Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской Федерации_
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Организация и проведение вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие(неполно)энтеровирусы
Методические указания МУК 4.2.2357—08
Издание официальное
Москва • 2009
Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей н благополучия человека
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Организация и проведение вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие(неполно)энтеровирусы
Методические указания МУК 4.2.2357—08
оперативной информации и последующего оперативного реагирования, поэтому пробы не должны накапливаться в лаборатории для ретроспективного исследования.
Все процедуры во время получения, распаковки и регистрации проб осуществляют в защитной одежде и резиновых перчатках.
6. Обработка проб из объектов окружающей среды в лаборатории
При обработке проб могут образовываться аэрозоли. Поэтому все работы по подготовке проб воды для исследования проводятся в БЗУ 2 -го класса защиты. Для исключения перекрёстной контаминации проб все манипуляции по подготовке к исследованию не следует совмещать с работой с материалами, полученными от случаев ПОЛИО/ОВП. Оптимально работа с пробами из ООС и с материалами, полученными от случаев ПОЛИО/ОВП, должна выполняться в разных помещениях и разными группами персонала.
Пробы из ООС готовят для исследования в зависимости от вида в соответствии с нормативными и методическими документами (прилож. 1).
При обработке одномоментно отобранных проб применяют концентрирование с помощью двухфазного разделения. При обработке проб, отобранных методом адсорбции на макропористом стекле (далее -МПС), проводят ступенчатую элюцию.
6.1. Обработка одномоментных проб и концентрирование вирусов методом двухфазного разделения.
До начала концентрирования пробу (1,0 л) делят на две части (по 500,0 мл) - одну часть подвергают концентрированию, другую хранят при -20 °С для возможного повторного исследования.
Объём осветлённой сточной воды смешивают с выбранными объёмами двух полимеров - декстрана и полиэтиленгликоля. Гомогенную смесь этих ингредиентов, полученную путём энергичного встряхивания, оставляют на ночь при 4 °С в делительной воронке. Это позволяет полимерам разделиться и сформировать в воронке два отчётливых слоя (две фазы). Энтеровирусы накапливаются в меньшем нижнем слое или на границе двух фаз (интерфаза). Нижний слой и интерфазу собирают капельным способом. Осадок после первоначального центрифугирования вносят в этот концентрат, взвесь обрабатывают хлороформом и проверяют наличие в ней вируса. Такам образом проба концентрируется в 50—100 раз.
6.2. Обработка проб, полученных методом адсорбции.
МУК 4.2.2357—08
Выполняют ступенчатую элюцию вирусов, адсорбированных на МПС, помещённом в пакетики для сбора проб. МПС переносят в стеклянную колонку и медленно пропускают через колонку буферные растворы, собирая три элюата (фракции). Каждую фракцию обрабатывают хлороформом так, как это делается при обработке фекалии.
7. Порядок проведения лабораторных исследовании
7.1. Выделение и идентификация вирусов.
7.1.1. Клеточные линии, рекомендуемые для выделения полиовирусов, других (неполно) энтеровирусов. Основные принципы работы.
Для максимально возможного выделения полиовирусов, НПЭВ из проб ООС следует использовать комбинации нескольких видов клеточных культур, чувствительных к полиовирусам и различным серотипам НПЭВ. Учитывая сведения о чувствительности различных клеточных культур к различным вирусам, наиболее подходящими для целей исследования культурами являются культуры RD, НЕр-2, L20B, BGM. Культуры клеток должны быть получены по запросу из официальных источников (для НЦ таким источником являются лаборатории Глобальной лабораторной сети по полиомиелиту ВОЗ, для РЦ - НЦ). Для сохранения чистоты, аутентичности и стабильности клеточных культур следует заменять «рабочую» линию после 3-х мес. или 15 пассажей культивирования в лаборатории. Все манипуляции с культурами клеток фиксируют в рабочем журнале, обозначая тип клеток, номер пассажа, дату посева и все смены среды.
Все работы с неинфицированными культурами клеток проводятся в отдельном боксированном помещении, расположенном в «неинфекционной зоне» лаборатории, в БЗУ 2-го класса защиты. Для избежания перекрёстной контаминации между различными типами клеточных культур никогда не работают одновременно с несколькими культурами клеток. Все неинокулированные культуры клеток следует считать потенциально опасными, поэтому после окончания работы все культуральные жидкости и культуры обеззараживают автоклавированием.
При работе с культурами клеток, создании клеточных банков следует руководствоваться нормативными и методическими документами (прилож. 1).
Для контроля чувствительности клеток к полиовирусам проводят ежеквартальное титрование вакцинных штаммов Сэбина вируса полиомиелита типов 1,2 и 3 (референс-штаммы) на каждой из культур клеток после 8—10 пассажей.
7.1.2. Выделение и идентификация вирусов.
И
Выделение вирусов
Концентраты проб сточных вод и элюаты, полученные из проб, собранных методом адсорбции, исследуют на присутствие полиовирусов и НПЭВ так же, как исследуют пробы фекалий. Для проведения возможных повторных исследований одну четверть обработанной пробы (примерно 1,0 мл) замораживают и хранят при -20 °С.
Для исследования одной пробы используют культуру клеток площадью не менее 75 см2, что эквивалентно трём флаконам ёмкостью 50,0 мл (25 см2 клеточной поверхности в каждом). Выделение вирусов проводят на не менее чем двух культурах клеток, при этом одной из них должна быть высокочувствительная к вирусу полиомиелита и большинству НПЭВ культура клеток RD. Оптимальным является комбинация 3-х культур - RD, L20B, НЕр-2. После замены ростовой среды на 7,5 мл поддерживающей среды в каждый флакон вносят 0,5 мл обработанной пробы. Все использованные клеточные культуры следует инокулировать одновременно. Обязательно оставляют по одному незаражённому контрольному флакону каждой культуры. Флаконы инкубируют в термостате при температуре 36 °С. Ежедневно, обычно в течение 5—7 дней, проверяют культуры на наличие ЦПЭ. Все признаки ЦПЭ, токсичности, контаминации посторонними микроорганизмами регистрируют в лабораторном журнале. При появлении ЦПЭ (при охвате изменениями 75 % клеточного монослоя) прекращают инкубацию флаконов и сохраняют культуральную жидкость при -20 °С для следующего пассажа на той же культуре клеток. Содержимое каждого флакона с культурой клеток пассируют индивидуально, флаконы никогда не объединяют. Для пассажа могут быть использованы культуры, выращенные в пробирках. Если при первичном заражении не наблюдали ЦПЭ, то делают так называемый «слепой» пассаж. Культуры, в которых не проявлялся ЦПЭ, инкубируют и наблюдают не менее 14 дней. При отсутствии ЦПЭ в течение этого срока независимо от количества предыдущих пассажей культуры отбрасываются как негативные.
При хорошем состоянии культуры клеток первичное заражение и один пассаж вместе составляют период наблюдения 14 дней. В ряде случаев (например, при выделении агента с низкой цитопатогенной активностью, или при наличии в пробе вируса в небольшом количестве) необходимо сделать последующие пассажи. При этом следует помнить, что каждый последующий пассаж увеличивает риск перекрёстной контаминации.
При выделении вирусов из проб воды различного происхождения на культуре клеток можно столкнуться с рядом нежелательных явлений.
МУК 4.2.2357—08
Если при первичном заражении в культуре клеток развивается быстрая (в течение 1—2 дней после внесения исследуемого субстрата) дегенерация клеток, то, скорее всего, это связано с неспецифической токсичностью пробы. Такие культуры нужно заморозить при -20 °С, оттаять и выполнить пассаж. Если признаки токсичности обнаружатся вновь, то следует вернуться к исходной пробе, развести её фосфатно-солевым буфером (далее - ФСБ) 1 : 10 и повторить заражение. Бактериальная контаминация, которая проявляется в виде помутнения среды, приводит к гибели клеток и делает выявление вирусного ЦПЭ затруднительным или невозможным. В этом случае следует вернуться к исходной пробе, обработать её хлороформом и повторить процедуры заражения.
Особое внимание следует уделять предупреждению перекрёстной вирусной контаминации во время процедур заражения и пассирования. Нельзя сливать среду через край флакона или пробирки, в которые вносилась исследуемая проба, даже если ЦПЭ отсутствует. Удаление среды производят пипеткой, которую меняют после каждой процедуры.
При заражении с помощью автоматических микропипеток используют только наконечники с фильтрами. Следует избегать процедур, при которых образуются аэрозоли (например, энергичное пипетирование); не рекомендуется использование посуды с резиновыми пробками, которые помещаются внутрь горлышка флакона или пробирки. Следует использовать посуду с внешней резьбой на горлышке, которая закрывается завинчивающимися крышками.
Известно, что в пробах воды присутствуют смеси вирусов, с чем могут быть связаны затруднения при идентификации выделенных изо-лятов. Для разделения смесей и правильной идентификации выделенных вирусов, а также для того, чтобы избежать потери вирусов полиомиелита, все изоляты, «положительные» на культуре клеток RD, следует пассировать на клетки L20B. Наличие выраженного ЦПЭ указывает на присутствие в пробе вируса полиомиелита. Некоторые реовирусы, аденовирусы, а также НПЭВ могут проявлять ЦПЭ на клетках L20B и поэтому затруднять идентификацию выделенных изолятов и интерпретацию результатов исследования. Такие изоляты следует направить в соответствующую референс-лабораторию для заключительного исследования.
В лабораторной практике часто используется метод адсорбции исследуемого материала на клеточном монослое. При использовании этого метода из флакона/пробирки удаляют ростовую среду, ополаскивают монослой стерильным ФСБ, вносят исследуемую пробу и инкубируют флакон при температуре 36 °С в течение 1 ч. Таким образом создаются
лучшие условия для адсорбции вируса клетками, если он присутствует в пробе. После истечения срока инкубации в каждый флакон/пробирку вносят необходимое количество поддерживающей среды.
Применение этого метода может способствовать выявлению вируса при его незначительных количествах в исследуемом материале, а также ускорить проявление ЦПЭ по крайней мере на 1 сут. Однако преимущества этого метода перечеркиваются его недостатками, так как в результате дополнительных открываний крышек во много раз возрастает вероятность контаминации (перекрестной вирусной или бактериальной).
Использование для выделения вирусов микропанелей для клеточных культур (6, 12, 24-луночных) с одной стороны увеличивает количество зараженных культур, что повышает шансы на выделение вируса, с другой - многократно увеличивает возможность контаминации. Поэтому использование микропанелей в рутинной лабораторной практике требует особой аккуратности.
Идентификация выделенных полиовирусову других (неполио) энтеровирусов
Идентификацию выделенных штаммов полиовирусов, НПЭВ проводят в реакции нейтрализации инфекционности на культуре клеток с помощью микрометода. В основе реакции нейтрализации лежит взаимодействие исследуемого вируса с гомологичной сывороткой (или смесью антисывороток), которая нейтрализует вирус, что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на культуре клеток. В опыте по нейтрализации вирусную суспензию, содержащую 100 ТЦД50, смешивают в равном объёме с диагностическими сыворотками в лунках планшета для микронейтрализации, инкубируют 1 ч при 36 °С, добавляют суспензию клеток, помещают в термостат, проводят ежедневное микроскопирование до получения окончательного результата идентификации (как правило, в течение 5 сут.).
Для идентификации используют сыворотки к полиовирусам типа 1, 2 и 3 и смеси иммунных к энтеровирусам сывороток, которые распространяются ВОЗ для лабораторий, включённых в глобальную лабораторную сеть по диагностике полиомиелита. Могут также быть использованы сыворотки к полиовирусам типа 1, 2 и 3 и к НПЭВ, зарегистрированные и разрешённые в Российской Федерации к применению в установленном порядке. Подготовку рабочих разведений сывороток/смесей сывороток проводят в соответствии с инструкциями производителя.
Проведение теста микронейтрализации, интерпретацию результатов выполняют в соответствии с нормативными и методическими документами (прилож. 1).
14
МУК 4.2.2357—08
Типирование выделенного вируса проводят на той культуре, на которой он выделен. Если вирус выделен и на клетках RD, и на клетках L20B, проводят идентификацию на обеих культурах, при этом в первую очередь исследуют штамм, выделенный на L20B, для быстрого получения наиболее важного результата.
Если не удается определить серотип НПЭВ в реакции нейтрализации, то может быть выполнено частичное секвенирование участка генома VP1 этого штамма.
Выделенные штаммы полиовирусов в течение 7 дней после идентификации с нарочным или экспресс-почтой направляют в НЦ для проведения ВТД. Если при проведении идентификации на разных культурах клеток были получены одинаковые результаты, то в НЦ отправляют изолят, выделенный на какой-то одной культуре (предпочтение отдаётся культуре RD). При выявлении смеси полиовирусов в НЦ отправляют разделённые штаммы для подтверждения результатов и ВТД.
Если выделенные штаммы НПЭВ не были идентифицированы, то в течение 14 дней они должны быть отправлены для идентификации в РЦ или в НЦ (по договорённости). В РЦ или НЦ (по договорённости) отправляют также 5—10 идентифицированных штаммов в год для подтверждения результатов идентификации. При выявлении смеси полиовируса и НПЭВ в НЦ отправляют разделённые штаммы для подтверждения результатов и ВТД полиовируса.
7.1.3. Внутритиповая дифференциация полиовирусов.
Внутритиповую дифференциацию полиовирусов выполняет НЦ, используя для этого два метода, рекомендованные и поддерживаемые реагентами ВОЗ:
1) иммуноферментного анализа с использованием перекрёстно адсорбированных антисывороток, разработанных в Национальном институте охраны здоровья и окружающей среды (Билтховен, Нидерланды);
2) диагностической ПЦР, разработанный в Центре по контролю за заболеваниями, США.
ВТД подлежат все штаммы полиовирусов, выделенные в любой вирусологической лаборатории из любых ООС. ВТД должна быть проведена в течение 14 дней от момента получения (или выделения и идентификации) штамма в НЦ.
В случае получения противоречивых результатов двух методов ВТД, указывающих на принадлежность штамма полиовируса к дикому, вакцинородственному, присутствие в пробе смеси дикого и вакцинного
15
БК 51.9 064
064 Организация и проведение вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие (неполно) энтеровирусы: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008.—28 с.
ISBN 978—5—7508—0870—О
1. Разработаны ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН (О. Е. Иванова, Т. П. Еремеева, С. Г. Дроздов,
М. И. Михайлов, О. Ю. Байкова, О. В. Юрашко); Федеральной службой но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Г. Ф. Лазикова, Е. Б. Ежлова); ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (Т. В. Воронцова, А. А. Ясинский, О. П. Чернявская) с учетом замечаний и предложений ФГУЗ «Цешр гигиены и эпидемиологии» в г. Москве, Ставропольском, Хабаровском краях. Омской, Свердловской областях; Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (от 3 апреля 2008 г. протокол № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенхо 4 мая 2008 г.
4. Введены впервые.
ББК 51.9
Редакторы Н. В. Кожока, Е. В. Николаева Технический редактор Г. И. Климова
Подписано в печать 30.11.09 Формаг 60x88/16 Печ. л. 1,75
Т ираж 500 экз. Заказ 87
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадховский пер., л 18/20
Орнгинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения
Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, тел./факс 952-50-89
© Роспотребнадзор, 2009 © Федеральный центр гмгмеыы и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009
МУК 4.2.2357—08
Содержание
1. Область применения............................................................................................4
2. Общие положения................................................................................................4
3. Организация вирусологических исследований материалов из объектов
окружающей среды на полиовирусы, другие (неполно) энтеровирусы..........5
4. Показания к применению вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы,
другие (неполио) энтеровирусы .........................................................................6
5. Правила сбора, маркировки, хранения и транспортирования
материалов для исследования............................................................................8
6. Обработка проб из объектов окружающей среды в лаборатории.................10
7. Порядок проведения лабораторных исследований.........................................11
8. Сроки хранения материалов, полученных из объектов окружающей
среды...................................................................................................................16
9. Обеспечение биологической безопасности при проведении вирусологических исследований материалов из объектов
окружающей среды на полиовирусы, другие (неполио) энтсровирусы........17
10. Интерпретация результатов, полученных при проведении вирусологических исследований материалов из объектов
окружающей среды на полиовирусы, другие (неполио) энтсровирусы.......18
Приложение 1. Нормативные и методические ссылки..........................................20
Приложение 2. Концентрирование проб сточных вод методом двухфазного
разделения.....................................................................................23
Приложение 3. Сбор проб воды с помощью пакетов с макропористым
стеклом и последующая обработка.........................................~..25
Приложение 4. Направление на вирусологическое исследование
материалов из объектов окружающей среды.............................27
Приложение 5. Список лабораторий Российской Федерации по
диагностике полиомиелита..........................................................28
3
МУК 4.2.2357—08
УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав, потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
4 мая 2008 г.
Дата введения: 1 августа 2008 г.
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Организация и проведение вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие (неполно) эитсровирусы
Методические указания _МУК 4.2.2357—08_
1.Область применения
1.1. Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений государственного санитарно-эпидемиологического надзора при реализации национального плана действий по поддержанию свободного от полиомиелита статуса Российской Федерации.
1.2. В методических указаниях определены требования к организации сбора, упаковки, хранения, транспортирования и проведения лабораторных исследований материалов из объектов окружающей среды, выполняемых в целях выявления циркуляции полиовирусов, других (неполно) энтеровирусов, а также для установления причин, факторов передачи инфекции при повышенной заболеваемости или при эпидемических вспышках заболеваний энтеровирусной этиологии.
1.3. Методические указания также могут быть использованы специалистами организаций, эксплуатирующих системы централизованного хозяйственно-бытового водоснабжения, системы канализования, в рамках осуществления производственного контроля.
2. Общие положения
2.1. Вирусологические исследования материалов из объектов окружающей среды (далее - ООС) на полиовирусы, другие (неполно) энте-
МУК 4.2.2357—08
ровирусы (далее - ПОЛИО/НПЭВ) являются одним из важнейших элементов системы эпидемиологического надзора за полиомиелитом и острыми вялыми параличами (далее - ПОЛИО/ОВГТ), другими энтерови-русными инфекциями, осуществляемого в рамках реализации национального плана действий по поддержанию свободного от полиомиелита статуса Российской Федерации.
2.2. Все процедуры по сбору, транспортированию, подготовке к исследованию и лабораторному исследованию материалов из ООС на полиовирусы, другие (неполно) энтеровирусы осуществляется в строгом соответствии с требованиями нормативных и методических документов (прилож. 1).
2.3. Выполнение требований методических указаний направлено на совершенствование эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП, эн-теровирусными инфекциями.
3. Организация вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие (неполно) эитеровирусы
3.1. Вирусологические исследования материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие НПЭВ проводят вирусологические лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъектах Российской Федерации, вирусологические лаборатории региональных центров эпидемиологического надзора за полиомиелитом и острыми вялыми параличами (в г. Москве, Хабаровском, Ставропольском краях, Свердловской, Омской областях, Санкт-Петербургском НИИЭМ им. Пастера (далее - РЦ), Приволжском и Дальневосточном региональных центрах по изучению энтеровирусных инфекций (Нижегородский, Хабаровский НИИЭМ), Национальном центре по лабораторной диагностике полиомиелита (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН) (далее - НЦ).
3.2. Указанные учреждения проводят отбор проб из ООС, подготовку их к исследованию, лабораторное исследование.
3.3. При выделении полиовирусов изоляты направляются для идентификации и внутритиповой дифференциации (далее - ВТД) в НЦ.
3.4. При выделении НПЭВ, следует выполнить их идентификацию (определение серотипа). НПЭВ с неустановленным серотипом следует отправить в РЦ или НЦ.
3.5. Вирусологическая лаборатория, которая не проводила идентификацию выделенного агента, проявившего цитопатический эффект (далее - ЦПЭ) на культуре клеток, должна отправить изолят в РЦ для исключения присутствия полиовируса.
5
МУК 4.2.2357—08
3.6. При обнаружении в исследуемом образце РНК энтеровирусов методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (далее -ОТ-ПЦР) следует провести идентификацию вируса.
3.7. Результаты исследования материалов из ООС передаются в учреждения, направившие их.
4. Показания к проведению вирусологических исследовании материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие (неполно) энтеровирусы
4.1. Планирование организации вирусологических исследований.
Вирусологические исследования материалов из ООС на полиовирусы, НПЭВ проводят в плановом порядке, внепланово и в рамках производственного контроля.
Плановые вирусологические исследования материалов из ООС осуществляют в течение определённого времени для получения информации о циркуляции полиовирусов, НПЭВ среди населения, если предполагается, что эффективность эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП недостаточна (или требуются дополнительные данные) и группа населения, в отношении которой предпринимается надзор, обладает одной из нижеперечисленных или несколькими особенностями:
• недостаточный охват иммунизацией;
• наличие сведений о недавней (или возможной) циркуляции в обследуемой группе населения дикого или вакцинородственного полиовируса;
• существование риска заноса дикого полиовируса из эндемичных (неблагополучных) по полиомиелиту стран (территорий).
Плановые исследования осуществляются в рамках эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП, энтеровирусными инфекциями, с научными целями.
Внеплановые вирусологические исследования материалов из ООС проводятся в случае непредвиденных изменений санитарно-эпидемиологической ситуации на определённой территории. Ими могут быть:
• установленный факт заноса дикого полиовируса или циркуляция вакцинородственного полиовируса;
• подъём заболеваемости населения энтеровирусными инфекциями;
• возникновение эпидемической вспышки энтеровирусной инфекции;
• авария или нарушения в системах водоснабжения или канализации, в результате которых может произойти интенсивное биологическое загрязнение поверхностных и подземных водоисточников, а также питьевой воды.
МУК 4.2.2357—08
Для проведения плановых и внеплановых исследований на полиовирусы, НПЭВ составляется план проведения этих исследований, который должен включать:
• продолжительность и сроки отбора проб из ООС;
• характеристику группы населения, в отношении которой предпринимается исследование (численность населения, сведения об иммунизации против полиомиелита);
• распределение ответственности за сбор, обработку, исследование проб из ООС;
• наличие нормативных и методических документов, материального обеспечения для проведения исследований, протоколов проведеЕшя исследований;
• наличие обученного персонала и контроля качественного проведения исследований;
• определение порядка отчётности о результатах исследования;
• определение возможностей для своевременной пересылки выделенных штаммов вирусов (или РНК-позитивных материалов) для дальнейшего изучения в установленном порядке.
Исследования материалов ООС в рамках производственного контроля проводится постоянно с целью санитарно-вирусологической оценки производственных (технологических) процессов.
4.2. Объекты вирусологических исследований, места отбора, продолжительность исследований.
При проведении плановых исследований объектами исследований являются сточные воды, происходящие от той группы населения, в отношении которой предпринимается надзор. Места отбора проб выбираются вместе с представителями инженерной службы. В соответствии с целями исследования исследуют неочищенные сточные воды, при этом следует исключить стоки, которые могут быть загрязнены производственными отходами.
Большой объём сточных вод, поступающих на очистные сооружения или в канализационный коллектор, может снизить чувствительность обследования вследствие фактора разбавления. Поэтому в больших городах можно разбить обследуемое население на группы и обследовать небольшие фрагменты этих групп.
При проведении плановых исследований в соответствии с целями исследования также могут быть обследованы:
• сточные воды на этапах очистки и обеззараживания;
• вода поверхностных водоёмов, которые используются дтя целей рекреации, в качестве источников хозяйственно-питьевого водоснабжения;
7
МУК 4.2.2357—08
• вода плавательных бассейнов;
• питьевая вода на различных этапах водоподготовки.
Продолжительность плановых исследований обычно составляет не
менее 1 года, оптимальным сроком следует считать 3 года. Кратность сбора - 4 пробы в месяц, но не менее 2-х проб.
При проведении внеплановых исследований продолжительность исследования может быть более короткой, но кратность сбора проб должна быть увеличена, а выбор обследуемой группы населения - максимально точный.
Если исследования сточных вод обусловлены известной или подозреваемой реинтродукцией дикого полиовируса или появлением случаев полиомиелита, вызванных вакцинородственкым полиовирусом (или случайной его детекцией), продолжительность исследования должна быть не менее 1 года, кратность отбора проб - не менее 4-х раз в месяц, а выбор целевой группы - максимально «прицельный».
Исследования в рамках производственного контроля проводятся в соответствии с рабочей программой и нормативными документами.
При планировании и организации любых исследований следует руководствоваться нормативными и методическими документами (прилож. 1).
5. Правила сбора, маркировки, хранения и транспортирования материалов для исследования
Существуют два принципа отбора проб материалов из ООО для исследований на полиовирусы, НЛЭВ:
• одномоментный, при котором отбирают определенный объем воды в определённое время, или, что предпочтительнее, серию проб определённого объёма отбирают в разное, заранее намеченное время, чтобы затем составить смешанную пробу. Пробы, отобранные одномоментным способом подвергают последующему концентрированию с использованием фильтрующих мембран, ионообменных смол, с помощью метода двухфазного разделения (прилож. 2);
• «адсорбционный», при котором в ток воды на определённое время помещают адсорбирующий материал, а затем проводят элюцию вирусных частиц с адсорбента (метод Риордана, концентрирование на макропористом стекле) (прилож. 3).
Сотрудник, производящий отбор проб сточной воды, должен быть иммунизирован против полиомиелита. Если по техническим соображениям отбор проб выполняет сотрудник инженерно-технических служб, он также должен быть иммунизирован против полиомиелита.
8
МУК 4.2.2357—08
Отбор проб производят только в защитной одежде - халате, закрытой обуви, резиновых перчатках. Для отбора проб воды одномоментным способом используют предназначенную для этих целей стерильную одноразовую посуду или стерильные емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не оказывающих инактивирующего действия на вирусы. Ёмкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками или, что более предпочтительно, навинчивающимися крышками. Крышки должны надежно предохранять содержимое емкости от протечек. При отборе проб адсорбционным методом пакет с адсорбентом помещают в плотный пластиковый мешок, не допускающий протечек.
Немедленно после отбора поверхность емкости, в которую была отобрана проба, протирают дезинфектантом, маркируют, помещают в термоконтейнеры/термосы, обеспечивающие температурный режим 4—8 °С и доставляют в лабораторию. Пробу сопровождают актом отбора проб с указанием места отбора, даты и времени отбора.
После доставки проб в лабораторию термоконтейнер (термос) распаковывают в отведённой для этого зоне, соблюдая правила биологической безопасности. В зоне, где происходит распаковка, должны иметься ёмкость для мусора, тампоны, смоченные 70 %-м раствором этилового спирта, биологическое защитное укрытие (далее - БЗУ) 2 класса защиты (или рабочий стол с покрытием, которое легко подвергается обработке лабораторными дезинфектантами).
Распаковка и регистрация материалов осуществляется двумя сотрудниками - один регистрирует поступившие материалы в рабочем журнале, другой открывает упаковку, проверяет целость ёмкостей с материалом, отсутствие протечек, полноту сопроводительных документов. В этот момент фиксируется состояние присланных проб - отсутствие протечек, соблюдение температурного режима, полнота документации.
Каждой пробе присваивают идентификационный номер, под которым она регистрируется в лабораторном журнале. Далее этим номером помечают все ёмкости (центрифужные пробирки, флаконы/пробирки с культурой клеток и пр.), относящиеся к данной пробе в процессе её исследования и хранения в данной лаборатории.
Обработку проб следует начать незамедлительно после доставки в лабораторию. Если обработка будет начата в течение 48 ч, пробы можно поместить в холодильник (0—8°С). Если исследование будет начато позже, пробы, отобранные одномоментным методом, хранят при температуре -20 °С. Пробы, собранные адсорбционным методом, рекомендуется подготовить для исследования в течение 48 ч. В любом случае следует помнить, что исследование ООС предпринимается для получения
9
