Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

19 страниц

258.00 ₽

Купить МР 4.2.0089-14 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Методические рекомендации предназначены для специалистов лабораторий, осуществляющих диагностические, мониторинговые и научные исследования с возбудителями опасных инфекционных болезней. Методические рекомендации по использованию метода масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией для идентификации возбудителей чумы, холеры и туляремии включают описание применения масс-спектрометрии для видовой идентификации микроорганизмов - возбудителей опасных инфекционных заболеваний. Описание охватывает такие разделы, как культивирование исследуемых штаммов, получение из них белковых препаратов, снятие спектров, дополнение базы данных референсных спектров, проведение идентификации с использованием расширенной базы данных, интерпретацию полученных результатов, приводится список используемых реактивов и расходных материалов.

 Скачать PDF

Оглавление

1. Область применения

2. Общие положения

3. Требования к организации работ

4. Культивирование микроорганизмов

     4.1. Культивирование возбудителя чумы

     4.2. Культивирование возбудителя холеры

     4.3. Культивирование возбудителя туляремии

     4.4. Культивирование возбудителя сибирской язвы

5. Подготовка проб для масс-спектрометрии

     5.1. Экстракция белков .с использованием муравьиной кислоты

     5.2. Экстракция белков с использованием трифторуксусной кислоты

     5.3. Прямое нанесение образцов на мишень

6. Проведение MALDI-ToF масс-спектрометрии

7. Учет и интерпретация результатов

8. Дополнение базы данных программ

Приложение 1. Среды, используемые для культивирования возбудителей чумы, холеры, туляремии, сибирской язвы

Приложение 2. Оборудование и программное обеспечение для проведения исследований методом MALDI-ToF масс-спектрометрии

Приложение 3. Реактивы для проведения исследований методом MALDI-ToF масс-спектрометрии

Приложение 4. Расходные материалы для проведения исследований методом MALDI-ToF масс-спектрометрии

Приложение 5. Приготовление рабочих растворов для проведения исследований методом MALDI-ToF масс-спектрометрии

Приложение 6. Очистка MALDI-чипа (мишени)

Библиография

 
Дата введения24.04.2014
Добавлен в базу12.02.2016
Актуализация01.01.2021

Этот документ находится в:

Организации:

24.04.2014УтвержденГлавный государственный санитарный врач Российской Федерации
РазработанФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии
РазработанФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт Микроб
РазработанФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока
РазработанФедеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
РазработанФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
ИзданБюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора2015 г. (2 (60))
РазработанФКУЗ Ростовский научно-исследовательский противочумный институт
Нормативные ссылки:
Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека


Государственная система санитарно- эпидемиологического нормирования Российской Федерации


НОРМАТИВНЫХ И МЕТОДИЧЕСКИХ ДОКУМЕНТОВ

ФФИШАЛьт.ФЕ

l■■■■■■ll■■llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

м@@к1м=8®да


БЮЛЛЕТЕНЬ

УЧРЕДИТЕЛЬ

Федеральное бюджетное учреждение ирааоохранения •Федеральный центр гигиены н эпидемиологии* Федеральной службы по надзору в сфере дошиты прав потребителей н благополучия человека

РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ Главный редактор Г. Г. Онищенко Е. Н. Беляев.

А. И. Верещагин.

Л. П. Гульченко.

С. И. Иванов.

Г. Ф.Лазикова.

С. С Перель.

Г. С. Перминова.

МП. Шевырева.

Н. В. Шестопалов

РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ

A.    X Агиров (Майкоп),

Г. В. Айдинов (Ростов-на-Дону).

B.    А. Алешкин (Москва).

А. А. Баранов (Москва).

Н. Н. Верещагин (Оренбург).

A.    Л. Гинибург (Москва).

B.    В. Губернаторова (Иваново).

B.    И. Евдокимов (Белгород),

Н. А. Забродин (Ижевск).

A.    И. Зайченко (Москва).

Н. Ф. И змеров (Москва).

О. Л. Гавриленко (Московская область). И В. Корабельников (Сыктывкар).

C.    В. Куркатов (Красноярск),

Г. И. Куценко (Москва).

B.    Р. Кучма (Москва).

Б. В. Лимин (Вологда).

Г. Д. Минин (Уфа).

Б. И. Никонов (Екатеринбург),

B.    И. Покровский (Москва).

A.    И. Потапов (Москва),

Ю.А. Рахманин (Москва).

C.    И. Савельев (Липецк),

И. П. Салдан (Барнаул).

B.    Р. Саухат (Магадан),

В. П. Сергиев (Москва),

В. А. Тутельян (Москва).

Н. Н. Филатов (Москва).

В. П. Чашин (Санкт-Петербург).

М. И. Чубирко (Воронеж).

М.Г. Шандала (Москва)

НОРМАТИВНЫХ И МЕТОДИЧЕСКИХ ДОКУМЕНТОВ

ГОССАНЭПИДНАДЗОРА

Выпуск 2 (60), июнь 2015

Издается с 2000 г.

НОРМАТИВНЫЕ

ПРАВОВЫЕ

АКТЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ

ДОКУМЕНТЫ

Зарсгнсгрирован Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскочнадюр)

Свидетельство о регистрации средства массовой информации от 24 января 2012 г. ПИ М ФС77-48297

Подписано в печать 11.06.15

Формат 60x84/8. уел. печ. л. 16.74, заказ N& 1486. тираж 500 экз.

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей

Подписка на Ькшетень нормативных и методических документов гоесан тиднадюра принимается во всех почтовых отделениях России. Подписной индекс в каталоге агентства «Роспечать» •Ганты. Журна-ш* 79682

и благополучия человека

127994, Москва, Вадковский пер., д. 18. стр. 5.7

Оригинал-макет подготовлен к печати отделом издательского обеспечения

Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105. Москва. Варшавское ш., 19а

.Адрес редакции:

117105. Москва. Варшавское ш.. 19а Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора

Отделение реализации, тел./факс 8 (495) 952-5089 E-mail: edit^fcgie.rv

© Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2015

СОДЕРЖАНИЕ


НОРМАТИВНЫЕ ПРАВОВЫЕ АКТЫ


Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев):

СП 2.2.1.3218-14...............................................

Санитарно-эпидемиологические требования к размещению, устройству оборудованию, содержанию и режиму работы бань и саун:

СанПиН 2.1.2.3150-13...........................................

Предельно допустимые концентрации (ПДК) 0-(1,2,2-триметилпропил)-метилфторфосфоната (зомана) и О-изопропилметилфторфосфоната (зарина) в отходах после печей (золе) объектов по уничтожению химического оружия: ГН 2.1.7.3199—14.....................................

Предельно допустимые концентрации (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест: Изм. в ГН 2.1.6.1338—03. Утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача от 12.01.2015 № 3...........................................

Предельно допустимая концентрация (ПДК) 0-изобутил-Р-1М-диэтил-аминоэтшггиолового эфира метилфосфоновой кислоты (вещества типа Vx) в воздухе рабочей зоны (включая аэрозоль дезинтеграции строительных материалов) при выводе объектов по уничтожению химического оружия из эксплуатации: ГН 2.2.5.3224—14.................................

Ориентировочный допустимый уровень (ОДУ) метилфосфоновой кислоты в воле водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования: ГН 2.1.5.3225-14 .................................

Предельно допустимый уровень (ПДУ) загрязнения О-изобутил-р-М-ди-этиламиноэтилтиоловым эфиром метилфосфоновой кислоты (веществом типа Vx) впитывающих и невпитываюших поверхностей технологического оборудования, подлежащего персмсщению/транспортировке за пределы объекта по уничтожению химического оружия, и строительных конструкций: ГН 2.2.5.3226-14 ............................................

Предельно допустимая концентрация (ПДК) метилфосфоновой кислоты в отходах строительных конструкций, включая отходы после термического обезвреживания: ГН 2.1.7.3227—14..............................

Предельно допустимый уровень (ПДУ) загрязнения 0-изобутил-Р-?^-ди-этила.миноэтилтиотовым эфиром метилфосфоновой кислоты (веществом типа Vx) поверхности металоотходов. прошедших термообезвреживание: ГН 2.1.7.3228-14........................................

Предельно допустимый уровень (ПДУ) загрязнения поверхности технологического оборудования О-изобутил-р-К-диэтиламиноэтил-тиоловым эфиром метилфосфоновой кислоты (веществом типа Vx):

ГН 2.2.5.3229-14................................................


J.

15


23


27


31

35


39

43


47



МЕТОДИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ


Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матричноактивированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDl-ToF MS) для индикации и идентификации возбудителей 1—II групп патогенности: МР 4.2.0089-14.................................................

Использование методов полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (рибопринтинг, электрофорез в пульсирующем поле) для идентификации

возбудителей I—II групп патогенности: МР 4.2.0090—14................

Расчет фактических и предотвращенных в результате контрольнонадзорной деятельности экономических потерь от смертности, заболеваемости и инвалндизаини населения, ассоциированных с негативным воздействием факторов среды обитания: МР 5.1.0095—14...............


55

71


93


4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) для индикации и идентификации возбудителей I—II групп патогенности


Методические рекомендации МР 4.2.0089—14


МЕТОДИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

1.    Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (Ю. В. Демина, Н. В. Шеенков): ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (В. Е. Куклсв, Н. А. Осина, А. В. Осин. И. Н. Шарова, С. А. Портенко.

A.    Н. Спицын, Д. В. Уткин, Н. С. Червякова, А. С. Абдрашитова, С. А. Щербакова): ФКУЗ «Росгов-ский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» (С. В. Титова. О. С. Чсмисова,

B.    В. Агафонова, С. О. Чайка, И. А. Чайка, О. А. Рыковская. И. А. Молдаван. Н. В. Павлович, М. В. Цимбал истова): ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» (С. В. Балахонов. М. В. Чеснокова, М. В. Афанасьев. Л. В. Миронова,

C.    А. Татарников. Е. Г. Токмакова, Г. В. Вдовиченко. А. С. Остяк, М. Б. Ярыгина. Е. А. Басов): ФБУН «Государственный научный цетр прикладной микробиологи и бнотсхнолопш» (И. А. Дятлов, Е. А. Тюрин, Л. В. Чекан, К. В. Детушев, А. Е. Хомяков); ФКУЗ «Волю: раде кий научно-исследовательский противочумный институт» (В. А. Актонов, Г. А. Ткаченко, С. С. Савченко, В. В. Алексеева,

О. В. Зинченко, И. М. Шпак. М. А. Гришина, Н. В. Вьючнова. О. С. Ульянова, Д. В. Викторов).

2.    Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты нрав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 24 апреля 2014 г.

3.    Введены впервые

56

МЕТОДИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Содержание

1.    Область применения.............................................................................................................................S8

2.    Общие положения.................................................................................................................................58

3.    Требования к организации работ........................................................................................................59

4.    Культивирование микроорганизмов—...................... 60

4.1.    Культивирование возбудителя чумы.................................................................................60

4.2.    Культивирование возбудителя холеры..............................................................................60

4.3.    Культивирование возбудителя туляремии........................................................................61

4.4.    Культивирование возбудителя сибирской язвы...............................................................61

5.    Подготовка проб для масс-спсюрометрии........................................................................................61

5.1.    Экстракция белков с использованием муравьиной кислоты...........................................61

5.2.    Экстракция белков с использованием трифторуксусной    кислоты.................................62

5.3.    Прямое нанесение образцов на мишень............................................................................62

6.    Проведение MALDI-ToF масс-спектрометрии.................................................................................63

7.    Учет и интерпретация результатов.....................................................................................................63

8.    Дополнение базы данных программ_____________________________________________________________________________________________63

Приложение 1. Среды, используемые для культивирования возбудителей чумы.

холеры, туляремии, сибирской язвы...................................................................65

Приложение 2. Оборудование и программное обеспечение для проведения

исследований методом MALDI-ToF масс-спектрометрии................................66

Приложение 3. Реактивы для проведения исследований методом MALDI-ToF

масс-спектрометрии..............................................................................................67

Приложение 4. Расходные материалы для проведения исследований методом

MALDI-ToF масс-спектрометрии........................................................................67

Приложение 5. Приготовление рабочих растворов для проведения исследований

методом MALDI-ToF масс-спектрометрии........................................................68

Приложение 6. Очистка MALDI-чипа (мишени)........................................................................69

Библиография............................................................................................................................................70

57

МЕТОДИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

24 апреля 2014 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) для индикации и идентификации возбудителей I—II групп патогенности

Методические рекомендации МР 4.2.0089—14

1. Область применения

Настоящие методические рекомендации предназначены для специалистов лабораторий, осуществляющих диагностические, мониторинговые и научные исследования с возбудителями опасных инфекционных болезней.

Методические рекомендации по использованию метода масс-спсктромстрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией для идентификации возбудителей чумы, холеры и туляремии включают описание применения масс-спектрометрии для видовой идентификации микроорганизмов - возбудителей опасных инфекционных заболеваний. Описание охватывает такие разделы, как культивирование исследуемых штаммов, получение из них белковых препаратов, снятие спектров, дополнение базы данных референсных спектров, проведение идентификации с использованием расширенной базы данных, интерпретацию полученных результатов, приводится список используемых реактивов и расходных материалов.

2. Общие положения

Масс-спсктрометричсский анализ (МС-анализ) является аналитической процедурой, физическим методом исследования, в процессе которого осуществляется измерение отношения массы заряженных частиц материи (ионов) к их заряду. Полученный результат - спектральный сигнал - представляет собой рассортировку заряженных частиц по значению отношения молекулярной массы иона к его заряду.

Первоначально, с момента разработки, МС-анализ применялся в основном в аналитической и биологической химии и физике для изучения химического и изотопного состава веществ, в том числе и многокомпонентных, сложных биополимеров, их структуры и химических модификаций.

Для исследования применяется прибор - масс-спектрометр. Несмотря на большое количество различных моделей инструментов для МС-анализа, любой при-

58

МЕТОДИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

бор включает три компонента: источник ионов (ионизатор), систему разделения ионов и систему детекции ионов. Ионизатор переводит исследуемый образец в ионизированную форму. Существует большое количество систем ионизации, ее выбор зависит от типа исследуемых молекул, агрегатного состояния образца (твердого, жидкого, газообразного). Далее ионизированные компоненты образца оказываются в системе разделения ионов, которая, используя различные физические механизмы, ранжирует их по значению отношения массы иона к заряду. Детектор регистрирует образовавшиеся и рассортированные ионы, позволяя генерировать визуальный спектр, на котором в виде пиков различной интенсивности представлены отношения массы иона к заряду всех ионизированных компонентов исследуемого образца.

Последнее десятилетие ознаменовалось активным внедрением одного из видов МС-анализа, метода матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (англ. Matrix Assisted Laser Desorption/lonization, MALDI) с врсмяпролстным разделением (англ. Time of Flight, ToF) ионов (MALDI-ToF-MS), в клиническую микробиологию для идентификации микроорганизмов. MALDI - метод мягкой ионизации, позволяющий ионизировать биологические макромолекулы (пептиды, белки, ДНК, олигонуклеотиды, липополисахариды и сахара) в присутствии особого вещества, «матрицы», под воздействием лазера. Полученные ионы, преимущественно однозарядные, ранжируются во врсмяпролстной системе разделения за счет разной скорости перемещения, обратно пропорциональной массе иона. Зная длину пути перемещения иона от ионизатора до детектора, а также время этого перемещения, можно вычислить скорость движения иона и на основании сс значения рассчитать массу частицы.

Использование в качестве исследуемого образца чистой культуры микроорганизма или его экстрактов позволяет получить спектр, характеризующий качественный молекулярный состав исследуемого объекта. Получаемый спектральный паттерн является уникальной видо-, а в некоторых случаях и штаммоспецифичной характеристикой, позволяющей однозначно идентифицировать микроорганизм до вида, а в некоторых случаях осуществить и внутривидовую дифференциацию или определить дополнительные свойства микроорганизма, в том числе и клинически значимые.

Собранные в процессе анализа спектры исследуемых микроорганизмов могут сравниваться с рсфсрснсными спектрами, присутствующими в базе данных, поставляемых производителями вместе с оборудованием для MALDI-ToF MS. При определенном проценте совпадений выводится результат о таксономической принадлежности исследуемого объекта.

3. Требования к организации работ

Работу в микробиологической лаборатории с пробами материалов, содержащих возбудителей опасных инфекционных болезней бактериальной природы, на MALDI-ToF масс-спсктромстрс выполняют в соответствии с действующими нормативными и методическими документами.

Пробы, содержащие или подозрительные на содержание возбудителей опасных инфекционных болезней, подготавливают и обеззараживают в «заразной» зоне в боксах биологической безопасности II класса. Работу с подготовленными пробами осуществляют после их выноса из микробиологического бокса или из «заразной» зоны в зависимости оттого, где установлен MALDI-ToF масс-спектрометр. Средства индивидуальной защиты и тип дезинфицирующего раствора определяются кон-

кретным видом возбудителя, с которым проводятся работы, в соответствии с действующими нормативными и методическими документами.

Каждое структурное подразделение (лаборатория), проводящее работы по индикации возбудителей опасных инфекционных болезней на MALDI-ToF масс-спектрометре, должно иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о соответствии санитарно-эпидемиологическим правилам и нормативам при проведении работ с возбудителями опасных инфекционных болезней.

Исследования методом MALDI-ToF масс-спсктромстрии проводят в организациях, имеющих лицензию на деятельность, связанную с возбудителями инфекционных болезней, в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения данных работ, выданных в установленном порядке.

4. Культивирование микроорганизмов

Стандартная среда культивирования бактерий для MALDI-ToF MS анализа -кровяной агар (прилож. 1), содержащий 5 % овечьей крови.

Допускается исследование культур, полученных на других питательных средах, а также с различных фаз роста или выращенных при разных температурах. Следует помнить, что наилучшие результаты получаются при использовании условий (среда, фаза роста, температура), идентичных тем, что были использованы для культивирования образцов, использованных для создания референсных единиц базы данных.

Для масс-спектрометрического анализа необходимо использовать только чистые культуры или изолированные колонии микроорганизмов, выращенных с соблюдением условий, специфических для каждого патогена. В случае работы с медленнорастущими микроорганизмами допускается использование культур, выращиваемых более суток. Если в исследуемом образце содержатся микроорганизмы более чем одного вида, то идентификация пройдет некорректно.

Все манипуляции с живыми ПБА I—II групп проводятся в боксах биологической безопасности II В класса, с ПБА III—IV групп - в боксах биологической безопасности II А класса.

При выполнении работ необходимо руководствоваться действующими нормативными правовыми и методическими документами, регламентирующими требования биологической безопасности при проведении работ с возбудителями инфекционных заболеваний, а также иными документами и внутренними инструкциями, разработанными и согласованными с органом по контролю соблюдения требований биологической безопасности учреждения, утвержденными руководителем, регламентирующими работу с возбудителями I—IV группы патогенности.

4.1. Культивирование возбудителя чумы

Для исследования используют чистые культуры суточного роста. Исследуемые штаммы Y pestis выращивают на питательном агаре для культивирования микроорганизмов общего назначения, pH 7,2 (прилож. 1), в течение 24 ч при температуре 28 °С. Полученные суточные культуры используют для приготовления образцов для масс-спектрометрии. Культуры возбудителя чумы подвергают предварительной экстракции белка перед нанесением на чип (мишень).

4.2. Культивирование возбудителя холеры

Культуры, выросшие на щелочном агаре (pH 7,6) в течение 18—24 ч (прилож. 1), проверяют в ориентировочной слайд-агглютинации с холерными сыво-

МЕТОДИЧЕCKWEJWJW

ротками Ol в развслении 1 : 100, РО и 0139 в разведении 1 : 50. Культуры, агглютинирующиеся одной из ссрогруппоспецифических сывороток, исследуют масс-спсктромстричсски с предварительной экстракцией белка, нс агглютинирующиеся -прямым нанесением на MSP-чип.

4.3. Культивирование возбудителя туляремии

Культивирование проводят на чашках с FT-агаром (прилож. 1) в течение 72 ч при температуре 37 °С. Культуры возбудителя для масс-спсктромстричсского исследования подвергают предварительной экстракции белка перед нанесением на чип (мишень).

4.4. Культивирование возбудителя сибирской язвы

Культивирование проводят на чашках с агаром Хоттингсра (pH 7,2) в течение 24 ч при температуре 37 °С (прилож. 1). Культуры возбудителя для масс-спсктромстричсского исследования подвергают предварительной экстракции белка перед нанесением на чип (мишень).

5. Подготовка проб для масс-спектрометрии 5.1. Экстракция белков с использованием муравьиной кислоты

Данный метод применяют для возбудителей I—II групп патогенности (за исключением спорообразующих микроорганизмов, дрожжей, грибов) - возбудителей чумы, туляремии и холеры, агглютинирующих с одной из указанных ссрогруппос-псцифичсских сывороток.

Проведение экстракции:

1.    Готовят и маркируют необходимое число микропробирок, соответствующее числу исследуемых штаммов.

2.    В каждую пробирку вносят 300 мкл деионизованной воды.

3.    Микробиологической петлей диаметром 1 мм в пробирку вносят одну изолированную колонию возбудителя и плавными движениями суспендируют.

4.    К суспензии добавляют 900 мкл 96 %-го этилового спирта.

5.    Полученную смесь тщательно перемешивают на микроцентрифуге-вор-

тсксе.

6.    После перемешивания пробирки помешают в центрифугу (необходимо сохранять ориентацию пробирок после помещения их в ротор) и цстрифугируют в течение 2 мин при 13 тыс. об./мин.

7.    Полученный супернатант аккуратно, не задевая осадка, отбирают одноразовым наконечником и сливают в емкость с дезинфицирующим раствором.

8.    Этапы 6 и 7 повторяют для удаления остатков раствора этанола.

9.    К осадку добавляют 25 мкл 70 %-го водного раствора муравьиной кислоты, полученную смесь тщательно перемешивают пилотированием или на микроцентри-фугс-вортексс (объем муравьиной кислоты зависит от первоначального количества культуры, взятой в исследование, и может варьировать от 1 до 80 мкл).

10.    К суспензии добавляют равный объем ацетонитрила и смесь повторно тщательно перемешивают.

11.    После перемешивания пробирки помещают в центрифугу (необходимо сохранять ориентацию пробирок после помещения их в ротор) и центрифугируют в течение 2 мин при 13 тыс. об./мин.

61