ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫМ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, КОРМА, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Метод определения содержания анаболических стероидов и производных стильбена с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2011

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Федеральным государственным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»), Федеральным государственным учреждением «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория» (ФГУ «ЦНМВЛ»)

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»

3    УТВЕРЖДЕН Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2010 г. № 649-ст

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ, 2011

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Проверяют приемлемость полученных значений коэффициента отклика К) для каждого аналита анализируемых градуировочных уровней, используя неравенство

гдеК,^тах — максимальное значение /'-го коэффициента отклика;

КГ — минимальное значение /'-го коэффициента отклика;

К, — среднее значение /'-го коэффициента отклика; d₍- — относительная разность коэффициентов отклика.

Значения d₍. (при Р = 0,95) не должны превышать: 5 % (п = 3) или 4 % (п = 2); п — число параллельных определений /'-го коэффициента отклика для каждого градуировочного уровня.

6.4.4    При отсутствии дейтерированных производных анаболических стероидов и производных стильбена используют метод абсолютной градуировки. Образцы для градуировки готовят по 6.4.2, за исключением введения раствора дейтерированных производных.

6.4.5    Расчеты коэффициента отклика и площади пика выполняют с помощью системы обработки данных в автоматическом режиме.

6.4.6    Градуировочную характеристику считают приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение квадрата коэффициента корреляции для каждого аналита >0,98, а значение «Accuracy» для каждой точки градуировочной кривой находится в диапазоне 80 %—120 %.

6.4.7    Построение новой градуировочной кривой проводят после каждого включения газового хроматографа (остановка работы для сервисного обслуживания или текущей профилактики).

6.5 Условия хроматографических измерений

6.5.1    Газовый хроматограф с масс-спектрометрическим детектором включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры, рекомендуемые изготовителем капиллярных колонок. Например, для кварцевой капиллярной колонки 30 м х 0,25 мм х 0,25 мкм применяют следующие хроматографические условия:

-    газ-носитель — гелий;

-    скорость потока газа носителя 1 см³/мин;

-    температура инжектора 280 °С;

-    инжектор в режиме без деления потока;

-    температурная программа колонки:

-    начальная температура 100 °С в течение 0,5 мин;

-    программируемый нагрев от 100 °С до 290 °С со скоростью 8,0 °С/мин;

-    изотерма при 290 °С до 40 мин;

-    время анализа 40 мин;

-    объем пробы от 1 до 5 мм³.

Допускается использование других хроматографических условий, обеспечивающих разделение компонентов пробы.

6.5.2    Градуировку и настройку масс-спектрометрического детектора в режиме электронной ионизации и тандемной масс-спектрометрии проводят согласно инструкции по эксплуатации прибора.

7 Порядок выполнения измерений

7.1    Обработка проб органов, тканей, мочи, желчи животных и кормов

7.1.1    100 г мышечной ткани, предварительно очищенной от грубой соединительной ткани, измельчают на гомогенизаторе и взвешивают на лабораторных весах по 5,0 г гомогенизированной пробы в двух флаконах вместимостью по 40 см³. Во флаконы добавляют 15 см³трис-буфера (6.3.1), 5 мг протеолитического фермента и пипеточным дозатором вносят по 50 мм³ раствора дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации 10 нг/см³.

Флаконы закрывают крышкой с тефлоновой прокладкой и помещают на нагревательный модуль с магнитной мешалкой при температуре 55 °С на 3 ч. Затем флаконы с образцами охлаждают до комнатной температуры и приливают 2 см³ соляной кислоты. Гидролизат экстрагируют два раза по 15 см³ метил-трет-бутиловым эфиром, собирая эфирные фракции в отдельный флакон. При неполном отделении метил-трет-бутилового эфира флаконы с образцами помещают на центрифугу и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 3 мин. Объединенные эфирные экстракты упаривают на ротационном испарителе досуха. Сухой остаток растворяют в 4 см³ метанола, затем приливают 1 см³ деионизованной воды и

ГОСТ Р 54035-2010

обезжиривают два раза по 3 см³ н-Гексаном. Водно-метанольную фракцию очищают методом твердофазной экстракции (ТФЭ), а затем методом ВЭЖХ.

Если интересующие компоненты представлены в виде эфиров (например, гестагены или ацетат тренболона), дополнительно проводят их щелочной гидролиз. Для этого сухой остаток растворяют в 0,2 см³ щелочного раствора для гидролиза (6.3.2) и помещают на нагревательный модуль при температуре 37 °С на 30 мин. Гидролиз останавливают добавлением 1 см³ «кислого» буферного раствора (6.3.4) и обезжиривают два раза по 3 см³ н-Гексаном.

7.1.2    Пробу печени или почек измельчают на гомогенизаторе и взвешивают на лабораторных весах по 5,0 г гомогенизированной пробы в двух флаконах вместимостью по 40 см³. Во флаконы добавляют по 15 см³ ацетатного буферного раствора (6.3.3) и 50 мм³ пищеварительного сока Helix pomatia. Пипеточным дозатором вносят по 50 мм³ раствора дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации 10 нг/см³ и ставят флаконы на нагревательный модуль при температуре 37 °С на 15 ч для ферментативного гидролиза коньюгатов стероидов. После гидролиза флаконы с образцами охлаждают до комнатной температуры, добавляют 2 см³ соляной кислоты и экстрагируют два раза по 15 см³ метил-трет-бутиловым эфиром. При неполном отделении метил-трет-бутилового эфира флаконы с образцами помещают на центрифугу и центрифугируют при 3000 об/мин втечение 3 мин. Объединенные эфирные экстракты переносят в круглодонную колбу и упаривают на ротационном испарителе досуха. Сухой остаток растворяют в 4 см³ метанола, затем приливают 1 см³ деионизованной воды и обезжиривают два раза по 3 см³ н-Гексаном. Водно-метанольную фракцию очищают методом ТФЭ (7.2), а затем методом ВЭЖХ (7.3).

7.1.3    Во флакон вносят 10 см³ мочи, 10 см³ ацетатного буферного раствора (6.3.3) и 100 мм³ пищеварительного сока Helix pomatia. Пипеточным дозатором вносят 50 мм³ раствора дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации 10 нг/см³ и ставят флаконы на нагревательный модуль при температуре 52 °С на 15 ч для ферментативного гидролиза коньюгатов стероидов. Энзиматический гидролизат охлаждают до комнатной температуры и очищают методом ТФЭ (7.2), а затем методом ВЭЖХ (7.3).

7.1.4    Во флакон вносят 5 см³ желчи, 15 см³ ацетатного буферного раствора (6.3.3) и 100 мм³ пищеварительного сока Helix pomatia. Далее проводят обработку пробы в соответствии с 7.1.3.

7.1.5    5 г жира взвешивают на лабораторных весах в стеклянном флаконе вместимостью 40 см³. Во флакон добавляют 20 см³ н-Гексана и 10 см³ ацетонитрила. Пипеточным дозатором вносят 50 мм³ раствора дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации 10 нг/см³. Помещают флакон на ультразвуковую баню на 15 мин до полного растворения жира. Затем интенсивно перемешивают, флакон с образцом помещают на центрифугу и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Ацетонитрильную фракцию отбирают и повторяют жидкостно-жидкостную экстракцию 10 см³ ацетонитрила. Объединенные ацетонитрильные фракции упаривают досуха на ротационном испарителе. Сухой остаток растворяют в 1 см³ метанола, а затем приливают 1 см³ деионизованной воды и обезжиривают два раза по 3 см³ н-Гексаном. Водно-метанольную фракцию очищают методом ТФЭ (7.2), а затем методом ВЭЖХ (7.3).

7.1.6    100 г кормов измельчают на гомогенизаторе и взвешивают на лабораторных весах по 5,0 г гомогенизированной пробы в двух флаконах вместимостью по 40 см³. Во флаконы добавляют 20 см³ раствора метанола и деионизованной воды, взятых в соотношении 80:20, и пипеточным дозатором вносят по 50 мм³ раствора дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации 10 нг/см³. Помещают флаконы на ультразвуковую баню на 20 мин. Затем интенсивно перемешивают, флаконы с образцами помещают на центрифугу и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадоч-ный слой обезжиривают два раза по 5 см³ н-Гексана и упаривают на ротационном испарителе при температуре 40 °Сдо окончания упаривания метанола. Водный остаток очищают методом ТФЭ (7.2), а затем методом ВЭЖХ (7.3).

7.2 Очистка методом твердофазной экстракции

Картриджи для ТФЭ объемом 12 см³ с 1 г сорбента С18 40 мкм кондиционируют на вакуумном устройстве для ТФЭ, пропуская последовательно 10 см³ метанола и 4 см³ деионизованной воды. К вод-но-метанольному экстракту, полученному после стадий экстракции в соответствии с7.1.1—7.1.6, приливают 15 см³ деионизованной воды и пропускают через кондиционированный картридж со скоростью элюирования не более двух капель в секунду. Промывают картридж последовательно 2 см³ деионизованной воды, 10 см³ раствора метанола и деионизованной воды, взятых в соотношении 20:80,5 см³ раствора метанола и деионизованной воды, взятых в соотношении 40:60. Элюируют аналиты 10 см³ раствора метанола и деионизованной воды, взятых в соотношении 80:20. Упаривают элюат на ротаци-

онном испарителе при температуре от 45 °С до 48 °С до 1 или 1,5 см³. Водный остатокочищают методом

вэжх.

7.3 Очистка методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

7.3.1    Систему ВЭЖХ с бинарным градиентом и спектрофотометрическим детектором подготавливают в соответствии с руководством по эксплуатации прибора. Вместо петли инжектора устанавливают предколонку С18. Разделение анаболических стероидов и производных стильбена проводят на аналитической колонке С18 (250 мм х 4,6 мм х 5 мкм). При этом соблюдают следующие хроматографические условия:

-    подвижная фаза: А — метанол 30 %, Б — вода 70 %;

-    градиент до 100 % подвижной фазы А к 10 мин, с 10 до 15 мин — 100% А, с 15 до 23 мин соотношение А/Б—30/70;

-    скорость потока подвижной фазы — 1 см³/мин.

7.3.2    Порядок элюирования анаболических стероидов и производных стильбена: тренболон (7,0 мин), нортестостерон, транс-диэтилстильбэстрол, этинилэстрадиол, гексестрол, диенэстрол, эстрадиол, тестостерон, метилтестостерон, цисдиэтилстильбэстрол, прогестерон (11,5 мин). Времена удерживания уточняют после предварительного анализа стандартного раствора концентрации 1 мкг/см³ для каждого аналита при спектрофотометрическом детектировании 254 нм. Время отбора интересующей фракции должно быть больше на 1 мин времени удерживания последнего аналита.

7.3.3    В положении Load инжектора пропускают через предколонку 0,5 см³ деионизованной воды, а затем водный остаток пробы после ТФЭ очистки. Переводят инжектор в положение Inject и собирают фракцию, соответствующую временам удерживания анаболических стероидов и производных стильбена. Полученную фракцию анаболических стероидов и производных стильбена после ВЭЖХ упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 45 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ абсолютного этанола и переносят во флакон вместимостью 4 см³. Упаривают этанол досуха в токе азота на нагревательном модуле при температуре 40 °С.

7.4    Дериватизация анаболических стероидов и производных стильбена

7.4.1    Для получения триметилсилиловых производных анаболических стероидов и производных стильбена к сухому остатку после ВЭЖХ очистки пипеточным дозатором приливают 50 мм³ раствора МСТФА/ТМИС/ДТЭ (6.3.5). Помещают флаконы в нагревательный модуль на 60 мин при температуре 60 °С. Реакционную смесь переносят в стеклянные флаконы вместимостью 2 см³с вставками на 100 мм³ и используют для ГХ-МС анализа.

7.4.2    Для получения пентафторпропионовых производных анаболических стероидов и производных стильбена к сухому остатку после ВЭЖХ очистки пипеточным дозатором приливают 200 мм³ ацетона и 50 мм³ пентафторпропионового ангидрида. Помещают флаконы в нагревательный модуль на 60 мин при температуре 60 °С. Реакционную смесь упаривают досуха в токе азота на нагревательном модуле при температуре 40 °С. Сухой остаток растворяют в 50 мм³ изооктана, переносят в стеклянные флаконы вместимостью 2 см³ с вставками на 100 мм³ и используют для анализа.

7.4.3    Данный метод дериватизации используют для получения метилоксим/триметилсилиловых (МО/ТМС) производных тренболона и других кетостероидов. При этом к сухому остатку после ВЭЖХ очистки пипеточным дозатором приливают 100 мм³ 2 %-ного раствора метоксиламин гидрохлорида в сухом пиридине (6.3.6). Полученную реакционную смесь помещают на нагревательный модуль при температуре 60 °С на 30 мин. По истечении указанного времени реакционную смесь упаривают досуха в токе азота. К сухому остатку добавляют 100 мм³БСТФАс 1 мм³ТМХС и помещают в нагревательный модуль при температуре 60 °С на 60 мин. Реакционную смесь упаривают досуха в токе азота на нагревательном модуле при температуре 40 °С. Сухой остаток растворяют в 50 мм³ изооктана с 5 % реакционной смеси БСТФА/ТМХС, переносят в стеклянные флаконы вместимостью 2 см³ с вставками на 100 мм³ и используют для ГХ-МС анализа.

7.5    ГХ-МС анализ

7.5.1    В инжектор хроматографа вводят от 1 до 5 мм³ пробы и проводят анализ в условиях, указанных в 6.5. При этом для каждого образца проводят не менее двух определений.

7.5.2    Времена удерживания анаболических стероидов и производных стильбена определяют при анализе градуировочных растворов. Время удерживания идентифицированных анаболических стероидов и производных стильбена в анализируемой пробе не должны отличаться от времени удерживания анаболических стероидов и производных стильбена в градуировочном растворе более чем на 2,5 %.

7.5.3    Данные о диагностических ионах дериватов анаболических стероидов и производных стильбена указаны в таблице 2.

ГОСТ Р 54035-2010

Таблица 2 — Диагностические ионы дериватов анаболических стероидов и производных стильбена

Наименование анаболического стероида и производного стильбена Т риметилсилиловое производное Метилосим/триметилсилило-вое производное Пентафторпропионовое производное Тестостерон 417/432 268/358/374/389 401/417/565/580 Тестостерон d2 419/434 270/360/376/391 403/419/567/582 Нортестостерон 418 254/285/344/375 256/402/566 Нортестостерон d3 421 257/288/347/378 256/405/569 Метилтестостерон 301/341/356/446 305/319/415/430 Метилтестостерон d3 301/344/359/449 Прогестерон 458 273/286/341/372 375/427/445/460 Диэтилстильбэстрол 217/383/397/412 217/383/397/412 291/397/531/560 Диэтилстильбэстрол d6 220/386/400/418 220/386/400/418 294/403/534/566 Диенэстрол 381/395/410 381/395/410 395/530/543/558 Диенэстрол d2 382/397/412 382/397/412 397/530/545/560 Эстрадиол 285/326/416 285/326/416 237/359/401/564 Этинилэстрадиол 285/425/440 285/425/440 381/396/409/424 Тренболон 240/266/340/371

8 Обработка результатов ГХ-МС анализа

8.1    В соответствии с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, оформляют таблицу пиков с использованием программного обеспечения хромато-масс-спектрометра. Метод обработки хроматограммы — внутренний стандарт. При этом используют следующую формулу:

X = ^(3)

s,a-

гдеХ, — содержание /-го аналита в анализируемой пробе, мкг/кг;

S, — площадь пика /-го аналита в анализируемой пробе;

S_/s — площадь пика внутреннего стандарта в анализируемой пробе;

M_js — содержание внутреннего стандарта в анализируемой пробе, мкг/кг;

/с, — коэффициент отклика для /'-го аналита.

8.1.1    Расчеты количества анаболического стероида и производного стильбена и площади пика выполняются системой обработки данных в автоматическом режиме.

8.1.2    Результаты измерений округляют до второго десятичного знака и выражают в мкг/кг.

За окончательный результат измерений содержания /'-го аналита принимают среднеарифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

l^X/iZ^X^ 100 <г,    (⁴)

X

гдеХ₍₁ и Х₂ — результаты параллельных определений содержания /'-го аналита, мкг/кг;

Х₍.— среднеарифметическое Х₍₁ иХ^, мкг/кг; г— предел повторяемости при Р = 0,95; значение приведено в таблице 6, %.

8.1.3    Для целей количественного и подтверждающего анализа допускается проведение измерений в различных режимах тандемной масс-спектрометрии, позволяющих получить требуемое количество подтверждающих критериев. При количественном анализе допускается проведение измерения по одному наиболее интенсивному иону в соответствии с требованиями, установленными в 8.2. Подтверждающий анализ проводят при наличии не менее четырех диагностических критериев в соответствии с требованиями, установленными в 8.2.

11

8.2 Идентификацию анаболических стероидов и производных стильбена и их количественное определение проводят с соблюдением следующих условий для масс-спектрометрического детектирования:

-    молекулярный ион используют для идентификации, если присутствует в масс-спектре с относительной интенсивностью не менее 10 %;

-    относительная ионная интенсивность каждого из диагностических ионов должна быть не менее

10%;

-    соотношение сигнал/шум для каждого диагностического иона должно быть не менее 3/1.

Относительные интенсивности детектированных ионов, выраженные как процент от интенсивности самого интенсивного иона, должны соответствовать таковым из калибровочного раствора, в сопоставимых концентрациях, измеренные при тех же самых условиях, в пределах допустимых отклонений, указанных в таблице 3.

Таблица 3 — Максимально допустимые отклонения для относительных ионных интенсивностей

Относительная интенсивность (% от основного пика) Электронная ионизация (ЭИ)-ГХ-МС (относительная), % ГХ-МС”, (относительная), % Св. 50 % ± 10 ±20 » 20 % до 50 % вкпюч. ± 15 ±25 От 10 %» 20% » ±20 ±30 Менее 10 % ± 50 ±50

При проведении подтверждающего анализа число диагностических ионов для каждого из масс-спектрометрических методов определяют с учетом идентифицирующих критериев.

Для подтверждения каждого из анаболических стероидов и производных стильбена необходимы минимум четыре идентифицирующих критерия. В таблице 4 установлено число идентифицирующих критериев в зависимости от используемых масс-спектрометрических методов.

Таблица 4 — Отношение между масс-спектрометрическими методами и количеством полученных идентифицирующих критериев

Масс-спектрометрические методы Количество идентифицирующих критериев, полученных на диагностический ион Масс-спектрометрия низкого разрешения (HP) 1,0 НР-МСП ион предшественник 1,0 НР-МС" дочерние ионы 1,5 Масс-спектрометрия высокого разрешения (ВР) 2,0 ВР-МС" ион предшественник 2,0 ВР-МС" дочерние ионы 2,5

В таблице 5 показаны примеры числа идентифицирующих критериев (п — целое число), полученных для различных масс-спектрометрических методов.

Таблица 5 — Примеры расчета идентифицирующих критериев

Методы ГХ-МС анализа Число диагностических ионов Количество идентифицирующих критериев ГХ-МС [ЭИ или химическая ионизация (ХИ)] N п ГХ-МС (ЭИ или ХИ) 2 производных 2 (Производное А) + 2 (Производное Б) 4 ГХ-МС-МС 1 предшественник и 2 дочерних 4 ГХ-МС-МС 2 предшественника, каждый с 1 дочерним 5

ГОСТ Р 54035-2010

9 Метрологические характеристики

Значения допускаемой относительной расширенной неопределенности U_rel, % (при коэффициенте охвата к = 2), измерений содержания индивидуальных анаболических стероидов и производных стиль-бена по установленному в настоящем стандарте методу приведены в таблице 6.

Фактические значения расширенной неопределенности 1/_с, мкг/кг (при коэффициенте охвата к = 2) результатов, полученных при определении содержания индивидуальных бета-адреностимуляторов и признанных приемлемыми (8.1.2), рассчитывают по формуле (7).

Таблица 6 — Метрологические характеристики метода

Диапазон измерений содержаний анаболических стероидов и производных стильбена, мкг/кг Относительная расширенная неопределенность (к = 2) Urel, % Предел повторяемости при Р = 0,95, п = 2 готн, % От 0,10 до 1,00включ. 25 20 Св. 1,00 » 10,00 » 15 10 » 10,00 10 5

10    Оформление результатов измерений

Результат анализа М_с в документах, предусматривающихего использование, представляют в виде

М_с ^— -X/, с i U_c,    (5)

где М_с — окончательный результат определения анаболического стероида и производного стильбена,

_ мкг/кг;

X, _с — среднеарифметическое двух параллельных измерений содержания /-го аналита в анализируемой пробе, выполненных в условиях повторяемости, мкг/кг;

U_c — расширенная неопределенность (при коэффициенте охвата к = 2) определения содержания /'-го аналита, определяемая по формуле (7), мкг/кг.

11    Контроль точности измерений

11.1    Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже одного раза в пять дней. Заново анализируют образцы для градуировки хроматографа по 6.4 и определяют коэффициенты отклика для каждого анаболического стероида и производного стильбена (два параллельныхопределе-ния) в тех же условиях, в которых была установлена градуировочная характеристика. Градуировочную характеристику признают стабильной, если коэффициент отклика для каждого из двух параллельных определений отличается от значения, установленного при градуировке, не более чем на 10 %. Если градуировочная характеристика нестабильна, градуировку хроматографа проводят заново.

11.2    Контроль смещения результатов измерений с помощью стандартных образцов проводят не реже одного раза в месяц. С использованием стандартной процедуры подготовки проб проводят анализ стандартных образцов в соответствии с разделом 7 и получают результат измерений содержания /'-го аналита (Х₍. _с, мкг/кг). Результаты измерений признают удовлетворительными при выполнении неравенства

|Х,,_С-Х,а| <^_C+Uf_a,    (6)

где Х₍. _с — содержание /'-го аналита в анализируемом стандартном образце, мкг/кг;

Х_{/ а} — аттестованное значение содержания /'-го аналита в стандартном образце, мкг/кг; и] _с — расширенная неопределенность (при коэффициенте охвата к = 2) результата измерений содержания /'-го аналита, полученного при соблюдении требований настоящего стандарта, мкг/кг, рассчитывают по формуле

Ц,_с = 0,15 XPf,    (7)

где Ц _а — расширенная неопределенность (при коэффициенте охвата к = 2) аттестованного содержания/'-го аналита в аттестованном стандартном образце в соответствии с паспортом (сертификатом) на конкретный стандартный образец, мкг/кг.

13

ГОСТ Р 54035-2010

Библиография

[1] ПБ 03-576—2003 Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением (Утверждены Постановлением Гостехнадзора России от 11.06.2003 № 91)

14

УДК 664.002.3.001.4:006.034    ОКС    65.120

67.050

Ключевые слова: пищевые продукты, продовольственное сырье, анаболические стероиды и производные стильбена, газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектором

15

Редактор А.Д. Чайка Технический редактор Н.С. Гоишанова Корректор М.В. Бучная Компьютерная верстка ИЛ. Налейкиной

Сдано в набор 17.11.2011. Подписано в печать 02.12.2011. Формат 60 х 84у_в. Гарнитура Ариал. Уел. печ. л. 2,32. Уч.-изд. л. 1,82. Тираж 196 экз. Зак. 1169.

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.ru    info@gostinfo.ru

Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Лялин пер., 6.

ГОСТ Р 54035-2010

Содержание

1    Область применения...................................................1

2    Нормативные ссылки..................................................1

3    Сущность метода.....................................................2

4    Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы..............2

5    Условия выполнения измерений и требования безопасности.........................4

6    Подготовка к проведению измерений........................................4

7    Порядок выполнения измерений...........................................8

8    Обработка результатов ГХ-МС анализа......................................11

9    Метрологические характеристики..........................................13

10    Оформление результатов измерений......................................13

11    Контроль точности измерений...........................................13

Библиография........................................................14

III

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, КОРМА, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Метод определения содержания анаболических стероидов и производных стильбена с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором

Food products, feeds, food raw materials.

Method of determination of anabolic steroids and stylben derivatives by gas chromatography with mass

spectrometry detector

Дата введения — 2012—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на продукты пищевые, корма, продовольственное сырье и устанавливает метод газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием для идентификации и количественного определения анаболических стероидов и производных стильбена. Диапазон измерений от 0,1 до 100,0 мкг/кг.

Метод может быть использован для идентификации и количественного определения анаболических стероидов и производных стильбена в физиологических жидкостях и органах животных.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1—91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.2.085-2002 Сосуды, работающие под давлением. Клапаны предохранительные. Требования безопасности

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб ГОСТ 13647-78 Реактивы. Пиридин. Технические условия ГОСТ 13867-68 Продукты химические. Обозначение чистоты ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

Издание официальное

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3    Сущность метода

Идентификацию и количественное определение анаболических стероидов и производных стиль-бена проводят методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ГХ-МС) с использованием аналитических стандартов анаболических веществ с учетом критериев идентификации.

Количественное определение анаболических стероидов и производных стильбена проводят методом внутреннего стандарта по площади пика идентифицированных соединений относительно градуировочной зависимости, полученной при анализе градуировочных растворов в аналогичных условиях.

4    Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы

4.1 При определении содержания анаболических стероидов и производных стильбена применяют следующие средства измерений и вспомогательное оборудование:

-    хромато-масс-спектрометр, позволяющий проводить измерения в диапазоне масс от 45 до 650 атомных единиц массы (а.е.м.), с разрешением по шкале масс не более 1,0 а.е.м. и чувствительностью в режиме ионизации электронным ударом: при инжекции в колонку 2 пг гексахлорбензола (сканирование в диапазоне от 45 до 350 а.е.м. за 1 с) отношение сигнал/шум на молекулярном ионе с m/z 284 не менее 10/1;

-    колонку кварцевую капиллярную 30 м х 0,25 мм х 0,25 мкм с индексом полярности неподвижной жидкой фазы от пяти до 30;

-    компьютер с установленным программным обеспечением для управления хромато-масс-спектрометром и обработки результатов измерений;

-    автосамплердля газового хроматографа;

-    бинарный жидкостный хроматограф со спектрофотометрическим детектором;

-    ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) колонка С18250 мм х 4,6 мм х 5 мкм;

-    ВЭЖХпредколонка С18 10 мм х 4,6 мм х 5 мкм;

-    пипетки одноканальные переменного объема 10—100 мм³,40—200 мм³,200—1000 мм³,1—5 см³ с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу не более 2 % (Transferpettor Brand, Германия)¹;

-    весы класса точности I и класса точности II с дискретностью отсчета с/=0,01 мг, поверочным делением е = 100 d по ГОСТ Р 53228;

-    модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатирования 250 °С;

-    измельчитель-гомогенизатор лабораторный;

-    испаритель ротационный со скоростью вращения от 20 до 280 об/мин и температурным диапазоном нагревательной бани от 30 °С до 100 °С;

-    центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения ротора не менее 3500 об/с и диапазоном рабочих температур от минус 10 °С до 25 °С, с адаптерами для пробирок вместимостью 15, 50 см³ и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см³;

-    картриджи для твердофазной экстракции объемом не менее 12 см³, заполненные обращен-но-фазным сорбентом С18 с диаметром частиц не более 50 мкм;

-    устройство вакуумное для твердофазной экстракции;

ГОСТ Р 54035-2010

-    флаконы стеклянные вместимостью 4 см³ с завинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками;

-    флаконы стеклянные вместимостью 40 см³ с завинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками;

-    флаконы стеклянные вместимостью 2 см³ с завинчивающимися тефлоновыми прокладками и вставками объемом 100 мм³;

-    колбы мерные стеклянные 2-10-2 по ГОСТ 1770;

-    колбы мерные стеклянные 2-100-2 по ГОСТ 1770;

-    колбы мерные стеклянные 2-1000-2 по ГОСТ 1770;

-    колбы круглодонные К-1-100-14/23 ТС по ГОСТ25336;

-    баню ультразвуковую с рабочей частотой не менее 20 кГц и объемом не менее 1 дм³;

-    pH-метр с набором электродов, с пределами абсолютной погрешности измерений + 0,01 pH. Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования с метрологическими и техническими характеристиками не ниже указанных.

4.2    При выполнении измерений применяют следующие реактивы и материалы:

-    гелий газообразный марки «60»;

-    фермент протеолитический Subtilisine A (Sigma, Германия, № Р-5380)²;

-    уксусную кислоту по ГОСТ 61, х. ч.;

-    соляную кислоту по ГОСТ 3118, х. ч.;

-    натрий уксуснокислый, х. ч.;

-    эфир метил-трет-бутиловый для хроматографии;

-    воду деионизованную;

-    Л/-метил-Л/-триметилсилил-трифторацетамид (МСТФА) (Sigma, Германия, № М-7891)²;

-    триметилйодсилан (ТМИС) (Aldrich, Германия, № 19,552-9)²;

-    дитиоэритритол (ДТЭ), х. ч.;

-    пиридин по ГОСТ 13647;

-    Л/,Л/-бис-триметилсилилтрифторацетамид (БСТФА) (Sigma, Германия, №Т-5634)²;

-    триметилхлорсилан (ТМХС) (Sigma, Германия № Т-4252)²;

-    пентафторпропионовый ангидрид, х. ч.;

-    метоксиламин гидрохлорид ангидрид (Aldrich, Германия, №22,690-4)²;

-    н-Гексан,х. ч.;

-    калия гидроокись по ГОСТ 24363, х. ч.;

-    метанол-яд по ГОСТ 6995;

-    этанол абсолютный, х. ч.;

-    изооктан, х. ч.;

-    кальций хлористый двухводный, х. ч.;

-    ацетон по ГОСТ 2603, х. ч.;

-    сорбентС1840 мкм (Varian, США, №12213012)²;

-    сок пищеварительный Helix pomatia (Merck, Германия, № 1.04114)²;

-    натрий сернокислый по ГОСТ4166, х. ч.;

-    ацетонитрил, ч. д. а.;

-    трис(гидроксиметил)-аминометан, х. ч.

Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 х.ч. или Зч.д.а. по ГОСТ 13867.

4.3    Для определения содержания анаболических стероидов и производных стильбена применяют следующие стандартные образцы:

-    диэтилстильбэстрол-бб с содержанием основного вещества не менее 99,0 % (RIKILT³, BRS 01 )²;

-    диенестрол-62 с содержанием основного вещества не менее 99,0 % (RIKILT, BRS 02)²;

-    гексестрол-64 с содержанием основного вещества не менее 98,0 % (RIKILT, BRS 03)²;

-    нортестостерон-63 с содержанием основного вещества не менее 98,0 % (RIKILT, BRS 04)²;

-    метилтестостерон-63 с содержанием основного вещества не менее 98,0 % О (RIKILT, BRS 05)²;

-17р-Эстрадиол-бЗ с содержанием основного вещества не менее 98,0 % (RIKILT, BRS 54)²;

-17р-Тестостерон-б2 с содержанием основного вещества не менее 98,0 % (RIKILT, BRS 55)²;

-    17а-Нортестостерон с содержанием основного вещества не менее 99,0 % (RIKILT, BRS 56)²;

-    17а-Тренболон с содержанием основного вещества не менее 99,0 % (RIKILT, BRS 57)²;

-17(3-Тренболон с содержанием основного вещества не менее 99,0 % (RIKILT, BRS 58)*;

-17(3-Тренболон-с12 с содержанием основного вещества не менее 99,0 % (RIKILT, BRS 59)*;

-17р-Тренболон-с13 с содержанием основного вещества не менее 99,0 % (RIKILT, BRS 72)*;

-17-Метилтестостерон с содержанием основного вещества не менее 98,0 % (Acros, 225730050)*;

-17а -Этинилэстрадиол с содержанием основного вещества не менее 98,0 % (Sigma, Е-4876)*;

-    р-Эстрадиол с содержанием основного вещества не менее 98,0 % (Sigma, Е-8875)*;

-17р-Тестостерон с содержанием основного вещества не менее 99,0 % (Acros, 164410050)*;

-    прогестерон с содержанием основного вещества не менее 99,0 % (Sigma, Р-0130)*;

-19-Нортестостерон с содержанием основного вещества не менее 99,0 % (Пика, 74640)*;

-    диенэстрол с содержанием основного вещества не менее 98,0 % (Sigma, D-3253)*;

-    гексестрол с содержанием основного вещества не менее 99,0 % (Sigma, Н-7753)*;

-    диэтилстильбэстрол с содержанием основного вещества не менее 99,0 % (Sigma, D-4628)*;

-    стандартные образцы с аттестованным содержанием анаболических веществ*:

1)    лиофилизованная моча с аттестованным содержанием диэтилстильбэстрола (IRMM**, BCR-411);

2)    лиофилизованное мясо с аттестованным содержанием диэтилстильбэстрола (IRMM, BCR-411);

3)    лиофилизованная печень с аттестованным содержанием 17а-Тренболона (IRMM, BCR-474/475).

5 Условия выполнения измерений и требования безопасности

5.1    Используемые в работе реактивы относятся к веществам 1-го и 2-го классов опасности по ГОСТ 12.1.007, при работе с ними необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005.

5.2    Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией.

5.3    Операции по приготовлению и дозированию градуировочных растворов в процессе подготовки проб следует проводить под тягой в вытяжном шкафу.

5.4    При проведении испытаний следует соблюдать ГОСТ 12.2.085.

5.5    При выполнении измерений нахромато-масс-спектрометре следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.6    К выполнению измерений методом газовой хроматографии допускаются лица, владеющие техникой ГХ-МС и изучившие инструкции по эксплуатации применяемой аппаратуры.

5.7    При определении анаболических стероидов и производных стильбена в лаборатории должны

5.8 Хроматографические измерения проводят в условиях, указанных в инструкции по эксплуатации соответствующего прибора.

6 Подготовка к проведению измерений

6.1    Отбор проб

6.1.1    Отбор проб мяса и мясных продуктов, включая мясо и продукты из мяса птицы, проводят в соответствии с ГОСТ Р 51447.

6.1.2    Объем отбираемых образцов мочи должен быть не менее 40 см³.

Объем отбираемых образцов желчи должен быть не менее 30 см³.

Отобранные образцы мочи и желчи при отсутствии возможности исследования в день отбора замораживают при температуре минус 20 °С до проведения исследования.

* Указанные реактивы и стандартные образцы являются рекомендуемыми к применению. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

** Институт референтных материалов и измерений, расположенный в Бельгии.

4

ГОСТ Р 54035-2010

6.1.3 Отбор проб кормов — по ГОСТ 13496.0.

6.2    Подготовка хромато-масс-спектрометра к выполнению измерений

Подготовку хромато-масс-спектрометра к работе осуществляют в соответствии с техническим руководством по эксплуатации прибора.

6.3    Приготовление растворов

6.3.1    Приготовление трис-буфера молярной концентрации 0,1 моль/дм³ и pH 9,5

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 12,1 г трис(гидроксиметил)-амино-метана и 7,3 г кальция хлористого двухводного, растворяют в 800 см³ деионизованной воды, измеряют pH, доводят значение pH до (9,5 + 0,1) соляной кислотой молярной концентрации 1 моль/дм³ (6.3.7) и доводят объем до метки деионизованной водой.

Срок хранения при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 1 мес.

6.3.2    Приготовление щелочного раствора для гидролиза

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 5,6 г гидроокиси калия, растворяют в 80 см³ метанола и доводят объем до метки метанолом.

Срок хранения при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 1 недели.

6.3.3    Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 0,2 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 16,4 г натрия уксуснокислого, растворяют в 900 см³ деионизованной воды, измеряют pH, доводят значение pH до (5,2 + 0,1) концентрированной уксусной кислотой и доводят объем до метки деионизованной водой.

Срок хранения при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 1 мес.

6.3.4    Приготовление «кислого» буферного раствора

Для приготовления «кислого» буферного раствора смешивают 1,7 см³ соляной кислоты с 98,3 см³ ацетатного буферного раствора (6.3.3) в мерной колбе вместимостью 100 см³.

Срок хранения при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 1 недели.

6.3.5    Приготовление раствора для дериватизации

Для приготовления раствора МСТФА/ТМИС/ДТЭ смешивают 1000 мм³ МСТФА и 5 мм³ ТМИС во флаконе вместимостью 2 см³, добавляют к полученному раствору 2 мг ДТЭ.

Срок хранения при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 1 недели.

6.3.6    Приготовление 2 %-ного раствора метоксиламин гидрохлорида в сухом пиридине

Для приготовления раствора 0,04 г метоксиламин гидрохлорида вносят во флакон вместимостью 4 см³ и приливают 2 см³ пиридина.

Срок хранения при комнатной температуре в вытяжном шкафу — не более 1 недели.

6.3.7    Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 1 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ приливают 500 см³ деионизованной воды, вносят 81 см³ концентрированной соляной кислоты и доводят объем до метки деионизованной водой.

Срок хранения при комнатной температуре — не более 1 мес.

6.3.8    Приготовление растворов внутреннего стандарта

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 1 мг стандартного образца дейтрированных производных, приливают 80 см³ этанола, перемешивают и помещают раствор на 1 мин на ультразвуковую баню, затем доводят объем до метки этанолом. В мерную колбу вместимостью 10 см³ пипеточным дозатором вносят 0,1 см³ приготовленного раствора и доводят объем до метки этанолом.

Массовая концентрация раствора внутреннего стандарта составляет 0,1 мкг/см³.

6.3.9    Приготовление стандартного раствора С₀ анаболических стероидов и производных стильбена

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 10 мг стандартного образца, приливают 80 см³ этанола, перемешивают и помещают раствор на 1 мин на ультразвуковую баню, затем доводят объем до метки этанолом.

Массовая концентрация каждого соединения в растворе С₀ составляет 0,1 мг/см³.

Срок хранения при температуре не выше минус 18 °С — не более 12 мес.

6.3.10    Приготовление стандартного раствора С₁ анаболических стероидов и производных стильбена

В мерную колбу вместимостью 10 см³ пипеточным дозатором вносят 0,1 см³ стандартного раствора С₀ (6.3.9) и доводят объем до метки этанолом.

Массовая концентрация каждого соединения в растворе С^ составляет 1000 нг/см³.

Срок хранения при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 4 мес.

5

6.3.11    Приготовление стандартного раствора С₂ анаболических стероидов и производных стильбена

В мерную колбу вместимостью 10 см³ пипеточным дозатором вносят 1 см³ стандартного раствора С₁ (6.3.10) и доводят объем до метки этанолом.

Массовая концентрация каждого соединения в растворе С₂ составляет 100 нг/см³.

Срок хранения при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 4 мес.

6.3.12    Приготовление стандартного раствора С₃ анаболических стероидов и производных стильбена

В мерную колбу вместимостью 10 см³ пипеточным дозатором вносят 1 см³ стандартного раствора С₂ (6.3.11) и доводят объем до метки этанолом.

Массовая концентрация каждого соединения в растворе С₃ составляет 10 нг/см³.

Срок хранения при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 4 мес.

6.3.13    Приготовление стандартного раствора С₄ анаболических стероидов и производных стильбена

В мерную колбу вместимостью 10 см³ пипеточным дозатором вносят 5 см³ стандартного раствора С₃ (6.3.12) и доводят объем до метки этанолом.

Массовая концентрация каждого соединения в растворе С₄ составляет 5 нг/см³.

Срок хранения при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 4 мес.

6.3.14    Приготовление градуировочных растворов анаболических стероидов и производных стильбена

Для приготовления градуировочного раствора массовой концентрации 0,1 нг/см³ к сухому остатку после упаривания чистой пробы исследуемого типа матриц вносят 0,02 см³ стандартного раствора С₄ (6.3.13), приливают 0,1 см³ раствора каждого внутреннего стандарта (6.3.8). Затем пипеточным дозатором вносят 0,88 см³ этанола, переносят на шейкер и гомогенизируют. Затем помещают на центрифугу и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин при температуре 10 °С.

Для приготовления градуировочного раствора массовой концентрации 0,5 нг/см³ используют стандартный раствор С₄ (6.3.13).

Для приготовления градуировочного раствора массовой концентрации 1 нг/см³ используют стандартный раствор С₃ (6.3.12).

Для приготовления градуировочного раствора массовой концентрации 10 нг/см³ используют стандартный раствор С₂ (6.3.11).

Для приготовления градуировочного раствора массовой концентрации 100 нг/см³ используют стандартный раствор Сi (6.3.10).

К сухому остатку после упаривания чистой пробы исследуемого типа матриц вносят 0,1 см³ соответствующего стандартного раствора, приливают 0,1 см³ раствора внутреннего стандарта (6.3.8). Затем пипеточным дозатором вносят 0,8 см³ этанола, переносят на шейкер и гомогенизируют. Затем помещают на центрифугу и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин при температуре 10 °С.

Приготовленные градуировочные растворы и растворы внутренних стандартов хранят в морозильнике при температуре не выше минус 20 °С. Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.4 Подготовка газового хроматографа к выполнению измерений

6.4.1    Подготовку газового хроматографа к работе осуществляют в соответствии с техническим руководством по эксплуатации прибора. Для получения градуировочных характеристик устанавливают параметры газового хроматографа в соответствии с 6.5.1.

6.4.2    Для получения градуировочных данных используют градуировочные растворы анаболических стероидов и производных стильбена и растворы ихдейтерированных производных в соответствии с таблицей 1, внесенные в заведомо чистые образцы исследуемого типа матриц (градуировочные растворы анаболических стероидов, производных стильбена и ихдейтерированные производные вносят в матрицу перед этапом дериватизации). В качестве внутреннего стандарта используют дейтерированные производные определяемых соединений. Для каждого анаболического стероида и производного стильбена используют соответствующее дейтерированное производное.

6

ГОСТ Р 54035-2010

Таблица 1 — Массовая концентрация анаболических стероидов и производных стильбена в градуировочных растворах

Наименование анаболического стероида и производного стильбена Градуировочный уровень № 1 №2 №3 №4 №5 Массовая концентрация, нг/см3 Нативные анаболические стероиды и производные стильбена 17а-Нортестостерон 0,1 0,5 1 10 100 17|3-Нортестостерон 0,1 0,5 1 10 100 17а-Тренболон 0,1 0,5 1 10 100 17р-Тренболон 0,1 0,5 1 10 100 а-Эстрадиол 0,1 0,5 1 10 100 Р-Эстрадиол 0,1 0,5 1 10 100 17а-Этинилэстрадиол 0,1 0,5 1 10 100 17-Метилтестостерон 0,1 0,5 1 10 100 17а-Тестостерон 0,1 0,5 1 10 100 17р-Тестостерон 0,1 0,5 1 10 100 Диенэстрол 0,1 0,5 1 10 100 Г ексестрол 0,1 0,5 1 10 100 Диэтилстильбэстрол 0,1 0,5 1 10 100 Прогестерон 0,1 0,5 1 10 100 Изотопно-меченые анаболические стероиды и производные стильбена/внутренний стандарт Нортестостерон-с13 10 10 10 10 10 17р-Тренболон-с13 10 10 10 10 10 17р-Эстрадиол-с13 10 10 10 10 10 17р-Т естостерон-с12 10 10 10 10 10 Метилтестостерон-с13 10 10 10 10 10 Диенэстрол-б2 10 10 10 10 10 Г ексестрол-б4 10 10 10 10 10 Диэтилстильбэстрол-с16 10 10 10 10 10

6.4.3 При установлении градуировочной характеристики следует использовать не менее трех уровней массовых концентраций градуировочных растворов в диапазоне массы определяемого анали-та от 1 до 100 нг. В инжектор хроматографа вводят не менее двух раз каждый градуировочный раствор.

С помощью компьютерной системы обработки данных устанавливают градуировочную зависимость для площади пика методом внутреннего стандарта для каждого аналита по формуле

_k=^_Mjs_    (1)

S_hM,

где /с, — коэффициент отклика для /'-го аналита;

S, — площадь пика /'-го аналита в градуировочном растворе;

S_/s — площадь пика внутреннего стандарта в градуировочном растворе;

М,— массовая концентрация /'-го аналита в градуировочном растворе, нг/см³;

M_js — массовая концентрация внутреннего стандарта в градуировочном растворе, нг/см³.

7

1

Указанные материалы являются рекомендуемыми к применению. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

2

Указанные реактивы и стандартные образцы являются рекомендуемыми к применению. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

3

Институт пищевой безопасности, расположенный в Нидерландах.

3