ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ЖИР молочный

Метод обнаружения растительных жиров газожидкостной хроматографией стеринов

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности (ГУ ВНИМИ)

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 «Молоко и молочные продукты*

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. № 626-ст

3    Настоящий стандарт гармонизирован с международным стандартом ИСО 3594—76 «Молочный жир. Обнаружение растительных жиров газожидкостной хроматографией стеринов (арбитражный метод)*

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5    ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2011 г.

© И ПК Издательство стандартов, 1999 © СТАНДАРТИНФОРМ. 2011

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

16

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ЖИР МОЛОЧНЫЙ

Метод обнаружения растительных жиров газожидкостной хроматографией стеринов

Milk fat. Detection method of vegetable fat by gas-liquid chromatography of sterols

Дата введения 2001—01—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на молочный жир. выделенный из молока и молочных продуктов, и устанавливает метод обнаружения растительных жиров и масел методом газожидкостной хроматографии стеринов.

Метод основан на процедуре осаждения стеринов в виде дигитонидов. растворения их в смеси формамида с димегилформамидом с последующей экстракцией стеринов пентано.м.Окончательное разделение стеринов производят методом газожидкостной хроматографии.

2 Нормативные ссылки

Внастоящсм стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная.Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки.Общие технические условия

ГОСТ 4165-78 Медь (II) сернокислая 5-водная.Технические условия ГОСТ 4166-76 Натрий сернокислый.Технические условия ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись.Технические условия

ГОСТ 5583-78 (ИСО 2046—73) Кислород газообразный технический и мелицинский. Техни

ческие условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная.Технические условия

ГОСТ 9293-74 (ИСО 2435—73) Азот газообразный и жидкий.Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная.Технические условия

ГОСТ 14022-88 Водород фтористый безводный.Технические условия

ГОСТ 20289-74 Диметилформамид.Технические условия

ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые.Общие технические условия

ГОСТ 24363-80 Калия пироокись.Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные.Типы. основные парамет

ры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб к анализу

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные.Обшие технические требования.Методы испытаний

ГОСТ 29251-91 (ИСО 385-1—84) Посуда лабораторная стеклянная.Бюретки.Часть (.Общие требования

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из нишевого сырья. Технические

условия

ИСО 707—97** Молоко и молочные продукты. Методы отбора проб

* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.

** Действует до введения в действие ГОСТ Р. разработанного на основе соответствующего ИСО. С 11 ав-гусга 2008 г. действует ИСО 707:2008.

Издание официальное

3    Аппаратура, материалы и реактивы

3.1    Колонка газохроматографическая стеклянная U-образная или спиральная л^тиной от 100 до 200 см. внутренним диаметром (3*1) мм.Твердый носитель: кальцинированный диатомитовый, очищенный кислотой и покрытый кремне водородом. Жидкая фаза: смола каучуковая метиле иликоновая. стабильная при температуре от 300 *С. Ячейки размером 80/100 меш (175—150 мкм) или 100/120 меш (150—125 мкм). Массовая доля метил силиконовой каучуковой смолы на носителе от 2 до 4 %.

3.2    Хроматограф газовый, оснащенный пламенно-ионизационным детектором и записывающим устройством.

3.3    Микрошприц вместимостью 5-10~³ или 10-10^-3 см³.

3.4    Воронка фильтрующая ВФ по ГОСТ 25336 диаметром фильтра 90 мм.

3.5    Азот газообразный но ГОСТ 9293. особой чистоты.

3.6    Водород по ГОСТ 14022.

3.7    Кислород газообразный технический по ГОСТ 5583. первый сорт.

3.8    Формамнд по нормативной документации.

3.9    Ди метил форм амид по ГОСТ 20289.

3.10    н-Пентан ч.д.а.(для хроматографии).

3.11    Натрий сернокислый но ГОСТ 4166. х.ч.

3.12    Калия гидроокисыю ГОСТ 24363. х.ч.

3.13    Масло рапсовое но ГОСТ 8988-77.

3.14    Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652. высшей очистки.

3.15    Эфир диэтиловый по |1|.

3.16    Дигитонин. спиртовой раствор массовой концентрации 10 г/дм³.

3.17    Вода дистиллированная но ГОСТ 6709.

3.18    Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

3.19    Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336. вместимостью 25 см³.

3.20    Раствор для контроля чувствительности при обнаружении стеринов молочного жира — раствор, состоящий из 1 мг свежеприготовленных стеринов молочного жира и 1 см³ н-нентана.

3.21    Раствор для проверки эффективности разделения стеринов — раствор, состоящий из 0.9 мг стеринов рапсового масла. 0.1 мг стеринов молочного жира и 1 см³ н-пентана. Используют свежеприготовленные стерины из рапсового масла и молочного жира соответственно 6.1.

3.22    Раствор для повседневного контроля — раствор, состоящий из 1 мг стеринов свежеприготовленных из соевого масла и 1 см³ н-пентана 6.1.

3.23    Медь(П) сернокислая 5-водная но ГОСТ 4165, раствор массовой концентрации 70 г/дм³ х.ч.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и

оборудование с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

4    Отбор проб

Отбор проб — по ГОСТ 26809, для экспортно-импортных операций — по ИСО 707.

5    Подготовка к анализу

5.1    Подготовка пробы

Для обнаружения растительных жиров и масел в молочном жире, выделенном из молока, сливок, сыра, концентрированного молока, сгущенного молока, мороженого, сухого молока, отбирают пробу, которая должна обеспечить выделение из нее не менее 30 г молочного жира.

5.1.1    Масло сливочное

Пробу продукта массой 50 г расплавляют при температуре не более 50 *С до расслоения на жир и воду.При температуре не более 40 *С пробу фильтруют через сухую фильтровальную бумагу (3.18) так. чтобы вода не попадала на фильтр.

5.1.2    Молоко и сливки

Пробу продукта помешают в центрифугу для получения сливок массовой долей жира 40 %. Сливки взбивают до получения масла.Отбирают пробу масла и продолжают подготовку по 5.1.1.

5.1.3    Сметана

Пробу продукта взбивают до получения масла и продолжают подготовку по 5.1.1.

5.1.4    Сыр

Пробу продукта измельчают в растворе с безводным сульфатом натрия до получения зернистой массы.

18

ГОСТ Р 51471-99

5.1.5    Концентрированное молоко, сгущенное молоко и мороженое

В пробу продук т добавляют 100 см³ кипяченой воды, нагревают смесь на водяной бане до температуры 75 'СДобавляют 15 см³ раствора сульфата меди (II) и продолжают нагревать смесь до получения сгустка.Фильтруют сгусток через фильтровальную бумагу, промывают его теплой водой до обесцвечивания фильтрата.Осторожно сливают осадок, перемешивают его с безводным сульфатом натрия до получения зернистой массы.

5.1.6    Сухое молоко

Пробу восстанавливают в дистиллированной воде до получения густой массы и оставляют на 15 мин до набухания белков.Добавляют безводный сульфат натрия.Размельчают с помощью миксера до тех пор. пока не образуется зернистая масса.

5.1.7    Из пробы продукта, подготовленной по 5.1.1 — 5.1.6, пентаном экстрагируют молочный жир. Пентан удаляют выпариванием на водяной бане до получения прозрачного молочного жира.

5.1.8    Приготовление стеринов

Навеску молочного жира по 5.1.7 массой (15 ±0.1) г вносят в коническую колбу вместимостью 500 см³, добавляют 10 см³ гидроокиси калия по 3.12 и 20 см³ этилового спирта но 3.14.

Присоединяют к колбе воздушный конденсатор. Нагревают смесь на водяной бане в течение 30 мин при непрерывном вращении колбы до получения прозрачного раствора.

Добавляют 60 см³ воды, затем 180 см³ этилового спирта. Нагревают смесь до 40 °С. Добавляют 30 см³ спиртового раствора дигитонина (3.16). перемешивают и охлаждают в холодильнике при температуре 5 *С в течение 12 ч.

Дигитонин стерина выделяют из полученного раствора, пропуская его через фильтрующее устройство: фильтровальную бумагу и фильтрующую воронку диаметром фильтра 90 мм.

Промывают фильтрат водой температурой 5 °С до прекращения ценообразования, после чего промывают фильтрат, используя от 25 до 50 см³ этилового спирта.Затем промывают фильтрат, используя ог 25 до 50 см³ диэтилового эфира (3.15).

Фильтровальную бумагу и полученный осадок высушивают при температуре (102 ± 2) *С в течение 10—15 мин.Сухой остаток на фильтре является дигитонином стерина.

Дигитонин стерина отделяют от фильтра и переносят его в стеклянную бюксу.

5.1.9    Установка чувствительности хроматографа

Дозатором вводят в колонку от З-Ю^-3 до 510^-3 см³ раствора для контроля чувствительности (3.20).При этом на хроматограмме должен появиться один ник. соответствующий холестерину (см. рисунок 1). Устанавливают скорость диаграммы, чувствительность детектора и коэффициент усиления записывающего устройств;! так. чтобы высота пика хроматограммы холестерина была не менее 50 % верхнего предела регистрации записывающего устройства.

5.1.10    Определение эффективности разделения стеринов

Дозатором вводят в колонку от 310“ ' до Я О^-3 см³ раствора для проверки эффективности разделения (3.21). На хроматофаммс должны появиться пики холестерина, брассикастерина. кампес-терина и p-ситостерина (см. рисунок 2).

Измеряют на хроматограмме расстояния, пропорциональные времени удерживания (расстояния от момента введения раствора в колонку до наивысших точек пиков): d_Qt — для холестерина. (/_ь — для брассикастерина, d_c — для кампестерина, d_s — для р-ситостерина. Измеряют ширину оснований пиков и расстояния между вершинами пиков (измерение ширины оснований проводят между пересечениями основной линии с касательными к точкам перегиба с передней и задней сторон вершин), »v_ch — для холестерина и w_b — для брассикастерина.

Определяют коэффициент разделения по формуле

PR=2(d_b-d_ch)/(w_b + w_ch).    (1)

Коэффициент разделения должен быть не менее 1,0. При коэффициенте разделения ^достигается почти полное разделение. Полное разделение имеет место при коэффициенте более 1.5.

Для измерения ширины основания пика проводят прямые, касательные к точкам перегиба хроматограммы с каждой стороны пика, до пересечения их с основной линией. Ширина основания равняется отрезку на основной линии, концами которого являются точки пересечения касательных с основной линией.

Подсчитывают значение PR по формуле (1).

5.1.11    Проведение повседневного кон фоля

Вводят в колонку от 340~³ до S10^-3 см³ раствора для повседневного конфоля (3.22). На хрома-тограмме должны появиться пики кампестерина. стигмастерина и Р-ситостерина (см. рисунок 3). Измеряют расстояние между вершинами пиков d_c — хтя кампестерина. d_sX — хтя стигмастерина и d_s — хтя р-ситостерина.

Значение относительного времени удержания должно соответствовать: Холестерин    1.00 (окато 15 мин)

Брассикастерин 1.13—1.15 Камиес герин 1.32—1.34 Стигмастерин 1.44— 1.46 Р-ситостерин    1.66—1.68

Измерения по 5.1.10 и 5.1.11 повторяют дважды.

4

ГОСТ Р 51471-99

6    Проведение анализа

6.1    Вносят (10 ± 1) мг дигитонина стерина в пробирку и добавляют 0.5 см³ смеси формамида и диметилформамида. При необходимости раствор осторожно подогревают. Добавляют 2,5 см³ н-нен-тана (3.10) в охлажденный раствор, закрывают пробирку пробкой и перемешивают интенсивным вращением. Оставляют в покое до расслоения и используют для анализа верхний слой, содержащий свободные стерины. Расчетное значение массовой концентрации стеринов в верхнем слое раствора 1 мг/см³.

6.2    Температуру колонки устанавливают от 220 до 250 *С. а систему дозирования дополнительно нагревают на (30 ± 10) 'С выше температуры колонки.

6.3    Скорость подачи азота устанавливают от 30 до 60 см³/мин.

6.4    Новые колонки для стабилизации выдерживают при условиях 6.2 — 6.3 и при отключенном детекторе в течение 16 — 24 ч.

6.5    Подключают детектор, зажигают пламя и регулируют скорость подачи водорода и кислорода (или воздуха) гак, чтобы высота пика хроматограммы холестерина была не менее 50 % верхнего предела регистрации записывающего устройства.

6.6    Включают записывающее устройство, подбирают скорость записи и устанавливают перо самописца на нулевую отметку. Подачу водорода, кислорода и включение записывающего устройства производят в соответствии с инструкцией к прибору.

6.7    Вводят в колонку от 3-10^-3 до 510^-3 см³ раствора по 6.1 и записывают хроматограмму. Для более точного определения последовательно проводят запись четырех хроматограмм. Первую и третью хроматофамму записывают дня раствора контроля чувствительности (3.20); вторую и четвертую — дга раствора, приготовленного по 6.1. Объемы растворов должны быть одинаковыми.

7    Обработка результатов

Если на хроматофамме наблюдают пики с временем удерживания, характерным дга (V-с и тосте-ринов. и их высота составляет более чем 2 % верхнего предела измерений установленного но 3.20. то это подтверждает наличие p-ситостеринов в анализируемой пробе.

Присутствие на хроматофамме пика p-ситостерина или других фитостеринов подтверждает наличие в пробе продукта растительных масел или жиров.

8    Метрологические характеристики

Наименьший предел измерений метода — не менее 0.5 % массовой доли p-ситостерина в молочном жире.

ПРИЛОЖЕНИЕ А

(справочное)

Библиография

111 ГФХ Эфир диэтиловый для наркоза

УДК 637.2/.3/. 147.2:006.354    ОКС    67.100.01    Н19    ОКСТУ    9209

Ключевые слова: молочный жир. стерины. растительный жир. растительное масло, тазожидкостная хроматография стеринов. обработка результатов