 4,6 мм), УФ детектором при X - 278 нм, используя элюент ацетонитрил-вода-дециламин (40 : 60 : 0,1), вводят 5 мкл стандартного раствора (10 нг/мкл) левомицетина. В тех же условиях вводят метаноль-ный экстракт образца (молока, мяса, яиц).

46

МУК 4.1.1912—04

4.7. Подтверждение наличия лееомицетина в образцах Для подтверждения наличия лееомицетина к 50 мкл метанольного экстракта приливают 50 мкл 10%-ного раствора КОН и нагревают 20 мин при 70 °С, 10 мкл полученного раствора вводят в тех же условиях в колонку жидкостного хроматографа. На полученной хроматограмме пик с временем удерживания левомицетина отсутствует. Это подтверждает наличие левомицетина в образце.

4.8. Обработка результатов

4.8.1.3а окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.

Таблица 1

Метрологические характеристики метода определения хлорамфеиикола в продуктах питания животного происхождения (молоке, мясе, яйцах)

Статистический параметр

Соединение -хлорамфеникол

Нижний предел определения, мг/кг

0,01

Интервал надежного определения, мг/кг

о

о

Т

о

о

Среднее значение открываемости (показатель правильности), %

95,5

Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений хлорамфеиикола, полученными в одной лаборатории в одной серии измерений (сходимость), при Р = 0,95 %, не должно превышать, %

7,0

Допустимое расхождение между результантами двух параллельных определений хлорамфеиикола, выполненных в двух разных лабораториях (воспроизводимость), при Р = 0,95 % не должно превышать по отношению к среднему, %

10,0

4.8.2. Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования по п. 4.8.1, то повторно проводят два новых параллельных определения.

5. Определение хлорамфеиикола (левомицетина) в продуктах животного происхождения (молоке, мясе, яйцах) методом иммуноферментвого анализа 5. /. Принцип метода И ФА

В основу метода количественного определения ХАФ в продуктах питания положен принцип твердофазного конкурентного ИФА на поли-

47

МУК 4.1.1912—04

стироловых планшетах. Принцип метода основан на конкуренции свободного ХАФ из измеряемой пробы и ХАФ, предварительно иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к ХАФ антител. После отделения несвязав-шихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют с помощью антивидовых антител, меченых пероксидазой хрена. Количество связавшегося с антителами конъюгата вторичных антител выявляют с помощью субстрат-хромогенной смеси. Количество определяемого антибиотика, содержащегося в исследуемом образце, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции.

Пределы обнаружения метода - 0,000012—0,00008 мг/кг.

5.2. Аппаратура, материалы, реактивы

Фотометр планшетный вертикального сканирования, с фильтрами, соответствующими длине волны 492 или 450 нм «Униплан»,

«Пикон», «Мультискан» или иного типа с теми же характеристиками Дозаторы пипеточные автоматические с переменным объемом 0,002—0,02 см³,0,02—0,2 см³, 0,1—1 см³ одноканальные «Лснпипет»,

«Термолабсистемс» или иные тех же объемов Дозаторы пипеточные автоматические 8-каналь ные с переменным объемом 0,05—0,3 см³ «Ленпипет», «Термолабсистемс» или иные тех же объемов Наконечники для автоматических пипеток объемом 0,3 и 1,0 см³ однократного применения Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH ± 0,01 или pH-метр    ГОСТ    19881—74

или другие марки с аналогичными характеристиками Весы аналитические 120 г/0,001 мг Весы лабораторные общего назначения, 2 класса точности, до 200 г/0,1 г    ГОСТ 24104 —88

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 37 °С с отклонением от заданной ± 1 °С, не более

48

ТУ 64-1-1382—72

МУК 4.1.1912—04

Гомогенизатор лабораторный перистальтический

типа «Стомайкер», «Микс-2»

или других наименований

Аквадистиллятор, обеспечивающий качество

дистиллированной воды

Холодильник бытовой электрический

Стаканы химические и колбы мерные,

вместимостью 25, 50,200 и 500 см³

Часы механические сигнальные

Центрифуга настольная со скоростью не менее

4 000 об./мин (3 000 g)

ТУ 5.375-4261

ГОСТ 6709-72 ГОСТ 16317-87

ГОСТ 1770-74 ГОСТ 3145-84

или иного типа

Цилиндры мерные, вместимостью 25 см³ Шейкер лабораторный для пробирок типа «Вортекс»

Микроиспаритель лабораторный одноканальный моделей ПЭ-2300, «Мини-Вах» или других аналогичного назначения Насос (компрессор) мембранный РКадет,

РКадмирал или иных моделей аналогичного назначения

Аппарат универсальный для встряхивания    ТУ 64-1-2451—78

Набор реагентов для количественного

определения хлорамфеникола (левомицетина)

методом иммуноферментного анализа типа

«ИФА-ХАФ» (производства ЗАО «НВО Иммунотех»)

или другие с аналогичными

характеристиками

Набор реагентов для количественного определения хлорамфеникола (левомицетина) типа «Ридаскрин Левомицетин» (производства «Р-Биофарм АГ») или другие с аналогичными характеристиками Калий железистосинеродистый (желтая кровяная соль), хч Цинка сульфат, хч

Этилацетат, хч    ГОСТ    5.1070

Хлороформ технический    ГОСТ 2-15-76-72

Изооктан, хч

49

5.3. Характеристика наборов для иммуноферментного определения левомицетина (хлорамфеникола)

5.3.1. Состав набора ИФА-ХАФ:

•    планшет 96-луночный полистироловый,

покрытый конъюгатом ХАФ-овальбумин    1    шт.;

•    раствор ХАФ в метаноле концентрацией 1 мг/см³ 1    фл.;

•    антитела против ХАФ в 1 %-ном растворе

сахарозы, лиофилизкрованные    1    фл.;

•    конъюгат вторичных антител с пероксидазой

из корня хрена    1    фл.;

•    фосфатно-солевой буфер, приготовленный на основе одно- и двухзамещенного фосфата калия с добавлением твин-20, pH 7,0 ± 0,5,

концентрированный    2    фл.;

•    буфер для анализа образцов молока, приготовленный с добавлением казеина и

азида натрия, концентрированный - буфер 1    1    фл.;

•    субстратный буфер, приготовленный на основе

лимонной кислоты, натриевой соли лимонной кислоты и перекиси водорода, pH 4,9 ± 0,3, концентрированный    1    фл.;

•    о-фенилендиамин (хромоген),    по    6 мг    I    табл.;

•    серная кислота (стоп-реагент),    25    %    1    фл.

5.3.2. Состав набора «Ридаскрин Левомицетин»

Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированных антителами «захвата» - 1 шт.

Комплект стандартных растворов левомицетина со следующими концентрациями: 0; 0,5; 1,5; 4,5; 13,5; 40,5 нг/см³ буферном растворе по 1,3 мл-6 шт.

Конъюгат левомицетина с пероксидазой - 0,7 см³.

Антитела к левомицетину - 0,7 см³.

Субстрат, содержит пероксид карбамида - 7 см³.

Хромоген, содержит тетраметилбензидин - 7 см³.

Стоп-реагент, содержит 1 N серную кислоту - 14 см³.

Буфер 1, для разбавления стандартных растворов левомицетина, конъюгата, антител, растворов образцов и буфера 2-100 см³.

50

МУК 4.1.1912—04

Буфер 2, для разбавления стандартных образцов при анализе молока - 1 см³.

Наборы рассчитаны на проведение анализа в 2-х повторностях 41 исследуемых образцов и 6 калибровочных проб (всего % определений на один планшет).

5.33. Аналитические характеристики наборов

533.1. Набор ИФА-ХАФ

Специфичность. Использование высоко аффинных антител к ХАФ обеспечивает высокую специфичность анализа. Процент перекрестной реакции с сукцинатом ХАФ составляет 25 %, с дезацилированным ХАФ, являющимся одним из метаболитов антибиотика, - менее 1 %, с антибиотиками других групп - менее 1 %.

Чувствительность. Минимальная концентрация ХАФ, определяемая с помощью набора, составляет 0,00008 мг/кг (дм³).

Воспроизводимость. Коэффициент вариации результатов определений концентраций ХАФ с помощью набора не превышает 12 %.

Тест на открытие. Процент открытия составляет 70—130 %.

Линейность. Линейность составляет 90—110 %.

Диапазон определяемых концентраций 0,0001—0,1 мг/кг (дм³).

Проверка набора. При параллельном определении концентрации хлорамфеникола в продуктах питания животного происхождения с помощью набора ИФА-ХАФ и метода ВЭЖХ коэффициент корреляции составляет 0,975.

533.2. Набор «Ридаскрин Левомицетин»

Чувствительность (пределы обнаружения) 0,000012—0,00005 мг/кг (дм³).

Извлекаемость - > 80 %.

Перекрестная чувствительность: левомицетин - 100%, левомицетин основной - 0,5 %, тиамфеникол - менее 0,05 %. Нет чувствительности к тетрациклинам, гентамицину, ампициллину и флорфениколу.

5.4. Требования техники безопасности при проведении испытаний

Все компоненты наборов, за исключением о-фенилендиамина, в используемых концентрациях не токсичны. О-Фенилендиамин обладает канцерогенным действием. Поэтому в случае попадания веществ на кожные или слизистые покровы следует немедленно тщательно смыть его большим количеством воды. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Следует избегать контакта стоп-реагента с кожей.

51

МУК 4.1.1912—04

5.5. Проведение испытаний с применением набора ИФА-ХАФ

Все разведения реагентов и расчеты представлены для проведения анализа на 1 планшете.

Построение калибровочной кривой необходимо проводить для каждого планшета.

5.5.1. Приготовление реагентов

5.5.1.1. Приготовление фосфатно-солевого буфера, содержащего детергент (ФСБТ)

Содержимое двух флаконов с фосфатно-солевым буферным раствором количественно перенести в стакан и довести общий объем раствора до 400 см³ дистиллированной водой. Полученный буфер может храниться закрытым в течение 5 дней при температуре не выше 2—8 °С.

5.5.1.2. Приготовление буфера 1

Содержимое флакона с концентратом буфера количественно перенести в стакан и довести общий объем раствора до 50 см³ ФСБ'Г. Полученный буфер может храниться в течение 5 дней при температуре 2—8 °С.

5.5.13. Приготовление образцов для анализа

Молоко. Пробу молока развести перед анализом в 100 раз буфером 1.

Мясо. Встряхивают 3 г измельченной ткани (фарша) с 6 см³ этил-ацетата в течение 5 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин. Упаривают досуха 1 см³ верхней фазы. Осадок перемешивают с 3 см³ ФСБТ и центрифугируют при 3 000 g в течение 5 мин. Супернатант отбирают и разводят в 50 раз ФСБТ.

Яйца. Взвешивают по 3 г смешанного (гомогенизированного) содержимого яйца в реакционную посуду и проводят дальнейшую пробо-подготовку, как описано для образцов мяса.

5.5.1.4. Приготовление калибровочных проб (КП)

Калибровочные пробы готовятся заново при каждом определении.

Молоко. Калибровочные пробы готовятся из стандартного раствора ХАФ в метаноле (1 мг/см³) по следующей схеме.

1.    Приготовить 5 см³ раствора ХАФ в ФСБТ с концентрацией 0,01 мг/см³ (5 см³ раствора содержат 0,05 см³ стандартного раствора ХАФ в метаноле).

2.    Приготовить 1 см³ калибровочной пробы 6 (КП 6) в буфере 1 с концентрацией 100нг/см³ (1 см³ раствора содержит 0,01 см³ раствора, приготовленного на стадии 1).

3. Последующие калибровочные пробы готовят по схеме из КП6 с использованием буфера 1:

№№

Концентрация ХАФ, нг/см³

Общий объем калибровочной пробы, см³

Объем КП6, содержащийся в соответствующей калибровочной пробе, см³

КП 1

0

1,0

0

КП 2

0,1

0,5

0,1 см³ из КП 3

КПЗ

0,5

1,0

0,005

КП 4

2

1,0

0,02

КП 5

10

1,0

0,1

Мясо (яйца). Калибровочные пробы готовятся из стандартного раствора ХАФ в метаноле (1 мг/см³) по вышеприведенной схеме. На всех стадиях используется буфер ФСБТ.

5.5.1.5. Приготовление рабочего раствора антител

Рабочий раствор антител готовится непосредственно перед использованием.

Содержимое одного флакона с лиофилизированными антителами растворить в 6 см³ ФСБТ. Полученный раствор хранению не подлежит.

5.5.1.6.    Приготовление рабочего раствора конъюгата

Рабочий раствор конъюгата готовится непосредственно перед использованием.

Содержимое одного флакона с конъюгатом количественно перенести в стакан и довести общий объем до 15 см³ ФСБТ - при анализе образцов молока и до 30 см³ - при анализе образцов мяса и яиц. Полученный раствор хранению не подлежит.

5.5.1.7.    Приготовление субстратно-хромогенной смеси

Субстратно-хромогенную смесь готовят непосредственно перед использованием.

Для приготовления раствора применять только химически чистую посуду.

В 11,25 см³ дистиллированной воды растворить 1 таблетку о-фени-лендиамина, тщательно перемешивая и избегая попаданий света. К полученному раствору количественно добавить 1,25 см³ концентрата субстратного буферного раствора. Субстратно-хромогенная смесь, подготовленная к работе, хранению не подлежит.

5.5.2. Процедура анализа

Внесение реагентов следует проводить согласно схеме:

1

2

3

4

12

А

КП1

КП1

ПЗ

ПЗ

П

В

КП2

КП2

Г14

П4

П

С

КПЗ

КПЗ

П5

П5

П

D

КП4

КП4

П6

П6

П

Е

КП5

КП5

П7

П7

П

F

КП6

КП6

П8

П8

П

G

ш

П1

П9

П9

II

Н

П2

П2

1110

П10

п

5.5.2.1.    В два ряда лунок планшета внести калибровочные пробы (КП), приготовленные по п. 5.5.1.4, по 0,05 см³, начиная с минимальной концентрации. Рекомендуется не вносить калибровочные пробы в крайние ряды планшета во избежание влияния краевого эффекта. При разнице более 0,1 единицы оптической плотности в результатах параллельных проб на крайних рядах учитывать результат крайнего ряда не следует.

В оставшиеся лунки внести в дубликатах исследуемые образцы в объеме 0,05 см³.

Процедуру внесения образцов следует выполнять как можно быстрее. Вся операция не должна превышать 12—15 мин.

5.5.2.2.    Во все лунки планшета внести по 0,05 см³ рабочего раствора антител, приготовленного по п. 5.5.1.5. Антитела вносить в лунки планшета в той же последовательности, что и калибровочные пробы и исследуемые образцы.

5.5.2.3.    Плотно закрыть планшет крышкой и выдержать при температуре 37 °С в течение 1,5 ч в термостате.

5.5.2.4.    Содержимое лунок удалить стряхиванием. Затем провести отмывку. Для этого в каждую лунку планшета внести по 0,35 см³ промывочного буферного раствора, оставить на 1—2 мин, а затем удалить содержимое лунок стряхиванием. Процедуру повторить 4 раза. После этого тщательно удалить остатки влаги из лунок, несколько раз вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.

5.5.2.5.    Во все лунки планшета внести по 0,1 см³ рабочего раствора конъюгата, приготовленного по п. 5.5.1.6.

5.5.2.6.    Плотно закрыть планшет крышкой и выдержать при температуре 37 °С в течение 1 ч в термостате.

МУК 4.1.1912—04

5.5.2.7.    Содержимое лунок удалить стряхиванием. Затем провести отмывку. Для этого в каждую лунку планшета внести по 0,35 см³ промывочного буферного раствора, оставить на 1—2 мин, а затем удалить содержимое лунок стряхиванием. Процедуру повторить 5 раз. После этого тщательно удалить остатки влаги из лунок, несколько раз вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.

5.5.2.8.    Во все лунки планшета внести по 0,1 см³ раствора субстратно-хромогенной смеси и выдержать планшет при комнатной температуре 18—25 °С в темном месте в течение 30—35 мин при анализе образцов молока и 7—10 мин - при анализе образцов мяса или яиц.

5.5.2.9.    Внести во все лунки планшета по 0,35 см³ стоп-реагента (раствора серной кислоты).

5.5.2.10.    Измерить оптическую плотность в лунках планшета при длине волны 490 нм. Окраска планшета стабильна в течение 1 ч в темноте.

5.5.3. Учет результатов

Построить калибровочную кривую зависимости оптической плотности от концентрации ХАФ в калибровочных пробах (следует использовать логарифмический масштаб для оси абсцисс). Соединить кривой (по лекалу) полученные точки. Образец калибровочной кривой приведен ниже.

Рассчитать средние арифметические значения показателей оптической плотности испытуемых образцов и по калибровочной кривой определить в них концентрацию ХАФ, учитывая фактор разбавления, который равен 100, для всех образцов.

5.5.4. Условия хранения и эксплуатации набора

Набор реагентов ИФА-ХАФ должен храниться при температуре 2—8 ° С в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до 25 °С не более 5 суток. Срок годности набора -12 мес. Компоненты набора перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре 18—25 °С не менее 30 мин. Раствор антител, конъюгата и субстратно-хромогенная смесь хранению не подлежат. Промывочный буферный раствор может храниться после разведения при температуре 2—8 °С в течение 5 дней. При вскрытии и растворении лиофилизированных компонентов набора необходимо следить, чтобы на пробках не осталось сухого вещества.