Федеральная служба по напору в сфере шкеты нрав ноi рсбиiс.icii и б. laiono. lyimi человека
1.2. ГИГИЕНА. ТОКСИКОЛОГИЯ. САНИТАРИЯ
Оценка раздражающего действия методом ультразвуковой допплерографии на сосудах хориоаллантоисной оболочки куриного эмбриона ex vivo
Методические рекомендации МР 1.2.0025—11
ББК51.2
093
093 Опенка раздражающего действия методом ультразвуковой допплерографии на сосудах хориоаллантоиеной оболочки куриного эмбриона ex vivo: Методические рекомендации.— М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2011.—12 с.
1. Разработаны ФГУЗ «Iletup гигиены и эпидемиологии в г. Москве» (Н. В. Завьялов. Е. Л. Скворцова): ОАО Завод экологической техники и эко-питания «ДИОД», г. Москва (В. Г1. Тихонов. Т. В. Шевченко. И. А. Родина. Е. К). Белянкина. К. Л. Плигина): СХХ) «СП Мини-макс». г. Санкт-Петербург (М. Б. Гирина).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко и введены в действие 28 июня 2011 г.
3. Введены впервые.
ББК51.2
Редактор Е. В. 11иколасва Технический редактор Е. В. Ломанова
Подписано в печа ть .30.09.11
Тираж 200 экз.
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994. Москва. Вадковский пер., д. 18. стр. 5, 7
Ори шпал- макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательскою обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105. Москва, Варшавское ш.. 19а Отделение реализации, тел. факс 952-50-89
€ Роспотребнадзор, 2011 € Федеральный остр пн йены и
эпидемиологии Росно|ребнадзора, 2011
MP 1.2.0025—11
Вещества, вызывающие раздражающее действие (изменение скорости кровотока) относительно контрольной группы более чем на 15%. подлежат дальнейшим испытаниям на млекопитающих.
11. Форма представления результатов
По результатам эксперимента оформляется протокол. В протоколе должна быть отражена следующая информация:
• название продукта:
• производитель:
• растворитель:
• разведение;
• полученные результаты.
11
MP 1.2.0025—11
Библиографический список
1. Лукьянов А. С. Оценка раздражающего действия веществ по тест) на хориоаллантоисной оболочке ку риного эмбриона (НЕТ-CAM test) в кн. Альтернативные методы исследований (экспресс-методы) для токсиколого-гигиенической оценки материалов и продуктов. М. ТОО Экс-принт НВ. 1999. С. 103—107.
2. Лукьянов А. С.. Павлова Т. Н.. Халспо А. И., Ткачева Т. А. Тест НЕТ-CAM как альтернатива оку лярному тесту Drai/.e //1-й съезд токсикологов России 17—20.11.1998 Тезисы докладов. М.. 1998. 292 с.
3. Постановка исследований по выявлению раздражающих свойств химических соединений на конъюктиву глаза с помощью теста на хо-риоаллантоисной оболочке куриного эмбриона: Методические указания 2.2.756—99 (от 20.06.1999). М.. 1999.
4. Методические указания по оценке раздражающего действия фармакологических веществ с помощью теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона (ХЕТ-САМ тест): Методические указания. М.. 2000.
5. Козлов В. А.. Артюшенко Н. К.. ШалакО. В. и др. Ультразвуковая допплерография в оценке состояния гемодинамики в тканях шеи. лица и полости рта в норме и при некоторых патологических состояниях //Медицинская академия последипломного образования. ООО «СП Ми-нимакс». С.-Пб.. 2000.
6. Bclyankina E.J.. Rodina I.A.. Shevchenko T.V.. Tikhonov V.P. «Application of ultrasonic dopplcrografic inetod on the model of chicken embry o vessels in ovo for standartization of natural substances» //Tire 12th International Congress «Phytopharm 2008». P. 20.
7. Способ оценки раздражающего действия и активности природных. синтетических субстанций и готовых препаратов на куриных эмбрионах методом ультразвуковой допплерографии //Патент на изобретение № 2383888. 2010.
12
MP 1.2.0025—11
Содержание
1. Область применения...............................................................................................4
2. Введение..................................................................................................................5
3. Принцип метода......................................................................................................5
4. Оборудование, материалы и реактивы..................................................................6
4.1. Характеристика объектов исследования.......................................................7
5. Подготовка исследу емых образцов.......................................................................7
5.1. Растворители....................................................................................................7
5.2. Ко1ггроли7
5.3. Исследу емые концентрации...........................................................................8
6. Подготовка тест-объекта........................................................................................9
7. Процедура тестирования........................................................................................9
8. Анализ допплерограмм..........................................................................................9
9. Статистическая обработка данных........................................................................9
10. Интерпретация результатов.................................................................................10
11. Форма представления результатов......................................................................11
Библиографический список.....................................................................................12
3
УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в с(|юрс защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
28 июня 2011 г.
Дата введения: с момента утверждения
1.2. ГИГИЕНА. ТОКСИКОЛОГИЯ. САНИТАРИЯ
Оценка раздражающего действия методом ультразвуковой допплерографии на сосудах хориоаллантоисной оболочки куриного эмбриона ex vivo
Методические рекомендации МР 1.2.0025—11
1. Область применения
1.1. Методические рекомендации предназначены для токсикологических исследований и испытаний парфюмерно-косметической (ПК) продукции, средств гигиены полости рта. а также сырья хтя их производства. в т. ч. полученных с применением нанотехнологий или содсржащих наноматсриалы.
1.2. Методические рекомендации могут быть использованы для оценки раздражающего действия слизистой оболочки глаза вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой продукции. Данный метод может применяться в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсикологическими методами.
1.3. Методические рекомендации предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в с(|юрс защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могу т быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями и иными организациями. аккредитованными в установленном порядке.
4
MP 1.2.0025—11
2. Введение
В батарею токсикологических испытаний для оценки безопасности продукции входит исследование раздражающего действия на слизисту ю оболочку глаза. Для этой цели традиционно используется тест Драйза на лабораторных животных (Draize ct al.. 1944). являющийся одним из самых болезненных тестов. Возможной альтернативной заменой тесту Драйза является ХЕТ-КАМ-тсст (НЕТ-CAM - lien's egg test at the cliorio-allontoic membrane), в котором проводится визуальная оценка состояния сосу дов хориоаллантоисной оболочки (ХАО) ку риного эмбриона. Однако визуальная оценка не позволяет точно и объективно интерпретировать результаты исследования.
Дополнение стандартного ХЕТ-САМ теста методом высокочастотной допплерографии позволяет определять количественные характеристики изменения скорости кровотока в сосудах ХАО. которые отражают выраженность раздражающего действия.
Метод высокочастотной ультразвуковой допплерографии использует эффект изменения частоты сигнала отраженного движущегося объекта на величию пропорциональную скорости движения отражателя, открытый в 1842 г. Допплером. При отсутствии движения исследуемой среды доплеровского сигнала не существует, т. к. ультразвуковая волна проходит сквозь ткани без отражения, что делает данный метод исследования движущихся структур наиболее объективным.
Данные методические рекомендации содержат порядок проведения оценки раздражающего действия с применением метода высокочастотной допплерографии на сосудах ХАО куриного эмбриона ex vivo. Преимуществом настоящего метода являются простота, высокая чувствительность. объективная цифровая оценка результатов, повышающая их достоверность, воспроизводимость, а также экономичность, быстрота получения результатов. Кроме того, система отвечает современным этическим требованиям, согласно которым следует ограничивать использование млекопитающих в эксперименте.
3. Принцип метода
Основой данного метода исследования является ХЕТ-КАМ тест, применяемый для оценки раздражающего действия веществ на сосудах ХАО куриного эмбриона. Во время проведения исследования раствор тестируемого вещества наносят на ХАО. При возникновении раздражающего действия происходит сужение кровеносных сосудов без остановки или с временной остановкой тока крови, тромбоз, кровоизлияния и т. п.. что. в свою очередь, вызывает изменение скорости кровотока. Модификация ХЕТ-КАМ теста с использованием прибора «Минимакс-
5
Допплср-К» позволяет провести количественную оценку скорости кровотока при возникновении раздражающего действия.
Ультразвуковой сигнал, отраженный от кровотока, поступает на приемный элемент датчика (частотой 25 МГц). далее этот сигнал усиливается, фильтруется и проходит в компьютерную часть прибора, где обрабатывается по специальной программе (Minimax Doppler v. 1.7) и выдастся на экран монитора в виде допплсрограмм с цветным спектром. Также автоматически вычисляются количественные параметры скорости кровотока: линейная скорость кровотока Vs (см/с), объемная скорость кровотока Qs (мл/с), средневзвешенная скорость кровотока по кривой средней скорости Г,™ (см/с). Показатели скорости кровотока (Os и У^) коррелируют с линейной скоростью кровотока Vs. Таким образом, для изучения влияния исследуемых веществ достаточно оценки одного из параметров - линейной скорости кровотока (Vs).
Изменение линейной скорости кровотока является показателем выраженности мсстно раздражающего действия исследуемого вещества на сосуды ХАО.
4. Оборудование, материалы и реактивы
Допплерограф ультразвуковой компьютеризированный для исследования скорости кровотока ММ-Д-К «Минимакс-Допплср-К». оснащенный датчиком с частотой 25 МГц или с аналогичными характеристиками
Термостат лабораторный, позволяющий поддерживать температуру (38.0 ± 0.5) °С Подставка
Встряхиватсль лабораторный типа Вортекс или с аналогичными характеристиками Термометр лабораторный 0—55 °С Магнитная мешалка
Весы аналитические (предел допустимой погрешности нс более 0.01 мг)
Колбы, цилиндры стеклянные мерные Мнкропробирки пропиленовые конические объемом 0.5 и 1.5 см3 с крышкой Штатив для микропробирок вместимостью 0.5 и 1.5 см3
Наконечники одноразовые для дозаторов переменного объема в штативах Дозаторы автоматические переменного объема ТУ 94524Ю2-33189998—2(Х)2
6
MP 1.2.0025—11
Часы сигнальные Пинцеты медицинские Шпатели металлические Фильтровальная бумага Вода дистиллированная Спирт этиловый (этанол)
Диметилсульфокснд (99.5 %)
Калий гидроксид 0.9 %-й раствор NaCl
4.1. Характеристика объектов исследования
Исследования проводят на 10-дневных куриных эмбрионах домашних кур породы белый леггорн. До начала эксперимента яйца выдерживают тупым концом вверх при температу ре (38.0 ± 0.5) °С. Для поддержания влажности в термостат помещают емкость с водой, объемом
500 см3.
5. Подготовка исследуемых образцов
5.1. Растворители
При работе с гидрофильными веществами в качестве растворителя используют физиологический раствор (0.9 % NaCl). При работе с гидрофобными веществами в качестве растворителя используют медицинское оливковое масло, диметилсульфокенд или этиловый спирт в конечной концентрации нс более 1 %. При необходимости допускается использование других растворителей в концентрациях, нс вызывающих раздражающего действия, что должно быть подтверждено экспериментально. Растворитель, вносимый в эквивалентных объемах, используется в качестве негативного контроля.
5.2. Контроли
В качестве негативного контроля используют растворитель, вносимый в эквивалентных объемах. В качестве позитивного контроля используют раствор КОН (2.5 %). Раствор КОН готовят непосредственно перед использованием. Для этого навеску (250,0 ± 0,1 )мг помещают в мерную колбу вместимостью 10 см3, до половины заполняют физиологическим раствором, перемешивают до полного растворения вещества, доводят объем физиологическим раствором до метки и тщательно перемешивают. Изменение скорости кровотока (l ’v) при воздействии на сосуды ХАО контрольного образца КОН составляет (0.0 ± 2.0) %.
7
5.3. Исследуемые концентрации
Во избежание ложноположительных или ложноотрицательных результатов образцы исследуют в концентрациях, не вызывающих изменение pH инкубационной среды и/или осмотического давления (± 0.1).
Экстракты из испыту емых образцов готовят путем настаивания в физиологическом растворе или модельной среде (медицинское оливковое масло, диметилсульфоксид или этиловый спирт в конечной концентрации нс более 1 %). Соотношения веса образца и объема модельной среды приведены в табл. 1. Навески образцов взвешивают в сухой чистой колбе, куда потом добавляют требуемый объем модельной среды. В другую колбу наливают модельну ю среду и обе колбы помещают в термостат при 37 °С и инку бируют 1 ч.
Таблица 1
Условии приготовления экстрактов
|
Вид продукции |
Масса
образца,
г |
Объем модельной среда, см3 |
Степень разведения образца |
11родол-житеяь-HOCTT, ЭКС-гракции, ч |
|
Шампуни для волос и тела |
1,0 |
4,0 |
1 : 5 |
1 |
|
Ополаскиватели для волос |
1,0 |
4,0 |
1 : 5 |
1 |
|
Туалетное мыло |
1,0 |
4,0 |
1 : 5 |
1 |
|
Средства для принятия душа и ванны |
1,0 |
4,0 |
1 :5 |
1 |
|
Дезодоранты и допилятории |
1,0 |
4,0 |
1 : 5 |
1 |
|
Кремы, эмульсии и др. (не спиртосодержащие) |
2,5 |
2,5 |
1 : 1 |
1 |
|
Кремы, эмульсии и др. (спи тгосодержащие; с ра юфевающим э< )фектом) |
1,0 |
4,0 |
1 : 5 |
1 |
|
Маски питательные, очищающие и др. |
2,5 |
2,5 |
1 : 1 |
1 |
|
Зу бные пасты и отбеливающие системы |
1,0 |
4,0 |
1 :5 |
1 |
|
Детские присыпки (тальк, пудра) |
1,0 |
4,0 |
1 :5 |
1 |
|
Средства моющие, чистящие, полирующие для мытья посуды, предназначенной для контакта с пищевыми продуктами и водой |
1,0 |
4,0 |
1 : 5 |
1 |
|
Зубные эликсиры и ополаскиватели |
2,5 |
2,5 |
1 : 1 |
1 |
|
Средства для нанесения на гу бы |
1,0 |
4,0 |
1 :5 |
1 |
|
Средства для макияжа глаз |
1,0 |
4,0 |
1 :5 |
1 |
|
Средства для интимной гигиены |
1,0 |
4,0 |
1 : 5 |
1 |
|
Средства для защиты кожи от воздействия производственных вредных факторов (мази, кремы, пасты и т. д) |
1,0 |
4,0 |
1 : 5 |
1 |
MP 1.2.0025—11
6. Подготовка тест-объекта
Перед началом эксперимента яйцо помещают на фиксирующую подставку ту пым концом вверх и вскрывают воздушную камеру. От скорлупы освобождают всю воздушную камеру, после чего поверхность подскорлуповой оболочки смачивают физиологическим раствором и полностью ее удаляют так. чтобы не повредить ХАО. На ХАО наслаивают 400 мм3 физиологического раствора (хтя предотвращения высыхания). Яйцо помещают в термостат на 20 мин хтя снятия травматического шока.
Если происходит повреждение ХАО или возникают кровотечения, то яйцо отбраковывается.
7. Процедура тестирования
Выбрав кровеносный сосуд на поверхности ХАО. датчик располагают так. чтобы он находился под углом 60° к исследуемому сосуду, добиваясь при этом слабых по амплитуде пульсаций без острых пиков (медленно меняющаяся волна) допплерограмм. отображающихся на мониторе прибора.
После измерения скорости кровотока в выбранном сосуде на нулевой минуте проводится наслаивание экстракта из исследуемого образца в количестве 400 мм3. Нулевая минута соответствует интактному состоянию сосудов ХАО эмбриона. Через 80 с оценивается изменение скорости кровотока сосудов ХАО под влиянием исследуемого образца.
8. Анализ допплерограмм
Анализируется не менее 10 эмбрионов хтя испытания одного образца. Компьютерная программа Minimax Doppler v.1.7. разработанная хтя прибора «Мннимакс-Допплср-К». автоматически проводит анализ допплерограмм. вычисляя линейную скорость кровотока (параметр
К см/с).
9. Статистическая обработка данных
Раздражающее действие на слизистую оболочку глаза (А) соответствует изменению скорости кровотока выраженному в процентном соотношении относительно нулевой точки измерения и высчитывается по формуле:
6 = (|/,)" ~(К,)° ■ 100. где
Юо
(Vs)„ - линейная скорость кровотока в динамике измерений;
9
(1 Ло- линейная скорость кровотока на нулевой минуте. Результат испытания представляется в виде:
X ± <7, при Р = 0.95
За результат анализа принимают среднее арифметическое 10 и более параллельных измерений.
Среднее квадратичное отклонение (а) результатов определений количественного выражения раздражающего действия вычисляется по формуле:
Xt - /'-й результат определений: п - число параллельных определений;
X - среднее арифметическое результатов изменения скорости кровотока.
Среднее арифметическое результатов изменения скорости кровотока вычисляется по формуле:
Достоверность различий между контрольной группой (группа с растворителем) и опытной (исследуемые экстракты) вычисляется по формуле:
Х.-Х
V°0 + <-
Все указанные статистические параметры можно также вычислять с помощью компьютерной программы «Statistica» или иных программных средств.
10. Интерпретация результатов
Вещество, вызывающее раздражающее действие (изменение скорости кровотока) относительно контрольной группы менее чем на 15% следует отнести к соединениям с невыраженным раздражающим действием и исключить его дальнейшее тестирование по данному эффекту на лабораторных животных.
