Заместитель директора по науке БелГИМ __

(овец

Извещение № 1 об изменении МВИ.МН 4140-2013

Методика выполнения измерений количества дрожжей, плесневых грибов, мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов в пищевых продуктах и при контроле стерильности поверхностей с помощью подложек типа RIDA ® COUNT, производства R-Biopharm AG, Германия

		ил	ИЗВЕЩЕНИЕМ!		ОБОЗНАЧЕНИЕ ДОКУМЕНТА
Дата выпуска			Срок изменения			Лист 2	Листов 2
ПРИЧИНА			Изменение дистрибьютированного названия			КОД
УКАЗАНИЕ О ЗАДЕЛЕ
УКАЗАНИЕ О ВНЕДРЕНИИ
ПРИМЕНЯЕМОСТЬ
РАЗОСЛАТЬ
ПРИЛОЖЕНИЕ			на 18 листах
изм.			СОДЕРЖАНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ
1

Наименование изложить в новой редакции: «Методика выполнения измерений количества дрожжей, плесневых грибов, мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в пищевых продуктах и при контроле стерильности поверхностей с помощью подложек типа Sanita-kun, производства JNC Corporation, Япония».

Листы 2-19 заменить.

Ввести лист 20.

Группа микроорганизмов	Характсрисгика
Дрожжи	Одноклеточные микроорганизмы, клетки круглой, овальной или продолговатой формы, длиной от 2,5 до 30 мкм и шириной ог 2,5 до 10 мкм, часто почкующиеся
Плесневые грибы	Состоят из нитей-гифов, без перегородок или се1ггированных на клетки. Гифы образуют боковые выросты и разветвления, от зе1'етативных гифов поднимаются гифы, несущие плодовые тела

Для каждого параллельного посева производят интерпретацию результатов подсчета количества микроорганизмов описанным в п. 9.2 способом.

9.2 Интерпретация результатов подсчета колоний на подложках

9.2.1    Интерпретация результатов подсчета колоний двух параллельных посевов

9.2.1.1    Если количество колоний С для каждого параллельного посева удовлетворяет условию

(1)

то полученный результат подсчета используют для дальнейшей обработки согласно п. 9.3. Минимально и максимально определяемое количество колоний С*.,C_mts приведены в таблице 4.

Таблица 4 - Значения С, и CV,

mu>    max

Группа микроорганизмов	С™
Мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы	30	300
Дрожжи	15	150
Плесневые грибы	5	50

9.2.1.2 Если отсутствуют подложки с посевами анализируемого образца и/или его разведений, для которых выполняется условие (1), и на подложке выросло более колоний, то подсчитывают количество колоний в трех показательных квадратах подложек максимального разведения, получая соответствующие значения С_1ЧС_И%С_Ш. Проверяют выполнение условия (2)

С/Ч-Сл+С,!,^    (2)

• При выполнении условия (2) количество колоний С на подложке рассчитывают по следующей формуле

С - 20 ■^С' ⁺—,

•    При невыполнении условия (2) повторяют подготовку

смывов в соответствии с п. 8.4, 8.5, используя для посева разведений степени.    ЁрГ^'    ⁹

9.2.1.3 Если количество колоний в обоих парши1ельньо^?Я^5®^    /    »

\    "уж    /о

\vw24.

последовательных разведений соответствует условию (1), оценку проводят по результатам посева наибольшего разведения.

9.2.1.4    Если в одном из параллельных посевов одного разведения число колоний не соответствует условию (1), а среднее значение двух параллельных посевов соответствует этому условию, и отсутствуют параллельные посевы других разведений, удовлетворяющие условию (1), то эти результаты используют для дальнейшей обработки согласно п. 9.3.

9.2.1.5    Если отсутствуют подложки с посевами минимального разведения анализируемого образца, для которых выполняется условие (1), и на каждой из двух подложек параллельных посевов минимального разведения или жидкого образца количество подсчитанных колоний менее С^, то проводят одностороннюю оценку результата измерения в соответствии с п. 11.2.1.

9.2.2 Интерпретация результатов подсчета колоний трех параллельных посевов

9.2.2.1    Если количество колоний С для каждого параллельного посева удовлетворяет условию (1), то полученный результат подсчета используют для дальнейшей обработки согласно п. 9.3.

9.2.2.2    Если количество колоний в параллельных посевах образца и его разведения соответствует условию (1), оценку проводят по результатам посева этою разведения.

9.2.2.3    Если в одном из параллельных посевов число колоний не соответствует условию (1), а среднее значение параллельных посевов соответствует этому условию, и отсутствуют параллельные посевы разведений, удовлегворяющие условию (1), то эти результаты используют для дальнейшей обработки согласно п. 9.3.

9.2.2.4    Если количество колоний в параллельных посевах образца соответствует условию (4), то полученный результат подсчета используют для дальнейшей обработки согласно п. 9.3.

C.+Cj + Cj^O.SC^,

где С,,С₂,С₃ - количество колоний в трех параллельных посевах, КОЕ;

С_тт - минимально определяемое количество колоний, приведенное в таблице 4.

9.2.2.5    Если отсутствуют подложки с посевами анализируемого образца, для которых выполняется условие (1), и на подложке выросло более С^ колоний, то проводят интерпретацию результатов подсчета согласно п. 9.2.1.2.

9.2.2.6    Если сумма количества колоний в трех параллельных посевах образца меньше С_т , то проводят одностороннюю оценку результата измерения в соответствии с п. 11.2.1.

9.3 Расчет среднего значения результатов подсчета колоний на подложках

Среднее значение результатов подсчета колоний С, КОЕ, на подложках параллельных посевов, выбранных согласно пп. 9.1,9.2 для обработки, рассчитывается по формуле

где С, - количество колоний на подложке /-го паршш

n_c - количество параллельных посевов.

Среднее значение результатов подсчета колоний используется для расчета окончательного результата измерений количества целевых микроорганизмов согласно п. 10.

10 Обработка результатов измерения

10.1 Расчет окончательного результата измерений

Результат единичного измерения количества микроорганизмов М , КОЕ/г (КОЕ/см³) или КОЕ (для смывов), рассчитывают но формуле

М = NC у    (6)

где С - среднее количество колоний на подложках параллельных посевов, полученное в соответствии с п. 9.3;

N - степень разведения, составляющая для разведения 1:10 -10, для разведения 1:100- 100 ит.п.

За окончательный результат измерений количества целевых микроорганизмов М , КОЕ/г (КОЕ/см³) или КОЕ (для смывов), принимают результат единичного количества микроорганизмов М , КОЕ/г (КОЕ/см³) или КОЕ (для смывов), рассчитываемый по формуле (6), при условии, что при проведении измерений выполняется контроль повторяемости в соответствии с п. 12.2 с периодичностью, установленной системой менеджмента качества лаборатории.

При выполнении двух параллельных измерений проб образца (анализ проводится с использованием двух навесок) за окончательный результат измерений принимают среднее арифметическое значение результатов параллельных проб при выполнении условия повторяемости по п. 12.2, рассчитываемое по формуле

где Л/,,Л/₂ - результаты параллельных измерений количества целевых микроорганизмов, КОЕ/г (КОЕ/см³) или КОЕ (для смывов), рассчитываемые но формуле (6).

Если окончательный результат измерений количества целевых микроорганизмов превышает значение, соответствующее верхней границе диапазона измерений, приведенное в таблице 1, то проводят одностороннюю оценку результата измерения в соответствии с п. 11.2.3.

10.2 Округление окончательного результата измерений

10.2.1 Если окончательный результат измерений М , КОЕ/г (КОЕ/см³) или КОЕ соответствует условию

Л/ <10,    (8)

то он выражается в виде целого числа.

10.2.2 Если условие (8) не выполняется, то окончательный результат КОЕ/г (КОЕ/см³) или КОЕ (для смывов), выражается числом в научн*

M = dx\0\

где d — мантисса, соответствующая условию

1,0£</ £9,9,

п - экспонента.

При расчете окончательного результата мантисса d округляется до десятых, причем, 5 в сотых округляется до четного числа в десятых.

10.2.3 Для смывов проводится дальнейшая обработка полученного результата измерений в соответствии с конкретным ТИПА по санитарно-гигиеническому контролю, например [4].

11 Оформление результатов измерений

11.1 Форма представления результатов измерения с использованием расширенной неопределенности

Если результат измерений при определении количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов находится в диапазоне от 5 до 3,0x10* КОЕ/г, КОЕ/см³, то он может быть представлен в виде*

а7,КОЕ/г[а7 + и^г-2U-у1м М + U² +2 U->ДГ]

М,КОЕ/см³    U    ,М    +    и²    +    2-и->1м^

при доверительной вероятности Р = 0,95, К=2

где М -результат измерений, КОЕ/г (КОЕ/см³), полученный в соответствии с настоящей методикой и рассчитанный согласно разделу 10;

U - расширенная неопределенность результатов измерений, (КОЕ/г)¹⁷², (КОЕ/см³)¹⁷², U =0,84 (КОЕ/г)¹⁷², (КОЕ/см³)¹⁷².

В остальных случаях результат измерений может быть представлен в виде

КОЕ/г [ю^{1 2}*®⁴⁷, Ю****⁷ J Л?, КОЕ/см³ [lO'^.lO²*"*⁷⁷]

Л/,КОЕ[ю^|8*^7Ч7,10^|,*^74<7] (для смывов) при доверительной вероятности Р - 0,95, К=2

где М -результат измерений, КОЕ/г (КОЕ/см³), полученный в соответствии с настоящей методикой и рассчи танный согласно разделу 10;

U - расширенная неопределенность результатов измерений, log|₀ (КОЕ/г), logio (КОЕ/см³), login (КОЕ).

В таблице 2 приведены оценки расширенной неопределенности результатов измерений, для которых выполняется условие (11)

С = С_т10,    (11)

где С - среднее значение результатов подсчета колоний, КОЕ, определяется согласно п. 9.2;

~ минимально определяемое количество колоний, КОЕ, приведенное в

п. 9.3.

Для других значений оценка расширенной неопределенности измерений рассчитывается по формуле

0,18861

2-С

где cr_K - стандартное отклонение воспроизводимости, logio (КОЕ/г), log,о (КОЕ/см³), logio (КОЕ), приведенное в таблице 1.

При необходимости может быть использована оценка расширенной неопределенности измерений, полученная в соответствии с [1] для конкретного вида пищевого продукта или смыва.

11.2 Форма представления результатов в виде односторонней оценки

11.2.1    Если среднее значение результатов подсчета колоний целевых микроорганизмов С на двух подложках параллельных посевов минимального разведения или жидкого образца окажется менее минимально определяемого количества колоний С, приведенного в таблице 4, то дают одностороннюю оценку результата измерения вида

менее M_mtn, где рассчитывают по формуле (13)

(13)

где N_mtn - степень разведения для минимального разведения, при посеве жидкого образца yV_min = 1.

М_тт выражают согласно п. 10.2.

11.2.2    Если сумма количссгва колоний целевых микроорганизмов на трех подложках параллельных посевов образца окажется менее 15 КОЕ, то дают одностороннюю оценку результата измерения вида

менее М^,,

ЛШ1 ¹

где М_ям~5 КОЕ/г (КОЕ/см³).

11.23 Если окончательный результат измерений количества целевых микроорганизмов превышает значение, соответствующее верхней границе диапазона измерений, приведенное в таблице 1, то дают одностороннюю оценку результата измерения вида

более М_т,

в» ¹

где М^ - количество целевых микроорганизмов, соответствующее верхней границе диапазона измерений, и составляющее:

•    для мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов -3,0x10⁷ КОЕ/г, КОЕ/см³, КОЕ;

•    для дрожжей -1,5x10⁵ КОЕ/г, КОЕ/см³, КОЕ;

•    для плесневых грибов -5,0x10⁵ КОЕ/г, КОЕ/см³, КОЕ.

12 Контроль точности результатов измерений

Контроль точности проведения измерений выполня ³

установленной системой менеджмента качества в лаборатории, но обязательно:

•    при внедрении методики;

• при появлении факторов, влияющих на стабильность процесса по результатам анализа контрольных карт;

•    при значимых изменениях в условиях измерений (другая партия реагентов, новые средства измерений, ремонт оборудования и т.д.);

• при любых выявленных несоответствиях в работе лаборатории, применительно к методике выполнения измерений.

12.1    Оперативный контроль результатов, полученных в условиях повторяемости

12.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, проводят следующим образом. Рассчитывают расхождение для результантов параллельных измерений Л/,,Л/₂ проб одного образца или смыва следующим образом.

Л/<30,    (14) то расхождение Dr рассчитывают по следующей формуле

Если при определении количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов величина М, рассчитанная по формуле (7), удовлетворяет условию

Во всех остальных случаях расхождение D, рассчитывают по формуле

А — |lgА/, -lgA/₂|    (16)

Значение D, сравнивают со значением предела повторяемости г . Если выполняется условие

D,2Sr,    (17)

то оба результата считают приемлемыми и в качестве окончательного результата измерений указывают среднее арифметическое значение М, рассчитанное но формуле

^<7).

Значение предела повторяемости г, выраженное в logio (КОЕ/г), logio (КОЕ/см ), logio (КОЕ), или (КОЕ/г)^|/2, (КОЕ/см³)^,/2 приведено в таблице 5.

При невыполнении условия (17) проводят повторный анализ проб или смывов согласно разделов 8,9.

12.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости, проводят следующим образом.

Каждая из двух лабораторий получает по 2 образца согласно разделу 9, обеспечивая контрол рассчитывает окончательный результат измерений сс

Расхождение D„ для окончательных результатов измерений М\,Мг полученных в двух лабораториях, рассчитывают по формулам (15), (16) аналогично D_r, и сравнивают со значением критической разности CD. Если выполняется условие

D_R<.CD_t    (18)

то оба окончательных результата измерений, полученные двумя лабораториями считаются приемлемыми и общее среднее значение М , рассчитанное по формуле

— М\ + Mi м —-,

может быть использовано в качестве заявляемого результата.

Значение критической разности CD _у log,₀ (КОЕ/г), log_l0 (КОЕ/см³), log,₀ (КОЕ), или (КОЕ/г)¹⁷², (КОЕ/см³)^|/2, рассчитывают по формуле

(20)

где г - значение предела повторяемости, указанное в таблице 5, log,₀ (КОЕ/г), log,о (КОЕ/см³), log,о (КОЕ) или (КОЕ/г)^|/2, (КОЕ/см³)'⁷²;

R - значение предела воспроизводимости, указанное в таблице 5, log,₀ (КОЕ/г), Iog₁₀ (КОЕ/см³), log,о (КОЕ) или (КОЕ/г)¹⁷², (КОЕ/см³)^,/2.

При превышении значения критической разности для разрешения различий между результатами, полученными двумя лабораториями, используют процедуры, указанные в разделе 5 СТБ ИСО 5725-6.

Таблица 5 — Значения предела повторяемости и воспроизводимости

Целевые микроорганизмы Диапазон измерений, КОЕ/г, КОЕ/см3, КОЕ Предел повторяемости г, log,o (КОЕ/г), logio (КОЕ/см3), log,о (КОЕ) Предел воспроизводимости R, log,о (КОЕ/г), log,0 (КОЕ/см3), logio (КОЕ) Мсзофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы от 5 до З.ОхЮ1 включ. 0,90 (KOE/rV72, (КОЕ/см3) 72 1,18 (КОЕ/г)'72, (КОЕ/см3)72 св. 3,0x10'до З.ОхЮ7 включ. 0,34 0,53 Дрожжи от 1,5x10'до 1,5x105 включ. 0,28 0,45 Плесневые грибы от 5 до 5,0x105 включ. 0,31 0,50

12.4 Контроль стабильности результатов измерений с применением контрольных карт Шухарта (КК)

Для контроля стабильности результатов измерений строят контрольную карту индивидуальных значений*.

Подготовка и оформление исходных данных, расчеты параметров управление и интерпретация КК должны осуществляться в соответствии <у!

(5], раздел 6.

12.4.1    Образцы для контроля, применяемые при ведении контрольных карт

Для построения и ведения контрольных карт используются образцы для контроля (далее ОК), представляющие собой стандартные образцы или рабочие образцы с естественной контаминацией, а также коммерчески доступные образцы для контроля качества. ОК должны быть стабильны по определяемым показателям в течение времени ведения КК. Количество целевых микроорганизмов в ОК должно находиться в диапазоне измерений МВИ.

При использовании в качестве ОК рабочих образцов обеспечивают достаточную однородность подготовленных для ведения контрольной карты проб, перемешивая или гомогенизируя исходный образец. Образец разделяют на пробы, количество каждой пробы должно быть достаточно для проведения анализа с получением единичного результата измерения. Пробы помещают в стерильную упаковку и хранят при условиях, обеспечивающих стабильность по определяемым показателям в течение времени ведения контрольной карты.

Стандартные образцы или коммерчески доступные образцы для контроля качества используют в соответствии с рекомендациями производителя.

12.4.2    Набор начальных данных, необходимых для построения контрольных карт

Для построения контрольных карт необходимо получить в соответствии с данной МВИ результаты единичных измерений проб ОК, подготовленных по п. 12.4.1 в течение минимального промежутка времени. Набор данных должен производиться при варьировании таких факторов, как например, время, оператор, реактивы, материалы, оборудование, которые будут изменяться в ходе ведения контрольных карт. Количество результатов измерений должно быть от 20 до 30.

12.4.3    Расчет параметров, ведение н оформление данных, интерпретация карт

индивидуальных значений

По результатам измерений, полученным в соответствии с п. 12.4.2 рассчитывают значения центральной линии, границ регулирования и предупреждающих границ по формулам

•    Центральная линия

Zig4

CL = -&-—    (21)

где N - количество измерений для расчета значений центральной линии и ipaium КК;

М' - количество микроорганизмов, полученное в ходе /-го измерения, КОЕ/г (КОЕ/см³), КОЕ;

•    Предупреждающие границы

UCL = CL+ 2-S    LCL = CL-2 S ,    (22)

•    Границы регулирования

UCL = CL + 3S    LCL = CL-3-S    (23)

^{s =}-"    У-,    ⁽²⁴⁾

Графическое построение KK состоит в проведении на выбранной шкале центральной линии и контрольных границ.

Ведение КК предусматривает набор данных единичных измерений M_t при выполнении анализа ОК в соответствии с МВИ, оформлении Листа данных КК и нанесения данных на КК.

Интерпретация данных КК осуществляется в соответствии с [5], п. 7.

13 Нормативные ссылки

В настоящей методике использованы ссылки на следующие документы:

Государственная система обеспечения единства измерений. Методика выполнения измерений. Основные положения Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

Система стандартов безопасности труда. Оборудование производственное. Общие требования безопасности Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия Вода дистиллированная. Технические условия Весы лабораторные. Общие технические требования Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Консервы молочные. Методы определения физических и органолептических показателей.

Продукты пищевые и продовольственное сырье. Методы отбора проб для определения показателей безопасности. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6 Использование значений точности на практике

Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

Реактивы. Натрий хлористый. Технические услови Реактивы. Натрия гидроокись. Технические уел Микробиология пищевых продуктов и кормо: Общие требования к выполнению микробиол исследований    ¹

Реактивы. Калия гидроокись. Технические у

Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования

Продукты пищевые и вкусовые. Порядок отбора проб для микробиологических анализов

Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов.

Микроскопы световые. Термины и определения

Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

Стекла покровные для микропрспаратов. Технические условия

СОДЕРЖАНИЕ

1    Область применения............................................................................... 3

2    Точность измерений........................................................................................3

3    Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование,

материалы, реактивы..............................................................................................4

3.1    Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование...........4

3.2    Материалы и реактивы.....................................................................................S

4    Метод измерений.............................................................................................5

4.1    Определение количества дрожжей и плесневых грибов....................................5

4.2    Определение количества мезофильных аэробных и

факультативно-анаэробных микроорганизмов...........................................................5

5    Требования безопасности и требования к квалификации операторов........6

3.1    Требования безопасности.................................................................................6

5.2    Требования к квалификации персонала............................................................6

6    Условия выполнения измерений...................................................................6

7    Условия хранения подложек Sanita-kun...................................... б

8    Подготовка к выполнению измерений..........................................................б

8.1    Отбор проб.......................................................................................................6

8.2    Подготовка лабораторной посуды....................................................................7

8.3    Приготовление растворов.................................................................................7

8.4    Подготовка проб пищевых продуктов...............................................................7

8.5    Взятие смывов с поверхностей.........................................................................9

8.6    Инкубация подложек........................................................................................9

9    Выполнение измерений..................................................................................9

9.1    Подсчет колоний на подложках........................................................................9

9.2    Интерпретация результатов подсчета колоний на подложках.........................10

9.3    Расчет среднего значения результатов подсчета колоний    на подложках........11

10    Обработка результатов измерения..............................................................12

10.1    Расчет окончательного результата измерений................................................12

10.2    Округление окончательного результата измерений........................................12

11    Оформление результатов измерений...........................................................13

11.1    Форма представления результатов измерения с использованием расширенной

неопределенности....................................................................................................13

11.2    Форма представления результатов в виде односторонней    оценки..................14

12    Контроль точности результатов измерений................................................15

12.1    Оперативный контроль результатов, полученных в условиях повторяемости 15

12.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

повторяемости..........................................................................................................1S

12.3    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

воспроизводимости..................................................................................................15

12.4    Контроль стабильности результатов измерений с применением контрольных

карт Шухарта (КК)...................................................................................................16

13    Нормативные ссылки...................................................................................18

14    Библиография...............................................................................................19

Библиография

[1] ISO/TS 19036:2006 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководство по оценке неопределенности измерения для количественных определений Перевод с английского [2] СП 17-129 РБ 2000 Безопасность при работе с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами 13] Санитарные Правил и Нормы 9-80-98 «Гигиенические требования к микроклимату производственных помещений», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 25 марта 1999г. № 12 и ГОСТ 12.1.005-88 [4J Инструкция № 078-0210 «Санитарно-бактериологический контроль на объектах общественного питания и предприятиях продовольственной торговли», утвержденная Главным государственным санитарным врачом Республики Беларусь 12 марта 2010 г. Г5] ГОСТ Р ИСО 7870-2-2015 Статистические методы. Контрольные карты. Часть 2. Контрольные карты Шухарта

1 Область применения

Настоящая методика распространяется на пищевые продукты, смывы с поверхностей при контроле стерильности поверхностей и устанавливает метод определения количества плесневых грибов, дрожжей, количества мсзофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (далее целевые микроорганизмы).

Методика предназначена для проведения измерений количества целевых микроорганизмов с использованием:

•    подложек Sanita-kun Aerobic Count (мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы);

•    подложек Sanita-kun Yeast & Mould Rapid (дрожжи, плесневые грибы); Диапазон измерений составляет:

•    При    определении    мсзофильных    аэробных    и    факультативно-анаэробных

микроорганизмов: от 3,0x10¹ до 3,0x10⁷ КОЕ/г, КОЕ/см³, КОЕ* (пищевые продукты, смывы); от 5 до 3,0x10' КОЕ/г, КОЕ/см³ (ультрапастеризованное, стерилизованное молоко или стерилизованные жидкие молочные смеси).

•    При определении дрожжей - от 1,5х 10¹ до 1,5х 10⁵ КОЕ/г, КОЕ/см³, КОЕ.

•    11ри определении плесневых грибов - от 5 до 5,0х 10⁵ КОЕ/г, КОЕ/см³, КОЕ. Предел измерений составляет:

•    При    определении    мезофильных    аэробных    и    факультативно-анаэробных

микроорганизмов: 3,0x10¹ КОЕ/см³, КОЕ (пищевые продукты, смывы); 5 КОЕ/г, КОЕ/см³ (ультрапастеризованное, стерилизованное молоко или стерилизованные жидкие молочные смеси).

•    Дрожжи - 1,5x10' КОЕ/г, КОЕ/см³, КОЕ.

•    Плесневые грибы - 5 КОЕ/г, КОЕ/см³, КОЕ.

Настоящая методика разработана в соответствии с требованиями ГОСТ 8.010.

2 Точность измерений

Настоящая методика обеспечивает измерение количества дрожжей, плесневых грибов, мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в указанных выше диапазонах с показателями точности, приведенными в таблице 1.

Таблица I - Показатели повторяемости и воспроизводимости

Целевые микроорганизмы Диапазон измеоений, КОЕ/г, КОЕ/см3, КОЕ Стандартное отклонение повторяемости о,, logio (КОЕ/г), log,» (КОЕ/см3), logio (КОЕ) Стандартное отклонение воспроизводимости <т„, logio (КОЕ/г), log,о (КОЕ/см3), log,о (КОЕ) Мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы от 5 до 3,0x10' включ. 0,32 (КОЕ/г) , (КОЕ/см3)72 0,42(КОЕ/г)'" (КОЕ/см3)'72 св. 3,0x101 до 3,0x107 включ Дрожжи от 1,5x10'до 1,5x10s включ. 0,10г£$^ -V Плесневые грибы от 5 до 5,0х 105 включ. У-УЗИпЖ \ YtT\nwT\ KsUO-

И здесь и далее по тексту единицы измерений КОЕ и logw (КОЕ) используются. I зам. ЧМИ (rinau'iu /Ь.\

Г?..

Во всем диапазоне измерений методики смешение незначимо.

Значения оценок расширенной неопределенности приведены в таблице 2. Указанные в таблицах 1, 2 метрологические характеристики получены на основании данных эксперимента в соответствии с:

•    показатели прецизионности - СТБ ИСО 5725-2, СТБ ИСО 5725-5;

•    показатели правильности - СТБ ИСО 5725-4;

•    оценки неопределенности [1].

Таблица 2 — Оценки неопределенности результатов измерений, выполняемых в соответствии с МВИ

Целевые микроорганизмы Диапазон изменений, КОЕ/г, КОЕ/см , КОЕ Расширенная неопределенность U, log,о (КОЕ/г), log,о (КОЕ/см3), log,о (КОЕ), К = 2,/> = 95 % Мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы от 5 до 3,0x101 включ. 0,84 (КОЕ/г)W, (КОЕ/см3),/2 св. 3,0x10* до 3,0x107 включ. 0,40* Дрожжи от 1,5x10* до 1,5x105 включ. 0,36’ Плесневые грибы от 5 до 5,0х Ю5 включ. 0,45*

3    Средства    измерений,    испытательное    i

оборудование, материалы, реактивы

3.1    Средства    измерений,    испытательное    i

оборудование

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 среднего класса точности с наибольшим пределом взвешивания до 1000 г, ценой деления не более 0,1 г.

Лупа измерительная по ГОСТ 25706 с увеличением 5 - 10^х.

Микроскоп световой биологический с увеличением до 900^х по ГОСТ 28489.

Термостат, позволяющий поддерживать температуры 24 °С, 36 °С, 37 °С с погрешностью не более ± 1 °С.

Термометр лабораторный частичного погружения класса точности I с ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498.

pH-метр с диапазоном измерений от 0 pH до 14 pH и погрешностью ± 0,1 pH в комплекте с электродами.

Стерилизатор паровой медицинский по ГОСТ 19569.

Стерилизатор воздушный но ГОСТ 27437.

Гомогенизатор лабораторный типа Stomacher.

Облучатель бактерицидный, обеспечивающий облученность не менее 0,25 Вт/м².

Холодильник бытовой, поддерживающий температуру от +2 °С до + 8 °С.

Пипетки класса точности 2, исполнения 1, вместимостью 1 см³, 5 см³,10 см³ по ГОСТ 29227 или дозаторы пипеточные с комплектом одноразовых наконечников с объемом дозирования 1000 мм³, 5000 мм³, 10000 мм³ и относительной дозирования не более 1,5 % ^{4 5}

Цилиндры мерные типа 3-1000-2 по ГОСТ 1770.

Колбы мерные типа 2-100-2 по ГОСТ 1770.

Стаканы типа Н-2-1000 или колбы конические типа Кн-2-1000-45/40 ТС по ГОСТ 25336.

Пробирки бактериологические по ГОСТ 25336.

3.2 Материалы и реактивы

Стерильные пакеты для гомогенизатора лабораторного типа Stomacher. Спиртовки лабораторные стеклянные по ГОСТ 23932.

Стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284.

Стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672.

Стерильные ватные тампоны на металлических стержнях или одноразовые стерильные аппликаторы ватные.

Подложки Sanita-kun Aerobic Count, производства JNC Corporation, Япония. Подложки Sanita-kun Yeast & Mould Rapid, производства JNC Corporation, Япония.

Натрий хлористый ч.д.а. по ГОСТ 4233.

Кислота соляная ч.д.а. по ГОСТ 3118.

Гидроокись калия ч.д.а. по ГОСТ 24363.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Могут быть использованы оборудование по метрологическим и техническим характеристикам и материалы (за исключением подложек Sanita-kun) по качеству не хуже указанных выше.

4 Метод измерений

4.1    Определение количества дрожжей и плесневых грибов

Метол определения количества дрожжей и плесневых грибов основан на посеве определенной навески (аликвоты) образца или его разведения на подложки Sanita-kun Yeast & Mould Rapid, содержащие стандартный набор питательных веществ и хромогенный субстрат. После инкубации посевов, производится определение принадлежности выделенных микроорганизмов к плесневым грибам и дрожжам по результатам микроскопического исследования. Результат измерений получают путем подсчета всех выросших на подложке колоний плесневых грибов или дрожжей.

4.2    Определение количества мезофильных аэробных и

Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов основан на посеве определенной навески (аликвоты) образца или его разведения на подложки Sanita-kun Aerobic Count, содержащие стандартный набор питательных веществ и хромогенный субстрат. Восстановление хромогена в точках роста бактерий приводит к окрашиванию

5    Требования безопасности и требования к квалификации операторов

5.1    Требования безопасности

При выполнении работ персонал должен знать и строго соблюдать на рабочем месте требования:

•    элекгробезопасности по ГОСТ 12.2.003;

•    пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004;

•    техники безопасности при работе с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами в соответствии с [2];

•    техники безопасности, изложенные в инструкции по эксплуатации средств измерений и оборудования, применяемых при выполнении работ по данной методике.

Параметры микроклимата на рабочих местах должны соответствовать требованиям [3].

Все использованные после анализа подложки Sanita-kun и другие загрязненные материалы необходимо продезинфицировать в соответствии с [2], СТБ ISO 7218.

5.2    Требования к квалификации персонала

К проведению работ по данной методике допускаются лица, имеющие высшее или среднее специальное образование по профилю выполняемых работ, прошедшие обучение по выявлению микроорганизмов с использованием подложек Sanita-kun, изучившие правила безопасной работы в микробиологических лабораториях, настоящую методику и допущенные к работе с микроорганизмами III-IV групп патогенности.

6    Условия выполнения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

•    температура окружающего воздуха от плюс 20 °С до плюс 25 °С;

•    относительная влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С.

7    Условия хранения подложек Sanita-kun

Хранение подложек Sanita-kun в невскрытом оригинальном пакете осуществляется в холодильнике при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в течение срока хранения, указанного на упаковке. Не допускается замораживать подложки Sanita-kun. Неиспользованные подложки Sanita-kun хранят в закрытом при помощи скрепки оригинальном пакете в холодильнике при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С не более 30 дней.

8    Подготовка к выполнению измерений

8.1 Отбор проб

Отбор проб проводят по ГОСТ 26668, а также в соотвстс$[ конкретные виды анализируемой продукции. Отбор проб при конval поверхностей методом смывов осуществляется в соответствии с njfefc

8.2    Подготовка лабораторной посуды

Подготовку лабораторной посуды проводят в соответствии с СТБ ISO 7218.

8.3    Приготовление растворов

8.3.1    Приготовление стерильного физиологического раствора

Навеску 8,5 г хлористого натрия, взвешенную с погрешностью 0,1 г, помещают в коническую колбу или стакан вместимостью 1000 см³ и растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, отмеренной цилиндром. Раствор стерилизуют при температуре (120 ± 1) °С в течение 20 мин. Хранят раствор при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в герметично закрытой посуде из химически стойкого стекла не более тридцати суток.

8.3.2    Приготовление 1 н раствора гидроокиси калия

Навеску гидроокиси калия массой 5,6 г, взвешенную с погрешностью 0,1 г, вносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют дистиллированную воду в гаком количестве, чтобы колба заполнилась примерно на половину своей вместимости. После растворения гидроокиси калия, раствор доводят до метки дистиллированной водой. Раствор стерилизуют при температуре (120± 1) °С в течение 20 мин. Хранят Раствор при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в герметично закрытой полиэтиленовой или фторопластовой посуде не более тридцати суток.

8.3.3    Приготовление 1 н раствора соляной кислоты

В мерную колбу вместимостью 100 см³ наливают 50 - 70 см³ дистиллированной воды, затем добавляют отмеренные пипеткой 8,5 см³ концентрированной соляной кислоты плотностью 1,18 г/см . После перемешивания раствора доводят объем до метки дистиллированной водой. При использовании кислоты другой плотности ее объем необходимо пересчитывать. Раствор стерилизуют при температуре (120±1)°С в течение 20 мин. Хранят раствор при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в герметично закрытой посуде из химически стойкого стекла не более тридцати суток.

8.4 Подготовка проб пищевых продуктов

8.4.1 Подготовка и отбор навесок

Подготовку проб и отбор навесок производят в соответствии с ГОСТ 26669 и ТНПЛ на хонкретные виды анализируемых образцов с учетом изложенных далее условий.

Замороженные продукты перед взятием навески размораживают при температуре (4 ± 2) °С. Навеску размороженного продукта отбирают непосредственно после размораживания.

Вскрытие упаковки производят в условиях, исключающих загрязнение продукта микроорганизмами, в непосредственной близости от пламени горелки стерильными инструментами.

Упаковки с ультрапастеризованным, стерилизованным молодом: _,или стерилизованной жидкой молочной смесью выдерживают    при*

температуре (37 ± 1) °С в течение 5 сут. По истечении срока те потребительскую тару с продуктом охлаждают до (20 ± 5) °С и

осмотр. Дальнейшему испытанию подвергают упаковки без видимых дефектов и признаков порчи (вздутие упаковки, изменение внешнего вида и др.).

Жидкие образцы перемешивают, твердые гомогенизируют в асептических условиях, исключая возможность контаминации.

Перед отбором навесок проверяют величину pH жидкого образца с помощью рН-мстра. Если при проверке pH не находится в диапазоне от 6,6 до 7,2, то pH ре1улируют путем добавления по каплям 1 н стерильного раствора гидроокиси калия или соляной кислоты, приготовленного по п. 8.3.2 или п. 8.3.3 соответственно.

Навеску для посева отбирают весовым или объемным методом непосредственно после вскрытия пробы продукта.

Масса (объем) навески, предназначенной для посева и/или приготовления разведений, должна быть установлена в нормативно-технической документации на конкретный вид продукции или методы анализа. Масса (объем) навески должна составлять не менее 10*0 ±0,1 г (см³).

Навеску продукта отбирают так, чтобы в ней были представлены все его компоненты с учетом их соотношения в анализируемой пробе.

8.4.2 Приготовление разведений

Приготовление разведений производят в соответствии с ГОСТ 26669 и Т1IIIA на конкретные виды анализируемых образцов с учетом изложенных далее условий.

Степень разведения выбирается на основании информации об установленных в ТИПА нормах на количество целевых микроорганизмов для анализируемых продуктов.

После приготовления первого разведения твердого образца проверяют величину pH с помощью pH-метра. Если при проверке pH не находится в диапазоне от 6,6 до 7,2, то pH регулируют путем добавления по каплям 1 н стерильного раегвора гидроокиси калия или соляной кислоты, приготовленного по п. 8.3.2 или п. 8.3.3 соответственно.

Для приготовления исходного разведения и последующих разведений используется стерильный физиологический раствор, приготовленный по п. 8.3.1.

Соотношение между массой (объемом) высеваемого образца или его разведения и стерильным физиологическим раствором составляет 1:9.

Продукты жидкой консистенции могут быть использованы для проведения анализа согласно п. 8.4.3 без их разведения.

8.4.3 Проведение микробиологических испытаний пищевых продуктов

Перед использованием подложки Sanita-kun Aerobic Count и Sanita-kun Yeast & Mould Rapid выдерживают при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение 20 мин.

Подложки Sanita-kun Aerobic Count, Sanita-kun Yeast & Mould Rapid помещают на ровную поверхность. Полностью или частично снимают прозрачную пленку подложки.

1,0 см³ продукта, подготовленного по п. 8.4.1, и/или его разведения, приготовленного по п. 8.4.2, пипеткой или дозатором вносят в центр подложки, после чего опускают прозрачную пленку на образец, нс допуская oepaaojeH^SBo^^ibKOB воздуха. Затем пленку прижимают по периметру подложки, изб^ центральной частью.

Если для проведения испытаний используют подготов образцы ультрапастеризованного, стерилизованного молока жидкой молочной смеси, то посев производят на три подло!

параллельных посева. В остальных случаях посев производят на две подложки, получая два параллельных посева из одного образца и/или его разведения.

8.5 Взятие смывов с поверхностей

В пробирку пипеткой или дозатором вносят 10 см³ стерильного физиологического раствора. Стерильный тампон помещают в пробирку таким образом, чтобы он не касался жидкости. Перед взятием смыва тампон погружают в раствор. Выполняют протирку поверхности тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором, в соответствии с ТИПА по санитарно-гигиеническому контролю. После протирки поверхности тампон переносят в исходную пробирку со стерильным физиологическим раствором, после чего встряхивают пробирку. Снимают пленку с двух подложек и вносят пипеткой или дозатором по 1 см³ подученного раствора в центр каждой подложки, получая два параллельных посева из одного смыва. При оценке результатов измерений в соответствии с п. 10 для данного метода подготовки смывов следует учитывать фактическое разведение 1:10.

8.6 Инкубация подложек

Подложки Sanita-kun Aerobic Count, подготовленные но н. 8.4.3,8.5 инкубируют в термостате в течение 24 ± 3 ч при температуре 36 ± 1 °С. Подложки Sanita-kun Yeast & Mould Rapid, подготовленные по п. 8.4.3, 8.5 инкубируют в термостате в течение 72 ± 3 ч при температуре 24 ± 1 °С.

В термостате подложки располагают в горизонтальном положении прозрачной пленкой вверх. Допускается размещать подложки друг на друга (до 30 шт.).

Выполнение измерений

9.1 Подсчет колоний на подложках

После инкубации подложек Sanita-kun Aerobic Count согласно п. 8.6 подсчитывают все красные колонии, независимо от их размера и интенсивности окраски, получая количество колоний С на подложке.

После инкубации подложек Sanita-kun Yeast & Mould Rapid согласно п. 8.6 подсчитывают все колонии дрожжей и плесеней, получая количество колоний С на подложке.

При подсчете колоний дрожжей и плесеней руководствуются следующими признаками:

•    колонии дрожжей на подложках голубые либо синие, круглой либо овальной формы с четким краем;

•    колонии плесневых грибов опушенные, более диффузные, чем колонии дрожжей, большего размера, голубые, красно-фиолетовые, синие либо голубые с красно-фиолетовым центром.

При невозможности однозначной визуальной идентификации колоний дрожжей и плесневых грибов для дополнительного подтверждения проводят микроскопическое исследование. Для выполнения микроскопического исследования по^щшают

*-^геля. Из '^с

1

применимо ам результатов измерений образцов стерилизованной жидкой молочной смеси

2

применимо для результатов измерений образцов ультрапастеризованного, стерилизованной жидкой молочной смеси

3

зам.

4

* оценки неопределенности приведены при С * CV., где С - среднее значение резулы (см. п. 9.2); С_ - минимально определяемое количество колоний (см.п. 9.3). Оценивай

значений С. отличных от указанных в таблице 2, производится согласно п. 11.1.

5

зам.