Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Оценка воздействия наноматериалов на протеомный профиль и биосинтетические процессы в тестах на лабораторных животных

Методические рекомендации МР 1.2.0053-11

ББК 51.2 093

093 Оценка воздействия наноматериалов на протеомный профиль и биосинтетические процессы в тестах на лабораторных животных: Методические рекомендации.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора,

2012.-44 с.

ISBN 978—5—7508—1093—2

1.    Разработаны Учреждением Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт питания» РАМН (В. А. Тутельян,

И. В. Гмошинский, С. А. Хотимченко, М. М. Гаппаров, В. В. Бессонов,

А. В. Васильев, Е. А. Арианова, О. Н. Тананова, А. А. Шумакова, Р. В. Распопов, В. А. Шипелин, О. И. Передеряев, Н. Э. Шаранова); Учреждением Российской академии наук «Институт биохимии им. А. Н. Баха» РАН (В. О. Попов, Б. Б. Дзантиев, А. В. Жердев); Федеральным бюджетным учреждением науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (И. А. Дятлов, В. П. Холоденко, В. В. Фир-стова); Учреждением Российской академии наук «Центр «Биоинженерия» РАН» (К. Г. Скрябин).

2.    Разработаны в рамках Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008—2011 годы».

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 29 декабря 2011 г.

4.    Введены в действие 29 декабря 2011 г.

5.    Введены впервые.

ББК 51.2

© Роспотребнадзор, 2012 © Федеральный центр гигиены

и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2012

MP 1.2.0053-11

3.40.    ГОСТ 26678-85 «Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия».

3.41.    ГОСТ 3-88 «Перчатки хирургические резиновые. Технические условия».

3.42.    ГОСТ 4568-95 «Калий хлористый. Технические условия».

3.43.    ГОСТ 61-75 «Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия».

3.44.    ГОСТ 83-79 «Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия».

3.45.    ГОСТ 1277-75 «Реактивы. Серебро азотно-кислое. Технические условия».

3.46.    ГОСТ 14261-77 «Кислота соляная особой чистоты. Технические условия».

3.47.    ГОСТ 7.32-2001 «Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления».

3.48.    ГОСТ Р ИСО/МЗК 17025-2006 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий».

IV. Общие положения

4.1.    Целью оценки воздействия наноматериалов на протеом-ный профиль и биосинтетические процессы является:

-    установление возможного воздействия наночастиц и наноматериалов на генетический аппарат клетки, экспрессию генов, процессы транскрипции и трансляции, посттрансляционной модификации клеточных белков;

-    установление зависимости доза-эффект, возможных эффектов кумуляции наночастиц в организмах животных;

-    токсиколого-гигиеническая и медико-биологическая оценка безопасности наночастиц и наноматериалов;

-    гигиеническое нормирование содержания наноматериалов в объектах окружающей среды и потребительской продукции;

-    экспертиза наночастиц и наноматериалов, производимых на территории Российской Федерации или ввозимой на территорию Российской Федерации;

-    оценка риска для здоровья населения при поступлении наноматериалов в организм с пищей, водой, атмосферным воздухом и иными путями;

-    разработка мероприятий по охране окружающей среды от воздействия наночастиц и наноматериалов.

4.2.    Оценка воздействия наноматериалов на протеомный профиль и биосинтетические процессы проводится в биосубстратах

11

(цельных гомогенатах клеток, клеточных фракциях, отдельных ор-ганеллах, препаратах биологических мембран, экскретах и секретах, межклеточных жидкостях), полученных от биологических тест-систем различного уровня (культуры клеток микроорганизмов и высших многоклеточных организмов, растения, беспозвоночные, рыбы, млекопитающие), подвергнутых воздействию наночастиц и наноматериалов однократно или длительно (многократно) в контролируемых условиях эксперимента.

4.3.    Выбор биологического объекта воздействия наночастиц и наноматериалов, принципы выбора действующих доз, пути, длительность и кратность введения наночастиц и наноматериалов, состав опытных и контрольных ipynn тестируемых организмов устанавливаются для отдельных тест-систем в соответствии с МУ 1.2.2520—-09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов», МР 1.2.2566—09 «Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo», МУ 1.2.2634—10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза», МУ 1.2. 2635—10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов», МУ 1.2.2869—11 «Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных».

4.4.    Отбор проб биологических объектов (органы и ткани животных и растений, подвергшихся воздействию наночастиц и наноматериалов) для проведения протеомного анализа осуществляется (для соответствующих групп организмов) в соответствии с МУ 1.2.2745—10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных», МУ 1.2.2744—10 «Порядок отбора проб для выявления, идентификации и характеристики действия наноматериалов в рыбах», МУ 1.2. 2740—10 «Порядок отбора проб для выявления, идентификации и характеристики действия наноматериалов в водных беспозвоночных», МУ 1.2. 2741—10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных», МУ 1.2.2742—10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в растениях».

4.5.    При выборе объекта исследования (биосубстрата) для оценки влияния наночастиц и наноматериалов на протеомный профиль и биосинтетические процессы учитывается:

4.5.1) общее содержание белка в биосубстрате, которое должно быть достаточно высоким (не менее 10 % по массе сухих веществ) и воспроизводимым в условиях тестирования; отсутствие больших количеств веществ, препятствующих электрофоретиче-

12

MP 1.2.0053-11

скому разделению (минеральных солей, сильных электролитов, синтетических ПАВ);

4.5.2)    фракционный состав белка, в том числе разнообразие белкового состава и отсутствие доминантных белковых фракций, составляющих более 10 % по массе общего белка биосубстрата; в случае присутствия таких белков должны иметься подходящие методы их удаления из образца с использованием фракционирования солями или органическими растворителями, хроматографии, иммуносорбции и другими;

4.5.3)    наличие предварительных данных о токсических эффектах и (или) накоплении наночастиц исследуемого вида в организмах, органах и тканях, являющихся источниками получения биосубстратов для протеомного анализа.

Одним из объектов исследования, удовлетворяющих в полной мере вышеперечисленным критериям, является микросомальная фракция клеток печени лабораторных животных (крыс, мышей и др.), подвергнутых воздействию наночастиц и наноматериалов при различных путях их поступления (пероральном, ингаляционном, интратрахеальном, накожном, парентеральном).

4.6.    Организация (лаборатория), проводящая исследования по изучению влияния наночастиц и наноматериалов на протеом-ный профиль биосубстратов и биосинтетические процессы, должна быть аккредитована на проведение работ в соответствующей области. В лаборатории должны соблюдаться правила надлежащей лабораторной практики в соответствии с приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. N° 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики»,

4.7.    В организации (лаборатории), проводящей исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на протеомный профиль биосубстратов и биосинтетические процессы, должна быть разработана программа по обеспечению качества проводимых исследований. Все производственные операции проводятся в соответствии со стандартными операционными процедурами (СОП), осуществляемыми в целях обеспечения качества, достоверности и воспроизводимости результатов исследования.

4.8.    Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на протеомный профиль биосубстратов и биосинтетические процессы, должны быть укомплектованы необходимым оборудованием и средствами измерений, прошедшими поверку (калибровку) в установленном порядке. Эксплуатация оборудования и средств измерений проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения поверки (калибровки) и те-

MP 1.2.0053—11

кущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание. Применяются средства измерений, имеющие сертификат и зарегистрированные в Государственном реестре средств измерений.

4.9.    Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на протеомный профиль биосубстратов и биосинтетические процессы, должны иметь помещения для содержания и работы с лабораторными животными (виварий, клиники лабораторных животных), требования к которым изложены в МУ 1.2.2869—11 «Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных».

4.10.    Организации (лаборатории) проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на протеомный профиль биосубстратов и биосинтетические процессы, должны иметь специально оборудованные помещения для работы с биологическим материалом (препарирование, пробоподготовка), отдельные чистые помещения для проведения протеомного анализа (электрофорез, окрашивание гелей, экстракция белковых пятен, трип-синолиз). Для обработки материала, содержащего ультрамалые количества белков и пептидов, должны быть установлены ламинарные шкафы, обеспечивающие горизонтальный поток воздуха, а также возможность работы без ламинарного потока и длительную экспозицию облучения внутренних поверхностей ультрафиолетовым светом.

4.11.    Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на протеомный профиль биосубстратов и биосинтетические процессы, должны иметь оборудование, обеспечивающее безопасность работы с наноматериалами неорганического и биогенного происхождения: ламинарные вытяжные шкафы, перчаточные боксы, снабжённые системой вентиляции (НЕРА-фильтры), препятствующие поступлению аэрозоля наноматериалов в воздух производственных помещений и в окружающую среду.

4.12.    Документом, подтверждающим результаты проведённых исследований наноматериалов, является отчёт о проведённом исследовании. Отчет содержит следующие сведения:

—    название исследования;

—    адрес организации;

—    даты начала и завершения исследований;

—    цель и задачи исследования;

—    характеристика тестируемого наноматериала;

—    перечень исследованных биологических образцов и применяемых стандартных образцов;

14

MP 1.2.0053-11

-    вид, линию, пол и возраст используемых лабораторных животных;

-    состав применяемых рационов, условия содержания животных;

-    метод введения наночастиц и наноматериалов, применяемые дозы, длительность и кратность введения;

-    схема проведения исследования;

-    для растений — вид, линию используемых растений, условия выращивания, методы введения наночастиц и наноматериалов, применяемые дозы, длительность введения; схема проведения исследования;

-    для культур клеток — видовую принадлежность и номер (наименование) клеточной линии, состав культуральной среды, условия выращивания, действующие концентрации наноматериалов и препаратов, являющихся контрольными (положительный и отрицательный контроль);

-    перечень использованных средств измерений и вспомогательного оборудования и режимы их работы;

-    методы статистической обработки результатов;

-    результаты исследования, представленные в виде обобщающих таблиц, рисунков с соответствующей статистической обработкой и комментариев к ним;

-    заключение, выводы, список использованных источников.

Оформление отчёта о результатах исследования должно соответствовать требованиям ГОСТ 7.32-2001 «Отчёт о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления».

Отчет о результатах проведенного исследования утверждается руководителем организации и скрепляется печатью организации.

4.13. Организация (лаборатория), проводящая исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на протеомный профиль биосубстратов и биосинтетические процессы, должна обеспечить конфиденциальность результатов исследований в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации.

V. Методика изучения протеомного профиля и биосинтетических процессов в биосубстратах

5.1. Оборудование и материалы

5.1.1. Основное оборудование

Микроразмельчитель тканей «POLYMIX PX-SR50E», производства

15

«Kinematica AG», Германия, или другой с аналогичными параметрами

Ультрацентрифуга «Optima L-90K Ultracentriftige», производства «Beckman Coulter», США, или другая с аналогичными параметрами

Фотометр планшетный автоматический двухволновой «ЭФОС 9305», производства ОАО «М3 «Сапфир»,

Россия, с интерференционными светофильтрами на длину волны 590—620 нм, или другой с аналогичными параметрами

Масс-спектрометр Microflex MALDI TOF (производства BRUKER, США или другой с аналогичными параметрами)

Анализатор потенциометрический со стеклянным электродом для измерения pH    ГОСТ    27987-88

Измеритель pH комбинированный SevenEasy (производитель «Mettler Toledo», Швейцария) или другой с аналогичными параметрами

Центрифуга с охлаждением «3-18К», производства «Sigma», Германия, или другая с аналогичными параметрами

Насос вакуумный «Rotavac valve tec», производства «Heidolph», Германия, или другой с аналогичными параметрами

Ячейка «Protean II xi Cell», производства «Bio-Rad», США, или другая с аналогичными параметрами

Универсальный источник питания «PowerPactm HV Power Supply», производства «Bio-Rad», США, или другой с аналогичными параметрами

16

Ячейка «Protean IEF Cell», производства «Bio-Rad», США, или другая с аналогичными параметрами

Трей для фокусировки в ячейке Protean IEF Cell для стрипов 17см производства «Bio-Rad», США) или другой с аналогичными параметрами

Устройство перемешивающее «ПЭ-6410М», производства «Экрос», Россия, или другое с аналогичными параметрами

Камера «Protean II xi Multi-Gel Casting Chamber», производства «Bio-Rad», США, или другая с аналогичными параметрами

Насос перистальтический, производства «Heidolph», Германия, или другой с аналогичными параметрами

Ячейка «Protean II xi Multi-Cell», производства «Bio-Rad», США, или другая с аналогичными параметрами

Универсальный источник питания «PowerPactm Universal», производства «Bio-Rad», США, или другой с аналогичными параметрами

Камера для окраски «Dodeca ТМ Stainer», производства «Bio-Rad», США, или другая с аналогичными параметрами

Денситометр для анализа окрашенных гелей «Calibrated Imaging Densitometer model GS-800», производства «Bio-Rad», США, или другой с аналогичными параметрами

Система для получения деионизованной воды «Milli-Q Advantage А10», производства «Millipore SAS», Франция, или другая с аналогичными параметрами

5.1.2. Вспомогательное оборудование

Дозаторы жидкости ручные или электронные автоматические с одноразовыми наконечниками емкостью 1—10 мм³,10—100 мм³, 20—200 мм³ и 100—1 000 мм³, 500—5 000 мм³,

1 000—10 000 мм³, обеспечивающие суммарную погрешность дозирования на уровне ± 1,0 96, производства «Eppendorf Research», Германия, или другие с аналогичными параметрами

Магнитная мешалка с подогревом «ES-6120», производства «Экохим»,

Россия, или другая с аналогичными параметрами

Весы лабораторные электронные «GX-2000», производства «Эй энд Ди», Япония, или другие с аналогичными параметрами

Весы лабораторные электронные «AL 104», производства «Mettler Toledo»,

Швейцария, или другие с аналогичными параметрами

Водяная баня с электрическим подогревом «ГСП-2», производства «РЭ-МО», Украина, или другая с аналогичными параметрами

Термостат 4610, производства «Эк-рос», Россия, или другой с аналогичными параметрами

Вортекс персональный для пробирок объемом от 1,5 до 50,0 см³ (V-l plus), производства «Biosan», Латвия, или другой с аналогичными параметрами

Холодильник бытовой электрический ГОСТ 26678-85

Морозильная камера бытовая, обеспечивающая температуру до —20 *С, производства «Bosch», Германия, или другая с аналогичными параметрами

18

MP 1.2.0053-11

Дистиллятор электрический ДЭ-4-2, производства ОАО «Тюменский завод медицинского оборудования и инструментов», Россия, или другой с аналогичными параметрами

5.1.3. Лабораторная посуда и вспомогательные материалы

Стеклянные трубочки 1,5 mm ID Glass Tube, 7,5 OD, 180 mm length, 24 производства «Bio-Rad», США, или другие с аналогичными параметрами

Заглушки «Grommets and Stoppers.

For 6—7,5 mm OD tybes», производства «Bio-Rad», США, или другие с аналогичными параметрами

Шприцы инъекционные однократного применения с иглой на 2 и 5 см³    ГОСТ 24861-91

Шприц на 20 см³ с навинчивающейся иглой, производства «Химмед», Россия, или другой с аналогичными параметрами

Иглы для нанесения геля, производства «Bio-Rad», США, или другие с аналогичными параметрами

Иглы для экстракции «Tube Gel Extrusion Needles, Protean II xi cell», производства «Bio-Rad», США, или другие с аналогичными параметрами

Набор больших стекол «Protean II xi Outer Plates, 20 cm», производства «Bio-Rad», США, или другой с аналогичными параметрами

Набор малых стекол «Protean II Beveled Inner Plates, 20 cm», производства «Bio-Rad», США, или другой с аналогичными параметрами

Спейсеры «Protean II XL IPG Spacers,

1,0 mm, 4», производства «Bio-Rad»,

США, или другие с аналогичными параметрами

19

Зажимы «Protean II XL Sandwich Clamps, 20 cm set», производства «Bio-Rad», США, или другие с аналогичными параметрами

Пробирки полиэтиленовые одноразовые Эппендорф на 1,5 см¹, производства «Eppendorf», Германия, или другие с аналогичными параметрами

Пробирки полиэтиленовые одноразовые Эппендорф на 2,0 см¹, производства «Eppendorf», Германия, или другие с аналогичными параметрами

Пробирки полиэтиленовые или полипропиленовые одноразовые с крышкой на 5,0 см¹, производства «Axygen», США, или другие с аналогичными параметрами

Полиалломерные тонкостенные центрифужные пробирки, 13 х 64 мм,

6,5 см¹, производства «Beckman Coulter», США», или другие с аналогичными параметрами

Алюминиевые крышки к полиалло-мерным тонкостенным центрифужным пробиркам, 13 х 64 мм, 6,5 см¹, производства «Beckman Coulten>,

США», или другие с аналогичными параметрами

Одноразовые полиэтиленовые наконечники для лабораторных дозаторов объемом 1—10 мм¹, 10—200 мм¹,

100—1 000 мм¹, 1 000—5 000 мм¹,

1 000—10 000 мм¹, производства «Eppendorf», Германия, или другие с аналогичными параметрами

Цилиндры с носиком на 50 и 100 см¹ ГОСТ 1770-74

Стаканы лабораторные на 100, 250 и 1 000 см¹    ГОСТ    25336-82

Колбы мерные на 10, 100, 500 и 1 000 см¹ со шлифом и пробкой

20

Содержание

I.    Область применения................................................................ 4

II.    Введение......................................................................................... 5

III.    Нормативные ссылки.................................................................... 8

IV.    Общие положения......................................................................... 11

V.    Методика изучения протеомного профиля и биосинтетических

процессов в биосубстратах............................................................ 15

5.1.    Оборудование и материалы.................................................. 15

5.2.    Приготовление стандартных и рабочих растворов............. 24

5.3.    Подготовка образцов для исследования (на примере микро-

сомальной фракции гепатоцитов печени крыс и мышей)..    28

5.3.1.    Выделение микросомальной фракции..................... 28

5.3.2.    Определение общего белка в образце...................... 29

5.4.    Методика проведения двумерного электрофореза.............    30

5.4.1.    Первое направление двумерного электрофореза....    30

5.4.2.    Второе направление двумерного электрофореза.....    33

5.4.3.    Окраска гелей............................................................ 37

5.4.4.    Учет результатов........................................................ 38

5.4.5.    Обработка данных..................................................... 39

5.4.6.    Идентификация белковых пятен.............................. 40

5.4.7.    Методика работы на масс-спектрометре MALDI....    41

Приложение 1. Обозначения и сокращения.................................... 43

Приложение 2. Список рекомендуемой литературы....................... 44 ¹

MP 1.2.0053—11

Пинцет зубчато-лапчатый ПХ-200 х 18, производства «Ветмар-кет», Россия, или другой с аналогичными параметрами

Перчатки диагностические (смотровые) нестерильные или перчатки латексные    ГОСТ    3—88

Парафильм М, производства «Laboratory Film», или другой с аналогичными параметрами

Стрипы с преформированным градиентом pH длиной 17 см, производства «Bio-Rad», США, или другие с аналогичными параметрами

Колба Бунзена

Пробирки для ПЦР объемом 500 мм¹, производства «Lab Тес»,

США, или другие с аналогичными параметрами

Скальпель глазной брюшистый малый

Гребенка, производства «Bio-Rad»,

США, или другая с аналогичными параметрами

Пробирки Falcon, 15 см¹, производства «Greiner», Германия, или другие с аналогичными параметрами

Штатив для уравновешивающего буфера, производства «Bio-Rad», США, или другой с аналогичными параметрами

Планшет для иммуноферментного анализа, полистирол со средней степенью связывания

5.1.4. Реактивы

Трис-гидроксиметиламинометан основание (Трис) 98,0 % чистоты, производства «Bio-Rad», США, или другое с аналогичными параметрами

21

MP 1.2.0053-11

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

29 декабря 2011 г.

Дата введения: с момента утверждения 1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Оценка воздействия наноматериалов на протеомный профиль и биосинтетические процессы в тестах на лабораторных животных

Методические рекомендации МР 1.2.0053-11 ²

MP 1.2.0053-11

II. Введение

Быстрое развитие производства искусственных наноматериалов и их всё более широкое внедрение в различных областях человеческой деятельности приведет в ближайшее время к значительному увеличению нагрузки наночастицами и наноматериалами на население. Наноматериалы, обладающие ввиду своей высокой дисперсности комплексом уникальных физико-химических свойств и биологическим действием, должны рассматриваться как принципиально новые формы веществ, потенциальные риски от воздействия которых на организм должны быть во всех случаях детально охарактеризованы.

В рамках Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии на 2008—2011 гг.» был разработан и утвержден в установленном порядке Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ряд методических документов, включающих порядок и методы оценки безопасности наночастиц и наноматериалов методами тестирования в биологических системах различного уровня организации (МУ 1.2.2520—09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов»; МУ 1.2.2634—10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза»; МУ 1.2.2635—10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов»; МУ 1.2.2741—10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных»; МУ 1.2.2745—10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных»; МУ 1.2.2869—11 «Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных»; МУ 1.2.2874—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных»; МР 1.2.2522—09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека»; МР 1.2.2566—09 «Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vim»). Рассматриваемый комплекс методик позволяет проводить тестирование наночастиц и наноматериалов по их безопасности на иерархически организованной системе биологических объектов in vitro и in vivo, включая культуры микроорганизмов, клеточные культуры, гидробионты (беспозвоночные и рыбы), высшие растения, организмы лабораторных животных с использованием комплекса морфологических, биохимических, токсикологических, микробиологических, физиологических и иных методов. Вместе с тем, поиск дополнительных маркеров возможного неблагоприятного воздействия наночастиц и наноматериалов на организм продолжает сохранять актуальность, особенно в аспекте выявления от-

5

носительно слабых и отложенных во времени эффектов при хроническом воздействии. В этой связи представляется целесообразным использование при тестировании наноматериалов методов, позволяющих оценивать их влияние на протеомный профиль и биосинтетические процессы в организме, являющиеся вероятными индикаторами взаимодействия наноматериалов с генетическим и биосинтетическим аппаратом клетки.

Согласно имеющимся в настоящее время данным, наночастицы в силу своих малых размеров способны относительно беспрепятственно проникать через физиологические барьеры организма и далее через биологические мембраны в клетки, где возможно взаимодействие наночастиц с макромолекулами ДНК, РНК и другими биополимерами. Следствием этого может быть воздействие наночастиц и наноматериалов на экспрессию генов, кодирующих различные функционально значимые белки и, как следствие, длительные и стойкие изменения в протеоме организма. Методом, позволяющим оценивать эти изменения в условиях экспозиции биологических тест-систем наноматериалами, является двумерный электрофорез в сочетании с масс-спектрометрической идентификацией белков, получивший обобщенное название «протеомного картирования».

Метод двумерного гель-элекгрофореза заключается в объединении двух различных типов разделения (по электрическому заряду и молекулярной массе), позволяет разделять и идентифицировать отдельные белки в сложной смеси десятков и сотен белков, характерной для большого числа биосубстратов. Необходимым условием успешного разделения является отсутствие в смеси т. н. «доминантных» белков, составляющих по массе более 1—5 % общей суммы белков образца (примером такого белка являются альбумин, а,Ь и g-глобулины плазмы крови). В случае наличия таких белков они должны быть предварительно удалены из смеси с использованием специальной процедуры фракционирования (осаждение солями, органическим растворителями, ионообменная или иммуноаффинная хроматография).

Удобным объектом для протеомного исследования биосубстратов, не требующим предварительного фракционирования, является комплекс белков микросом (мембран эндоплазматического ретикулума) гепатоцитов печени.

При работе данным методом на первом этапе белки разделяют по их заряду. Для этого образец помещают в небольшой объем раствора, содержащего в качестве денатурирующих агентов неионогенное ПАВ и мочевину. В этом растворе происходит солюбилизация, денатурация и диссоциация всех без исключения полипеп-тидных цепей (при этом изменения заряда цепей не происходит).

6

MP 1.2.0053—11

Диссоциированные полипептидные цепи разделяют методом изо-электрического фокусирования, основанном на изменении заряда белковой молекулы при изменении pH окружающей среды. Каждый из белков может быть охарактеризован изоэлекгрической точкой (ИЭТ) — значением pH, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю, и, следовательно, белок не способен перемещаться под действием электрического поля. При pH ниже ИЭТ увеличивается положительный заряд, и молекула белка становится катионом. При pH выше ИЭТ увеличивается отрицательный заряд и белок становиться анионом. Для большинства тканевых белков ИЭТ находится в пределах 2,7—7,9.

При изоэлектрическом фокусировании белки подвергаются электрофорезу в узкой трубочке (или на стрипе), заполненной полиакриламидным гелем, в котором с помощью специальных буферов (т. н. «амфолинов», представляющих собой низкомолекулярные алифатические полимеры (полиаминокислоты) с различным соотношением аминных и карбоксильных групп) создается градиент pH. Под действием электрического поля каждый белок перемещается, в соответствии со своим зарядом, в ту зону градиента, которая соответствует его изоэлекгрической точке и далее остается в ней.

На втором этапе трубочка геля или стрип, содержащие фракционированные по изоэлектрическим точкам белки, подвергается электрофорезу в направлении перпендикулярном тому, что имело место на первом этапе. Электрофорез ведут в щелочной области pH, в присутствии анионактивного ПАВ, сильного электролита додецилсульфата натрия (ДСН). В качестве носителя используют полиакриламидный гель (ПААГ). В этих условиях практически все разделяемые молекулы полипептидов несут максимально возможный отрицательный заряд, и их подвижность в электрическом поле определяется исключительно их размером (гидродинамическим диаметром). Меньшие молекулы будут встречать относительно меньшее сопротивление со стороны матрикса геля и, соответственно, двигаться быстрее. В результате проведения электрофореза большие молекулы будут находиться ближе к месту нанесения образца, чем меньшие. За один раз методом двумерного гель-электрофореза можно разделить до 2 ООО отдельных полипеп-тидных цепей, что достаточно, чтобы выявить большинство белков в образце биосубстрата. Разрешение метода настолько велико, что он позволяет разделить два практически идентичных белка, отличающихся одной заряженной аминокислотой.

Разделившиеся фракции (пятна) полипептидов во избежание их диффузии немедленно фиксируют и далее окрашивают в растворе красителя, прочно связывающегося с белком. Результаты

7

при этом получают в виде «двумерной» белковой карты образца. Подсчёт, каталогизация белковых пятен и их сравнение для различных образцов выполняют после сканирования гелей на денситометре высокого разрешения с использованием специализированного программного обеспечения.

Идентификацию белков в составе вариабельных пятен (появляющихся или, наоборот, исчезающих под воздействием наночастиц и наноматериалов) осуществляют методом масс-спектромет-рии с использованием эффекта лазерной десорбции-ионизации на матрице (MALDI). Для этого выбранные для анализа пятна вырезают из геля, экстрагируют полипептиды с помощью подходящего растворителя, расщепляют их на относительно короткие олиго-пептидные фрагменты под действием протеаз и анализируют отношение массы к заряду для смеси олигопептидов на масс-спектрометре. Получаемая картина (спектр полипептидных фрагментов) является характеристической и высокоспецифической для белка данного вида и может быть идентифицирована при помощи существующих международных баз протеомной информации. После идентификации белков (компонентов протеома), являющихся мишенью воздействия наночастиц и наноматериалов, можно сделать вывод о биохимических механизмах возможного токсического действия наноматериалов на организм. В результате этого возможно установление доза-эффект, что является необходимым условием для гигиенического нормирования наноматериалов.

III. Нормативные ссылки

3.1.    Федеральный закон от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

3.2.    Федеральный закон от 2 января 2000 г. № 29-ФЗ «О качестве и безопасности пищевых продуктов».

3.3.    Федеральный закон от 26 июня 2008 г. № 102-ФЗ «Об обеспечении единства измерений».

3.4.    Федеральный закон от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «Отехническом регулировании».

3.5.    Федеральный закон от 10 января 2002 г. N° 7-ФЗ «Об охране окружающей среды».

3.6.    Постановление Правительства Российской Федерации от 30 июня 2004 г. № 322 «Об утверждении Положения о Федеральной службе в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека».

3.7.    Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. N° 987 «О государственном надзоре и контроле в

8

MP 1.2.0053-11

области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов».

3.8.    Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. № 988 «О государственной регистрации новых пищевых продуктов, материалов и изделий».

3.9.    Постановление Правительства Российской Федерации от 2 февраля 2006 г. № 60 «Об утверждении Положения о проведении социально-гигиенического мониторинга».

3.10.    Постановление Правительства Российской Федерации от 15 сентября 2005 г. № 569 «О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации».

3.11.    Приказ Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».

3.12.    Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики».

3.13.    Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 23 июля 2007 г. N° 54 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащих наноматериалы».

3.14.    Постановление Пивного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 г. № 79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов».

3.15.    СП 2.2.2.1327—03 «Гигиенические требования к организации технологических процессов, производственному оборудованию и рабочему инструменту».

3.16.    МУ 1.2.2520—09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов».

3.17.    МУ 1.2. 2636—10 «Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции, полученной с использованием нанотехнологий и наноматериалов».

3.18.    МУ 1.2. 2741—10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных».

3.19.    МУ 1.2.2745—10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных».

3.20.    МУ 1.2.2874—11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных».

9

3.21.    МУ 1.2. 2744 —10 «Порядок отбора проб для выявления, идентификации и характеристики действия наноматериалов в рыбах».

3.22.    МУ 1.2. 2740 —10 «Порядок отбора проб для выявления, идентификации и характеристики действия наноматериалов в водных беспозвоночных».

3.23.    МУ 1.2.2742 —10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в растениях».

3.24.    МУ 1.2.2634 —10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза».

3.25.    МУ 1.2.2635—10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов».

3.26.    МУ 1.2.2869—11 «Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных».

3.27.    МР 1.2.2522—09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека».

3.28.    МР 1.2.2566—09 «Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo».

3.29.    МР 1.2.0022—11 «Порядок отбора проб для контроля за наноматериалами».

3.30.    МР 1,2.0023—11 «Контроль наноматериалов в пищевой продукции».

3.31.    МР 1.2.0024—11 «Контроль наноматериалов, применяемых в химической промышленности».

3.32.    ГОСТ 24861-91 «Шприцы инъекционные однократного применения».

3.33.    ГОСТ 21240-89 «Скальпели и ножи медицинские. Общие технические требования и методы испытаний».

3.34.    ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».

3.35.    ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».

3.36.    ГОСТ 4328-77 «Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия».

3.37.    ГОСТ Р 51652-2000 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия».

3.38.    ГОСТ 27987-88 «Анализаторы жидкости потенциометрические ГСП. Общие технические условия».

3.39.    ГОСТ 24104-2001 «Весы лабораторные. Общие технические требования».

10

1

2

Область применения

1.1.    Настоящие методические рекомендации определяют порядок и методы оценки безопасности искусственных наномате-риалов по их влиянию на протеомный профиль биосубстратов и процессы биосинтеза белков в тестах на лабораторных животных.

1.2.    Настоящие методические рекомендации могут применяться:

—    при оценке безопасности разрабатываемых новых и уже используемых наночастиц и наноматериалов;

-    в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с процессами производства и оборота наноматериалов.

1.3.    Методические рекомендации разработаны с целью обеспечения единства процедур подготовки образцов, проведения измерений и представления результатов в ходе оценки влияния искусственных наноматериалов на протеомный профиль биосуб-стратов и биосинтетические процессы с использованием методов двумерного электрофореза и масс-спектрометрии.

1.4.    Методические рекомендации предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями и иными организациями и учреждениями, проводящими исследования по оценке безопасности наноматериалов и продукции наноиндустрии.

4