Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

33 страницы

Купить МР 4.4.0136-18 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Методические рекомендации предназначены для использования в эпидемиологическом надзоре за энтеровирусной инфекцией с целью наблюдения за циркуляцией энтеро- и парэховирусов разных типов при исследовании материалов от больных и здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды

 Скачать PDF

Оглавление

I. Общие положения и область применения

II. Показания к исследованию

III. Требования к помещениям и технике безопасности

IV. Материал к исследованию

V. Материально-техническое обеспечение исследований

VI. Генотипирование энтеровирусов с использованием секвенирования области VР1 и 5'НТР генома

     6.1. Сущность метода

     6.2. Порядок проведения исследований

     6.3. Интерпретация результатов

     6.4. Эффективность метода

VII. Обнаружение и генотипирование парэховирусов человека

     7.1. Сущность метода

     7.2. Порядок проведения исследований

     7.3. Интерпретация результатов

     7.4. Эффективность метода

Приложение 1. Таксономическая классификация энтеровирусов человека

Приложение 2. Клинические синдромы, наблюдающиеся при энтеровирусных инфекциях неполиомиелитной этиологии и парэховирусных инфекциях

Приложение 3. Случаи групповых заболеваний, связанные с парэховирусной инфекцией

Приложение 4. Рекомендации к порядку отбора, транспортировки и хранения материала для наблюдения за циркуляцией энтеровирусов

Библиографические данные

Нормативные ссылки:
Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27
Стр. 28
стр. 28
Стр. 29
стр. 29
Стр. 30
стр. 30

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.4. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ ПО МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ

Молекулярно-генетические исследования при мониторинге энтеровирусной инфекции

Методические рекомендации МР 4.4.0136—18

Издание официальное

Москва • 2019

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.4. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ ПО МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ

Молекулярно-генетические исследования при мониторинге энтеровирусной инфекции

Методические рекомендации МР 4.4.0136—18

Таблица 1

Праймеры, рекомендуемые для генотипирования ЭВ

Обозна

чение

праймера

Последовательность 5* - 3*

Назначение

AN32

GTYTGCCA

Синтез кДНК области VP1 re-нома [22]

AN33

GAYTGCCA

AN34

CCRTCRTA

AN35

RCTYTGCCA

224

GCIATGYTIGGIACICAYRT

Амплификация фрагмента кДНК области VPI генома [22]

222

CICCIGGIGGIAYRWACAT

AN89

CCAGCACTGACAGCAGYNGA-

RAYNGG

AN88

TACTTGAC-

CACCTGGNGGNAYRWACAT

232

CCAGCACTGACAGCA

Секвснирование фрагмента кДНК области VP1 генома [22]

233

TACTGGACCACCTGG

EvR2

ATTGCTACC AT WAGCAG Y C A

Синтез кДНК 5’НТР генома [2]

EvR3

CACGGWCACCCARAGTASTCG

Амплификация и секвенирова-ние фрагмента кДНК 5’НТР ге-нома [2]

FevI

AGATCAGGYCGATGAGYCACYG

FevII

TTGG A ATC1TY GAY GCGTTGC

Праймеры, рекомендуемые для обнаружения и генотипирования ПЭВ

Таблица 2

Обозна

чение

праймера

Последовательность 5’- 3*

Назначение

AN345

GTAACASWWGCCTCTGGGSCCAAAAG

Обнаружение ПЭВ мето-дом ПЦР с гибридизаци-онно-флуоресцентной детекцией [22]

AN 344

GGCCCCWGRTCAGATCCAYAGT

AN257-P

(тип

ROX-

RTQ-2)

CCTRYGGGTACC-

TYCWGGGCATCCTTC

2090

GAYAATGCYATMTAY-

ACWATYTGTGA

Генотипирование ПЭВ [22]

2523

ACWGTRAARATRTCHACATTSATDG

2159

TTYTCMACHTGGATGMGGAARAC

2458

DGGYCCATCATCYTGWGCTGA

8)    реагенты для очистки меченой кДНК:

-    этанол 95 %;

-    этанол 70 %;

-    ЗМ ацетат натрия, pH 5,2;

-    100 мМ ЭДТА pH 8,0, приготовленный из 0,5М ЭДТА (0,5М ЭДТА и Н20 в соотношении 1 : 4).

9)    для установления типа ЭВ и ПЭВ и филогенетического анализа можно использовать компьютерную пршрамму MEGA (или аналогичную) для комплексного анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей1.

VI. Генотипирование энтеровирусов с использованием секвенирования области VP1 и 5’НТР генома

6.1. Сущность метода

6.1.1.    Метод генотинирования энтеровирусов, основанный на определении нуклеотидной последовательности фрагментов (частичном сек-венировании) области VP1 и 5’НТР генома, предназначен для определения вида/типа/генотипа/геноварианта энтеровирусов при мониторинге их циркуляции.

6.2. Порядок проведения исследований

6.2.1.    Определение типа ЭВ проводят путем анализа области VP1 генома ЭВ, включающего:

-    выделение РНК;

-    постановку реакции обратной транскрипции;

-    амплификацию фрагмента кДНК;

-    очистку фрагмента кДНК;

-    мечение фрагмента кДНК;

-    очистку меченого фрагмента кДНК;

-    определение нуклеотидной последовательности фрагмента кДНК в автоматическом режиме;

-    сравнение полученной последовательности с последовательностями ЭВ, представленными в международной базе нуклеотидных последовательностей2;

-    проведение филогенетического анализа.

На стадиях выделения РНК, постановки обратной транскрипции и амплификации кДНК необходимо введение отрицательного контроля.

Анализ 5’НТР генома ЭВ рекомендуется проводить в случае отрицательных результатов при определении типа ЭВ методом секвенирова-ния области VP1 генома. Исследования проводят начиная со стадии амплификации фрагмента кДНК.

6.2.2.    Выделение РНК проводят согласно инструкции по применению комплектов реагентов для выделения РНК.

6.2.3.    Реакцию обратной транскрипции проводят в 10 мкл сразу после получения РНК пробы.

Реагенты:

-ревертаза (M-MLV-обратная транскриптаза 200 ед./мкл) с 5-кратным ОТ-буфером, ингибитор РНКаз 20 ед./мкл, раствор дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ОТ, минеральное масло, праймеры R2, AN32, AN33, AN34, AN35, ТЕ-буфер.

Порядок проведения работы:

-приготовить смесь праймеров - указанные праймеры с концентрацией 20 нкмоль/мкл смешать в отдельной пробирке в равных объемах;

-в промаркированные амплификационные пробирки внести по 0,5 мкл смеси праймеров R2, AN32-35 (конечная концентрация 2 пкмоль/мкл каждого);

-    внести по 30 мкл минерального масла;

-индивидуальными наконечниками с фильтром внести по 5,1 мкл исследуемых проб, кратко центрифугировать;

-    инкубировать при 94 °С в течение 1 мин;

-    используя только индивидуальные для каждого реагента наконечники, в отдельной пробирке приготовить реакционную смесь для анализа необходимого числа проб (табл. 3), смесь перемешать.

Таблица 3

Приготовление реакционной смеси для ОТ

Реагенты

Объем реакционной смеси в пересчете на количество пробирок (мкл)

I

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ОТ-буфср

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

дНТФ

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

Ревертаза

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

Ингибитор

РНКаз

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

-    в пробирки с пробами внести по 4,4 мкл реакционной смеси, кратко центрифугировать;

-    инкубировать по программе: 42 °С - 30 мин; 95 °С - 5 мин;

-в каждую пробирку внести по 10 мкл ТЕ буфера, кратко центрифугировать.

По 5 мкл полученной кДНК перенести в промаркированные пробирки для амплификации фрагмента области VP1 генома ЭВ. Оставшуюся часть кДНК - хранить при 4 °С в течение 7 дней, далее - при минус 20 °С.

6.2.4. Амплификацию фрагментов кДНК области VP1 и 5’НТР генома энтеровирусов проводят методом ПЦР в 25 мкл смеси.

Реагенты:

Taq ДНК-полимераза 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-бу-фером, содержащим 15 мМ MgCfe, химически модифицированная Taq ДНК-полимераза для постановки ПЦР с «горячим стартом» 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl2; готовая смесь дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ПЦР; ТЕ-буфер; деионизованная вода, свободная от РНКаз; праймеры:

-для амплификации области VP1 генома ЭВ в двухраундовой ПЦР: 222 и 224 для 1-го раунда, AN88 и AN89 для 2-го раунда;

-    для амплификации 5’НТР генома ЭВ в однораундовой ПЦР: EvR3 и FevI для ЭВ геногруппы I, EvR3 и FevII для ЭВ геногруппы II. Амплификацию кДНК вирусов каждой геногруппы проводят в отдельной пробирке.

Порядок проведения работы:

приготовить смесь праймеров: в отдельной пробирке смешать необходимые праймеры с концентрацией 20 нкмоль/мкл в равных объемах; приготовить необходимое количество реакционной смеси (табл. 4): в амплификационные пробирки, содержащие 5 мкл кДНК, внести по 20 мкл реакционной смеси, кратко центрифугировать;

инкубировать в амплификаторе с активным регулированием температур (по раствору в пробирке) по программе: для 1-го раунда ПЦР области VP1 генома;

[95 °С - 1 мин (95 °С - 20 с; 42 °С - 20 с; 60 °С - 20 с) х 40 циклов, 60 °С-5 мин]

для 2-го раунда ПЦР области VP1 генома:

[95 °С - 15 мин (95 °С - 10 с; 60 °С - 10 с; 72 °С - 10 с) х 42 цикла, 72 °С - 5 мин]

для ПЦР 5’НТР генома:

[95 °С - 5 мин (95 °С - 10 с; 60 °С - 10 с; 72 °С - 10 с) х 52 цикла, 72 °С - 5 мин]

В случае использования амплификатора с матричным регулированием температур время повторяющихся шагов денатурации, отжига и элонгации должно быть увеличено до 1 мин.

Таблица 4

Приготовление реакционной смеси

Реагенты

Объем реакционной смеси в пересчете на количество пробирок (мкл)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ПЦР-буфер

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

дНТФ

2,5

5

7,5

10

12,5

15

17,5

20

22,5

25,0

Смесь праймеров

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

Taq полимераза *

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

Вода

12,1

24,2

36,3

48,4

60,5

72,6

84,7

96,8

108,9

121

Примечание:

П для 1-го раунда ПЦР области VP1 используют Taq ДНК-полимеразу;

2)    для 2-го раунда используют химически модифицированную Taq ДНК-полимеразу для ПЦР с «горячим стартом»;

3)    для амплификации 5’НТР генома используют химически модифицированную Taq

полимеразу для ПЦР с «горячим стартом»_

В результате ПЦР области VP1 генома синтезируют продукт размером 375 п.н., в результате ПЦР 5’НТР генома ЭВ1 - 261 п.н, ЭВН -295 п.н. Продукты ПЦР визуализируют методом электрофореза в агарозном геле.

6.2.5.    Очистку полученных фрагментов ДНК для секвенирования проводят непосредственно из амплификата (если отсутствуют фрагменты ДНК неспецифичного размера) или из агарозного геля (если в результате электрофореза наряду со специфичным продуктом визуализируются фрагменты ДНК неспецифичного размера) с использованием соответствующих наборов для выделения ДНК для молекулярно-генетических исследований. Концентрацию очищенной ДНК устанавливают методом электрофореза относительно концентрационного стандарта или на спектрофотометре при длине волны 280 нм.

6.2.6.    Мечение фрагментов кДНК энтеровирусов для секвенирования проводят с использованием праймеров AN232 и AN233 при анализе области VP1 и пар праймеров EvR3 и FevI для ЭВ геногруппы I, EvR3 и FevII для ЭВ геногруппы II при анализе 5’НТР генома.

Набор реагентов для мечеиия ДНК выбирают в зависимости от модели используемого секвенатора, реакцию проводят согласно инструкции по применению.

Очистку меченой ДНК осуществляют в соответствии с протоколом производителя.

Меченые и очищенные фрагменты ДНК секвенируют в автоматическом режиме.

Устанавливают нуклеотидные последовательности двух цепей фрагментов кДНК.

При успешном секвенировании хроматограмма не имеет посторонних сигналов и читается до позиции, соответствующей длине анализируемого фрагмента ДНК (пики примерно одинаковой высоты). Для обеспечения достоверности филогенетического анализа каждый нуклеотид должен быть прочитан по одному разу в каждом из направлений.

6.2.7.    Установленную нуклеотидную последовательность идентифицируют путем сравнения с имеющимися в международной базе нуклеотидных последовательностей ЭВ, может использоваться программное обеспечение BLAST3 (или аналогичное). Принадлежность нуклеотидной последовательности фрагмента кДНК области VP1 генома ЭВ вирусу того или иного типа определяют на основании уровня гомологии со сравниваемой последовательностью типового референтного штамма не менее 75 %.

6.2.8.    Последовательность 5’НТР генома ЭВ нетипоспецифична, видовая принадлежность такой последовательности устанавливается с учетом видовой принадлежности ЭВ разных типов (приложение 1 к методическим рекомендациям).

6.2.9.    Филогенетический анализ проводят с использованием программы MEGA4 (или аналогичной) с целью изучения филогенетических взаимосвязей идентифицированных энтеровирусов.

6.3. Интерпретация результатов

6.3.1. Типирование энтеровирусов с использованием амплификации и прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей VP1 региона является прямым методом и характеризуется высокой специфичностью. Установленный с использованием данного метода тип вируса соответствует типу, определяемому в реакции нейтрализации с использованием набора гипериммунных сывороток. В случае если гомология установленной последовательности ни с одной из представленных последовательностей ЭВ известных типов не превышает 75 %, следует

предполагать выявление ЭВ нового типа. По вопросу классификации такого энтеровируса рекомендуется обращаться в комитет по таксономии вирусов5.

6.4. Эффективность метода

6.4.1.    Использование методологии генотипирования ЭВ но двум областям генома позволяет:

-    установить нуклеотидные последовательности 4323 штаммов ЭВ, относящихся к 53 типам, при исследовании 8680 содержащих энтеровирус образцов клинического материала и объектов окружающей среды, собранных на территориях 64 субъектов 8 федеральных округов Российской Федерации;

-    установить этиологический агент, а также изучить эпидемиологические связи в очаге инфекции при расследовании 180 вспышек ЭВИ (серозный менингит, герпангина, экзантема, ОРВИ, ОКИ).

VII. Обнаружение и генотипнрование парэховирусов человека

7.7. Сущность метода

7.1.1.    Метод выявления и типовой идентификации ПЭВ основан на универсальной для вида Парэховирус человека ОТ-ПЦР 5’НТР генома в комплексе с частичным секвенированием области генома, кодирующей структурные вирусные белки.

7.2. Порядок проведения исследований

7.2.1.    Обнаружение РНК ПЭВ в исследуемых образцах методом ОТ-ПЦР 5’НТР генома с гибридизационно-флуоресцентной детекцией включает:

-    выделение РНК;

-    постановку реакции обратной транскрипции;

-    постановку полимеразной цепной реакции с использованием универсальных для ПЭВ праймеров и флуоресцентно-меченого зонда;

-визуализацию продукта ПЦР гибридизационно-флуоресцентным методом в режиме реального времени или по конечной точке.

7.2.2.    Выделение РНК проводят согласно инструкции по применению комплектов реагентов для выделения РНК.

7.2.3.    Реакцию обратной транскрипции проводят в 10 мкл смеси сразу после получения РНК пробы.

Реагенты:

Ревертаза (MLV-обратная транскриптаза 200 ед./мкл) с 5-кратным ОТ-буфером, ингибитор РНКаз 20 ед./мкл, 5-кратный раствор дНТФ для ОТ, рендом-праймеры, ТЕ-буфер.

Порядок проведения работ:

-в промаркированные амплификационные пробирки внести по 0,5 мкл рендом-праймеров;

-индивидуальными наконечниками с фильтром внести по 5,1 мкл исследуемых проб, кратко центрифугировать;

-    инкубировать при 94 °С в течение 1 мин;

-используя только индивидуальные для каждого реагента наконечники, в отдельной пробирке приготовить реакционную смесь для анализа необходимого числа проб (табл. 3), смесь перемешать;

-    в пробирки с пробами внести по 4,4 мкл смеси, кратко центрифугировать;

-    инкубировать по программе: 37 °С - 30 мин;

-    в каждую пробирку внести по 10 мкл ТЕ буфера, кратко центрифугировать.

По 5 мкл полученной кДНК перенести в подписанные пробирки для постановки ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Оставшуюся часть кДНК хранить при 4 °С в течение 7 дней, далее - при минус 20 °С.

7.2.4.    Постановку ПЦР с флуоресцентной детекцией проводят в 25 мкл смеси.

Реагенты:

-набор реагентов для проведения ПЦР-РВ с Taq ДНК-поли-меразой;

-    смесь праймеров AN345 и AN344 (по 20 пкмоль/мкл каждого), зонд AN257-P типа ROX - RTQ-2 (20 пкмоль/мкл).

Порядок проведения работы:

-    приготовить необходимое количество реакционной смеси (табл. 5):

-    в амплификационные пробирки, содержащие 5 мкл кДНК, внести по 20 мкл реакционной смеси, кратко центрифугировать;

-    инкубировать в амилификаторе с активным регулированием температур (по раствору в пробирке) по программе:

95 °С - 5 мин (95 °С - 15 с; 58 °С - 15 с; 62 °С - 15 с) х 45 циклов;

-    в случае использования амплификатора с матричным регулированием температур время повторяющихся шагов денатурации, отжига и элонгации должно быть увеличено до 1 мин.

-    проанализировать результаты амплификации по цветовому каналу ROX (или аналогичному, в зависимости от модели прибора).

Положительные пробы исследуют для определения типа ПЭВ.

Таблица 5

Приготовление реакционной смеси для ПЦР с флуоресцентной детекцией

Реагенты

Объем реакционной смеси в пересчете на количество пробирок (мкл)

/

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 Ох ПЦР-буфер

2,5

5

7,5

10

12,5

15

17,5

20

22,5

25,0

ДНТФ 2,5 мМ

2,5

5

7,5

10

12,5

15

17,5

20

22,5

25,0

MgCl2 25мМ

2.5

5

7,5

10

12,5

15

17,5

20

22,5

25,0

Смесь праймеров

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

Зонд

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Taq полимераза

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

Вода

11,7

23,4

35,1

46,8

58,5

70,2

81,9

93,6

105,3

117

7.2.5.    Идентификация типа ПЭВ включает:

-амплификацию фрагментов кДНК области генома VP3-VPI ПЭВ в двухраундовой ПЦР;

-    секвенирование полученных фрагментов кДНК;

-    определение типа ПЭВ в программе BLAST6 (или аналогичной). Идентификация ПЭВ в результате секвенирования одновременно

является подтверждением обнаружения ПЭВ.

На каждом этапе исследования необходимо введение отрицательного контроля. В качестве положительного ПЦР-контроля рекомендуется использовать пробы, в которых ранее методом секвенирования были идентифицированы ПЭВ.

7.2.6.    Амплификацию фрагментов кДНК области VP3-VP1 генома ПЭВ проводят в 25 мкл смеси.

Реагенты:

-Taq ДНК-полимераза 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl2, химически модифицированная Taq

ДНК-полимераза для постановки ПЦР с «горячим стартом» 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCb;

-    готовая смесь дНТФ для ПЦР (10-кратный раствор);

-    ТЕ-буфер; деионизованная вода, свободная от РНКаз;

-смеси праймеров по 20 мкмоль/мкл каждого:2090 и 2523 для 1-го раунда ПЦР, 2159 и 2458 для 2-го раунда ПЦР.

Порядок проведения работ:

-    приготовить необходимое количество реакционной смеси (табл. 6):

-    в амплификационные пробирки, содержащие 5 мкл кДНК, внести по 20 мкл реакционной смеси, кратко центрифугировать;

-    инкубировать по программе:

95 °С - 1 мин (95 °С - 10 с; 50 °С - 10 с; 68 °С - 10 с) х 40 циклов, 68 °С - 5 мин для 1-го раунда ПЦР;

95 °С - 1 мин (95 °С - 10 с; 55 °С - 10 с; 72 °С - 10 с) х 42 цикла, 72 °С - 5 мин для 2-го раунда ПЦР;

-    в результате двухраундовой ПЦР синтезируется продукт размером 300 п.н., который визуализируют методом электорофореза в агарозном геле.

Таблица 6

Приготовление реакционной смеси

Реагенты

Объем реакционной смеси в пересчете на количество пробирок (мкл)

1

2

3

4

J

6

7

8

9

10

ПЦР-буфер

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

ДНТФ

1,5

3,0

4,5

6,0

7,5

9,0

10,5

12,0

13,5

15,0

Смесь праймеров

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

Taq полимераза1,2

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

Вода

13,1

26,2

39,3

52,4

65,5

78,6

91,7

104,8

127,9

131,0

Примечание:

1)    для 1-го раунда используют Taq ДНК-полимеразу;

2)    для 2-го раунда используют химически модифицированную Taq ДНК-полимеразу для ПЦР с «горячим стартом»

7.2.7. Очистку полученных фрагментов кДНК проводят непосредственно из амплификата (при отсутствии фрагментов ДНК неспецифичного размера) или из агарозного геля (при наличии, наряду со специфичным продуктом, фрагментов ДНК неспецифичного размера) с использованием соответствующих наборов для выделения ДНК для молекулярно-генетических исследований. Концентрацию очищенной ДНК

ББК51.9

M75

M75 Молекулярно-генетические исследования при мониторинге энгеровирусной инфекции: Методические рекомендации.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2019.—31 с.

ISBN 978-5-7508-1695-8

1.    Разработаны ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И. Н. Блохиной» Роспотребнадзора (Н. А. Новикова, Л. Н. Голицына, В. В. Зверев,

О. В. Парфенова, Н. В. Епифанова, Е. И. Ефимов).

2.    Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. 10. Поповой 12 ноября 2018 г.

3.    Введены впервые.

ББК51.9

ISBN 978-5-7508-1695-8

О Роспотребнадзор, 2019

устанавливают методом электрофореза относительно концентрационного стандарта или на спектрофотометре при длине волны 280 нм.

7.2.8.    Мечение фрагментов кДНК парэховирусов для секвенирова-ния проводят с использованием пр'аймеров 2159 и 2458.

Набор реагентов для мечения ДНК выбирают в зависимости от модели используемого секвенатора, реакцию проводят согласно инструкции по применению. Очистку меченой кДНК осуществляют согласно протоколу производителя.

Меченые и очищенные фрагменты кДНК секвенируют в автоматическом режиме.

Устанавливают нуклеотидные последовательности двух цепей фрагментов кДНК.

При успешном секвенировании хроматограмма не имеет посторонних сигналов, читается до позиции, соответствующей длине анализируемого фрагмента ДНК, пики на ней примерно одинаковой высоты. Для обеспечения достоверности филогенетического анализа каждый нуклеотид должен быть прочитан как минимум по одному разу в каждом из направлений.

7.2.9.    Установленную нуклеотидную последовательность идентифицируют путем сравнения с имеющимися в международной базе нуклеотидных последовательностей ПЭВ, например, может использоваться программа BLAST7 (или аналогичная). Принадлежность нуклеотидной последовательности фрагмента кДНК области VP3-VP1 генома ПЭВ вирусу того или иного типа определяют на основании уровня гомологии со сравниваемой последовательностью типового референтного штамма не менее 75 %.

7.2.10.    Филогенетический анализ проводят с использованием программы MEGA8 (или аналогичной) с целью изучения филогенетических взаимосвязей идентифицированных парэховирусов.

7.3. Интерпретация результатов

7.3.1. 5’НТР генома ПЭВ является высококонсервативным участком и его амплификация характеризуется более высокой чувствительностью и специфичностью, чем амплификация кодирующих областей генома.

Содержание

I.    Общие положения и область применения............................................................4

II.    Показания к исследованию.................................. 6

III.    Требования к помещениям и технике безопасности.........................................7

IV.    Материал к исследованию...................................................................................8

V.    Материально-техническое обеспечение исследований......................................9

VI.    Генотипирование энтеровирусов с использованием секвенирования

области VP1 и 5’НТР генома 11........................................................................11

VII.    Обнаружение и генотипирование парэховирусов человека.........................16

Приложение 1. Таксономическая классификация энтеровирусов человека........22

Приложение 2. Клинические синдромы, наблюдающиеся при энтеровирусных

инфекциях неполиомиелитной этиологии и парэховирусных

инфекциях.......................................................................................23

Приложение 3. Случаи групповых заболеваний, связанные с парэховирусной

инфекцией.......................................................................................25

Приложение 4. Рекомендации к порядку отбора, транспортировки и хранения материала для наблюдения за циркуляцией

энтеровирусов................................................................................26

Нормативные и методические документы..............................................................28

Библиографические данные.....................................................................................29

Термины и сокращения............................................................................................31

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

12 ноября 2018 г.

4.4. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ ПО МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ

Молекулярно-генетические исследования при мониторинге энтеровирусной инфекции

Методические рекомендации МР 4.4.0136—18

I. Общие положения и область применения

1.1.    Эпидемиологический надзор за энтеровирусной (неполно) инфекцией, введенный в Российской Федерации в 2006 году, предусматривает типовой мониторинг неполиомиелитных энтеровирусов (далее -НПЭВ).

1.2.    На основании молекулярно-биологических свойств энтеровирусы (далее - ЭВ) разделены на 4 вида: А, В, С и D, включающие вирусы более 100 серотипов (приложение 1 к методическим рекомендациям). Полиовирусы трех серотипов, ранее выделявшиеся в отдельный вид, отнесены к виду энтеровирус С9.

При анализе нуклеотидных последовательностей 5’НТР генома ЭВ разделяют на 2 геногруппы. Геногруппа I включает вирусы видов А и В, гсногруппа II - вирусы видов С и D.

В конце XX века ЭВ ECHO 22 и ECHO 23 на основании особенностей биологических свойств и структурной организации генома и ви-риона были реклассифицированы как парэховирусы человека (далее -ПЭВ) 1 и 2 типа соответственно и вошли в состав нового рода Parecho-virus семейства Picornaviridae. Известно 16 типов ПЭВ, которые представляют вид Human Parechovirus'.

ПЭВ широко циркулируют в мире, в том числе и в Российской Федерации. Первичное инфицирование происходит, как правило, в детском возрасте. В среднем около 70 % случаев зарегистрированной парэхови-русной инфекции приходится на долю детей младше 1 года.

Большинство случаев парэховирусной инфекции протекает бессимптомно. ПЭВ способны вызывать те же заболевания, что и энтеровирусы, например, острые респираторные и кишечные заболевания, лихорадку, острый вялый паралич, серозный менингит, энцефалит, миокардит, экзантему, неонатальный сепсис (приложение 2 к методическим рекомендациям). ПЭВ обусловливают, прежде всего, спорадическую заболеваемость, но регистрировались и вспышки парэховирусной инфекции (приложение 3 к методическим рекомендациям). Циркуляция ПЭВ отмечается в течение всего года, при этом выраженная сезонность отсутствует.

Клинические симптомы при энтеро- и парэховирусной инфекции совпадают, поэтому дифференцировать возбудитель возможно только при помощи методов лабораторной диагностики. Диагностику парэховирусной инфекции проводят с использованием молекулярно-генетических методов: для обнаружения ПЭВ используют ОТ-ПЦР 5’НТР генома.

1.3.    Тип ЭВ может быть определен в реакции нейтрализации в культурах ткани (Hep-2, RD, Vero, GMK, tMK) с использованием типоспецифических сывороток. ПЭВ также способны реплицироваться в культуре данных тканей с развитием энтеровирус-подобного ЦПА, однако дальнейшая их идентификация невозможна в связи с отсутствием типовых антисывороток.

1.4.    Тип ЭВ может быть определен с использованием молекулярного типирования (генотипирования), которое основано на определении нуклеотидной последовательности области генома, кодирующей капсидный белок VP1. Полипептид VP1 содержит аминокислотные последовательности, определяющие серотип вируса, и является главным рецепторным локусом вириона. Определение типа ПЭВ проводят путем секвенирования фрагментов области генома, кодирующей белки капсида VP3 и VP1.

1.5.    Молекулярное типирование ЭВ с использованием амплификации и секвенирования нуклеотидных последовательностей региона VP1 является прямым методом идентификации, обладает высокими показателями специфичности.

1.6.    Последовательности нетранслируемых участков и области генома, кодирующей неструктурные белки, могут быть использованы для молекулярно-генетической характеристики выявленных вирусов, при

изучении их видовой принадлежности, изменчивости, филогенетических взаимосвязей, а также при установлении эпидемиологических связей в очаге инфекции.

1.7.    5’НТР генома энтеровирусов является высококонсервативным участком и может быть использован для дифференциального выявления ЭВ двух 5’НТР-геногрупи в случае отрицательного результата амплификации фрагмента области VP1 генома или неадекватной идентификации установленной нуклеотидной последовательности при неспецифичной амплификации или одновременном присутствии в исследуемой пробе энтеровирусов нескольких типов.

1.8.    В настоящих методических рекомендациях представлены методология генотипирования энтеровирусов человека на основе анализа нуклеотидных последовательностей двух областей генома и порядок проведения молекулярно-генетических исследований в целях обнаружения и типовой идентификации парэховирусов человека.

1.9.    Методические рекомендации предназначены для использования в эпидемиологическом надзоре за энтеровирусной инфекцией с целью наблюдения за циркуляцией энтеро- и парэховирусов разных типов при исследовании материалов от больных и здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды.

1.10.    Методические рекомендации предназначены для органов и организаций Роспотребнадзора, а также могут быть использованы научными и медицинскими организациями, занимающимися изучением энтеровирусной инфекции.

II. Показания к исследованию

2.1.    Метод генотипирования ЭВ применяется при осуществлении осуществление санитарно-эпидемиологического надзора за энтеровирусной инфекцией, в том числе для проведения:

-    мониторинга циркуляции ЭВ разных типов;

-    верификация положительного результата ОТ-ПЦР;

-    расследования вспышек ЭВИ (установление типа ЭВ).

2.2.    Показаниями для исследования на ПЭВ в рамках осуществления санитарно-эпидемиологического надзора за энтеровирусными инфекциями являются:

-отрицательный результат обследования на энтеровирусы с применением тест-систем, зарегистрированных на территории Российской

Федерации10, для обнаружения энтеровирусов в пробах клинического материала от больных с подозрением на энгеровирусную инфекцию;

-    отрицательный результат исследования на энтеровирусы методом ОТ-ПЦР нетипирующихся энтеровирус-подобных цитопато генных агентов (далее - ЦПА);

-    отрицательный результат лабораторных исследований на энтеровирусы в пробах клинического материала и объектах окружающей среды при расшифровке вспышек заболеваний с подозрением на энтерови-русную этиологию;

-    отрицательный результат обнаружения наиболее распространенных возбудителей вирусных острых кишечных инфекций (далее - ОКИ) (рота-, норо-, астро-, энтеро-, аденовирусы) в пробах клинического материала и объектах окружающей среды при расшифровке вспышек ОКИ с подозрением на вирусную этиологию среди детей дошкольного возраста.

2.3. Противопоказания к использованию метода:

-отсутствие условий для работы с возбудителями III группы патогенности и материалом, инфицированным или потенциально инфицированным диким полиовирусом.

III. Требования к помещениям и технике безопасности

3.1. Организация рабочих помещений и техника безопасности при работе с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней, а также с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом, осуществляются в соответствии с законодательством в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения11.

IV. Материал к исследованию

4.1.    С целью генотипирования ЭВ и ПЭВ исследуют:

-    нативные и пассированные в культуре ткани пробы клинического материала и объектов окружающей среды, в которых обнаружены ЭВ;

-    нетипирующиеся ЦПА, выделенные от больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и из объектов окружающей среды;

-ЭВ, выделенные и типированные в реакции нейтрализации в культуре ткани;

-    нативные образцы биоматериала, отрицательные на присутствие РНК ЭВ по результатам исследования методом ОТ-ПЦР.

4.2.    Для проведения молекулярно-генетических исследований используются следующие образцы биоматериала, положительные на присутствие РНК ЭВ по методу ОТ-ПЦР: суспензии фекалий, спинномозговая жидкость, мазки из ротоглотки, носо/ротоглоточные смывы, содержимое везикул, секционный материал, концентраты проб воды, культуральная жидкость пассированных образцов.

Сбор, обработка, упаковка, хранение и транспортировка материала осуществляются в соответствии с законодательством в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения12.

При проведении молекулярно-генетических исследований используются стерильные наконечники для микропипеток и микропробирки, все операции проводятся в одноразовых перчатках, защитных очках.

При работе с исходным образцами и материалом, содержащим нуклеиновые кислоты, применяются наконечники с аэрозольным барьером.

V. Материально-техническое обеспечение исследован и й

5.1. При проведении молекулярно-генетических исследований используют следующее материально-техническое обеспечение13:

1)    стандартное оборудование для ПЦР-лаборатории;

2)    стандартное оборудование для секвенирования ДНК (перечень оборудования, необходимого для проведения секвенирования продуктов амплификации, определяется в соответствии с инструкциями по эксплуатации производителей автоматических секвенаторов);

3)    реагенты и тест-системы, зарегистрированные на территории Российской Федерации14:

-    для выделения РНК;

-для постановки обратной транскрипции: ревертаза (M-MLV обратная транскриптаза 200 ед./мкл, 5-кратный ОТ-буфер, готовая смесь дНТФ с концентрацией 2,5 мМ, ингибитор РНКаз 20 ед./мкл, минеральное масло, ТЕ-буфер; или комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК;

-для постановки полимеразной цепной реакции: Taq ДНК-поли-мераза 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl2; химически модифицированная Taq ДНК-полимераза для постановки ПЦР с «горячим стартом» 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl2; готовая смесь дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ПЦР; деионизованная вода, свободная от РНКаз (ДЭПК-Н20), ТЕ-буфер;

-    маркер длин фрагментов ДНК в диапазоне 100—1 000 п.н.

4)    праймеры (рабочая концентрация праймеров 20 пкмоль/мкл):

-для генотипирования ЭВ (табл. 1);

-    для обнаружения и генотипирования ПЭВ (табл. 2).

5)    комплекты реагентов для качественной электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.

6)    наборы реагентов для очистки ДНК, предназначенные для выделения ДНК из агарозного геля или из реакционных смесей.

7)    реагенты для мечения очищенной кДНК (приобретаются в зависимости от модели используемого секвенатора).

1

   megasofhvare.net - официальный сайт программы MEGA для комплексного анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

2

   www.ncbi.nlm.nih.gov/gcnbank - официальный сайт базы данных, находящейся в открытом доступе, содержащей все аннотированные последовательности ДНК и РНК, а также последовательности закодированных в них белков.

3

   blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi - официальный сайт идентификации нуклеотидных и белковых последовательностей.

4

   megasolhvare.net - официальный сайт программы MEGA для комплексного анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

5

www.picomastudygroup.com - официальный сайт группы изучения пикорнавирусов Международного комитета таксономии вирусов («ICTV Picomaviridae Study Group»).

6

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BIast.cgi - официальный сайт идентификации нуклеотидных и белковых последовательностей.

7

11 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi - официальный сайт идентификации нуклеотидных и белковых последовательностей.

8

http://megasoftware.net - официальный сайт программы MEGA для комплексного анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

9

www.picornaviridae.com - официальный cafrr группы изучения никорнавирусов Института профилактики и контроля вирусных заболеваний, Пирбрайт, Великобритания.

10

   Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2013, № 1, ст. 14; 2018, №24, ст. 3523) (далее - постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416); приказ Минздрава России от 06.06.2012 №4н «Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий» (зарегистрировано Минюстом России 09.07.2012, регистрационный номер 24852), с изменением, внесенным приказом Минздрава России от 25.09.2014 № 557н (зарегистрировано Минюстом России 17.12.2014, регистрационный номер 35201) (далее - приказ Минздрава России от 06.06.2012 № 4н).

11

29.06.2011 № 86 (зарегистрировано Минюстом России 12.07.2011, регистрационный номер 21317); санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1325-03 «Безопасность работы с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 22.05.2003 №99 (зарегистрировано Минюстом России 03.06.2003, регистрационный номер 4619); методические указания МУ 1.3.2569—09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности», утвержденные Роспотребнадзором 22.12.2009.

12

Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.2260—07 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования материалов, инфицированных или потенциально инфицированных диким полиовирусом», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 24.08.2007 №61 (зарегистрировано Минюстом России 17.09.2007, регистрационный номер 10149); санитарные правила СП 1.2.036—95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I—IV групп патогенности», утвержденные постановлением Госкомсанэпиднадзора России от 28.08.1995 № 14; методические указания МУК 4.2.2357—08 «Организация и проведение вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие (неполно) энтеровирусы», утвержденные Роспотребнадзором 04.05.2008; методические указания МУК 4.2.2746—10 «Порядок применения молекулярно-генетических методов при обследовании очагов острых кишечных инфекций с групповой заболеваемостью», утвержденные Роспотребнадзором 30.09.2010.

13

   Примечание: Допускается использовать оборудование, реагенты и тест-системы с аналогичными или лучшими характеристиками.

14

   Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416; приказ Минздрава России от 06.06.2012 № 4н.