ГОСТ Р 51198-98 (ИСО 4134-78)
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫМетод определения L-(+)-глутаминовой кислоты
Издание официальное
Москва
Стандартинформ
2010
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Московской государственной академией пищевых производств
ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»
2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 28 августа 1998 г. № 336
3 Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 4134—78 «Мясо и мясные продукты. Определение содержания Е-(+)-глутаминовой кислоты» с дополнительными требованиями, отражающими потребности экономики страны (2, 4, 6.6, 6.8, 6.12, 6.13, 7.1 и 9.1)
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Январь 2010 г.
© ИПК Издательство стандартов, 1998 © СТАНДАРТИНФОРМ, 2010
Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
118
ГОСТ Р 51198-98 (ИСО 4134-78)ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИМЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫМетод определения L-(+)-глутаминовой кислоты
Meat and meat products.
Method for determination of L-(+)-glytamic acid content
Дата введения 2000—01—01
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на мясо и мясные продукты и устанавливает метод определения L-(+)-глутаминовой кислоты.
2 Нормативные ссылки
ГОСТ 9793-74 Продукты мясные. Методы определения влаги
ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1—91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб
3 Определение
Массовая доля Ь-(+)-глутаминовой кислоты — массовая доля Ь-(+)-глутаминовой кислоты, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в процентах.
4 Сущность метода
Ь-(+)-глутаминовую кислоту экстрагируют из пробы продукта, взятой на испытание, ледяным раствором хлорной кислоты. Смесь центрифугируют, фильтруют и доводят активную кислотность фильтрата до требуемого значения. Проводят ферментативное преобразование Ь-(+)-глутамата в а-кетоглутарат в ходе реакции с никотинамидадениндинуклеотидом (НАД) в присутствии глутамат-дегидрогеназы (ГДГ):
гдг
Ь-(+)-глутамат + НАД+ +Н20 <-> а-кетоглутарат + НАДН + NH3 + Н+.
Затем окисляют эквивалентное количество восстановленной формы НАДН хлоридом йодони-тротетразолия (ИНТ) в присутствии липоаминдегидрогеназы (ЛАДГ):
ЛАДГ
НАДН + ИНТ-хлорид + Н+ <->НАД+ + формазан.
Измеряют массовую долю образовавшегося формазана на спектрофотометре при длине волны 492 нм.
5 Реактивы
Все реактивы должны быть аналитического качества (не ниже х. ч.). Все растворы, кроме растворов неорганических соединений (5.1 и 5.2), должны храниться в закрытой посуде из темного стекла, тщательно вымытой и пропаренной или стерилизованной.
Вода, используемая для приготовления растворов ферментов, должна быть деминерализованной или бидистиллированной, полученной в стеклянном дистилляторе.
Издание официальное
Вода, используемая для приготовления растворов химических реагентов и подготовки проб, должна быть дистиллированной или деминерализованной.
Примечание — Однократно дистиллированная вода может содержать ионы металлов, которые снижают активность ферментов, а деминерализованная вода может содержать микроорганизмы, увеличивающие неспецифическую фоновую ферментативную активность и искажающие результаты анализа.
Препарат НАД должен содержать не менее 90 % основного вещества.
Ь-(+)-глутаминовая кислота должна содержать не менее 98 % основного вещества.
Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые наборы реактивов при условии соответствия качества реактивов требованиям настоящего стандарта.
5.1 Раствор хлорной кислоты с (НСЮ4) = 1,0 моль/дм3
8,6 см3 раствора хлорной кислоты массовой доли 70 % и плотности 1,67 г/см3 помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем раствора до метки водой.
Примечание — При использовании хлорной кислоты меньшей массовой доли проводят перерасчет объема кислоты, используемой для осаждения белков.
5.2 Раствор гидроксида калия с (КОН) = 2 моль/дм3
Растворяют 56,1 г гидроксида калия (КОН) в воде, доводят объем раствора до 500 см3.
5.3 Буферный раствор активной кислотности 8,6 pH
5.3.1 Растворяют 1,86 г гидрохлорида триэтаноламина в воде, доводят активную кислотность раствора до 8,6 pH раствором гидроксида калия (5.2), используя для измерений pH-метр. Затем добавляют 0,68 г октилфенолдекаэтиленгликолевого эфира (например, Тритон X = 100) и доводят объем раствора до 100 см3 водой.
5.3.2 Растворяют 0,86 г двузамещенного фосфорнокислого калия (К2НР04) и 0,007 г одноза-мещенного фосфорнокислого калия (КН2Р04) в воде и доводят объем раствора до 100 см3.
5.3.3 Смешивают 20 см3 раствора по 5.3.1 и 5 см3 раствора по 5.3.2.
Раствор хранят при температуре 4 °С.
5.4 Раствор НАД
Навеску НАД массой 0,025 г растворяют в 5,0 см3 воды в небольшой колбе со шлифом, колбу закрывают пробкой.
Раствор устойчив не менее 1 мес при температуре 4 °С.
5.5 Раствор йодонитротетразолия [2-(р-йодофенил)-3-(р-нитрофенил)-5-фенилтетразолия] хлорида (ИНТ-хлорида)
Растворяют 0,030 г ИНТ-хлорида в 50 см3 воды, колбу закрывают пробкой.
Раствор устойчив не менее 2 мес при температуре 4 °С в темноте.
5.6 Раствор ЛАДГ
Растворяют 0,003 г лиофильно высушенной липоаминдегидрогеназы в 1 см3 воды.
Раствор устойчив не менее трех недель при температуре 4 °С.
5.7 Раствор ГДГ
Используют раствор глютаматдегидрогеназы концентрации 10 мг/см3, свободный от сульфата аммония, этилендиаминтетрауксусной кислоты и глутаминазы, поставляемый в готовом виде (например, в расфасовке по 1,0 см3), удельной активностью не менее 900 Е/см3.
Раствор устойчив не менее 12 мес при температуре 4 °С.
5.8 Стандартный раствор L-(+)-глутаминовой кислоты
Растворяют 0,050 г L-(+)-глутаминовой кислоты в 25 см3 воды. Активную кислотность раствора устанавливают 7,0 pH раствором гидроксида калия (5.2), после чего доводят объем раствора до 50 см3.
Раствор хранят при температуре 4 °С и непосредственно перед использованием разводят водой в соотношении объемов 1 : 49.
6 Средства контроля и вспомогательные устройства
Обычная лабораторная аппаратура, а также указанная в 6.1 — 6.11.
6.1 Мясорубка механическая лабораторная, снабженная перфорированной пластинкой с отверстиями диаметром не более 4 мм.
6.2 Миксер лабораторный.
6.3 Центрифуга лабораторная с пробирками вместимостью 50 или 100 см3.
6.4 Иономер или pH-метр диапазоном измерений от 1 до 14 pH и допускаемой погрешностью ± 0,05 pH.
6.5 Фильтры бумажные гофрированные диаметром 15 см.
120
6.6 Колбы мерные вместимостью 100 и 250 см3 и допускаемой относительной погрешностью
± 0,2 %.
6.7 Дозаторы пипеточные объемами доз 25, 50 и 100 см3 и относительной погрешностью дозирования + 1 %.
6.8 Пипетки градуированные вместимостью 0,05; 0,2; 0,5 и 2,5 см3 и допускаемой относительной погрешностью + 1 %.
6.9 Шпатели пластиковые или палочки стеклянные для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.
6.10 Спектрофотометр (фотометр) со следующими техническими характеристиками: спектральный интервал — не более 10 нм; интервал измерений оптической плотности — от 0,000 до 2,000; погрешность установки длины волны — ± 3 нм; среднее квадратическое отклонение случайной составляющей погрешности измерений — не более 0,15 %.
6.11 Кюветы фотометрические толщиной поглощающего слоя 10 мм.
6.12 Термометр жидкостный стеклянный с интервалом измерений от 0 до 100 °С, допускаемой погрешностью измерений ± 2 °С.
6.13 Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью + 0,001 г.
7 Порядок подготовки к проведению измерений
7.1 Отбор проб — по ГОСТ Р 51447.
7.2 Пробу массой не менее 200 г, полученную из репрезентативной выборки, хранят в условиях, предотвращающих порчу и изменение состава.
8 Порядок проведения измерений8.1 Подготовка пробы к проведению измерений
Образец пробы гомогенизируют, дважды пропуская через мясорубку (6.1) и тщательно перемешивая.
Образец хранят не более 24 ч в заполненном доверху и герметически закрытом контейнере таким образом, чтобы предотвратить порчу или изменение состава.
8.2 Навеска для проведения анализа
Взвешивают приблизительно 50 г исследуемого образца с точностью до 10 мг и помещают навеску образца в лабораторный миксер (6.2).
8.3 Приготовление экстракта
8.3.1 К навеске образца в лабораторном миксере добавляют 100 см3 охлажденного льдом раствора хлорной кислоты (5.1) и гомогенизируют.
8.3.2 Часть гомогенизата помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при угловой скорости 3000 мин-1, затем, осторожно отодвинув слой жира, отфильтровывают супернатант через гофрированный бумажный фильтр (6.5) в коническую колбу вместимостью 200 см3. Первые 10 см3 фильтрата выбрасывают.
8.3.3 50 см3 подготовленного раствора, который может быть слегка мутным, переносят в стаканчик вместимостью 100 см3 и доводят активную кислотность раствора до 10 pH раствором гидроксида калия (5.2).
8.3.4 Количественно переносят содержимое стаканчика в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем раствора до метки водой.
8.3.5 Раствор охлаждают в ледяной бане 20 мин и фильтруют через гофрированный бумажный фильтр (6.5), отбросив первые 10 см3 фильтрата.
8.3.6 25 см3 фильтрата переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3 и доводят объем фильтрата до метки водой.
Примечание — Объем фильтрата выбирают так, чтобы концентрация Ь-(+)-глутаминовой кислоты была приблизительно 0,030 г/дм3.
8.4 Определение
8.4.1 Температуру растворов по 5.3 и 8.3.6 доводят до 20—25 °С. Для проведения ферментативной реакции берут две фотометрические кюветы (6.11), в каждую из которых пипеточным дозатором (6.5) добавляют:
- 2,50 см3 буферного раствора (5.3);
- 0,20 см3 раствора НАД (5.4);
121
- 0,20 см3 раствора ИНТ (5.5) и
- 0,05 см3 раствора линоаминдегидрогеназа (5.6).
Затем в одну кювету вносят 0,50 см3 экстракта (8.3.6), получая исследуемый раствор, а во вторую — 0,50 см3 воды, получая контрольный раствор.
Растворы в кюветах перемешивают пластиковыми шпателями или стеклянными палочками (6.9) и измеряют оптические плотности относительно воздуха при длине волны 492 нм: А1 — оптическая плотность исследуемого раствора, А1к — оптическая плотность контрольного раствора.
Температура растворов должна быть от 20 до 25 °С.
8.4.2 В каждую кювету вносят по 0,05 см3 раствора ГДГ (5.7) и тщательно смешивают с содержимым, используя шпатель или стеклянную палочку (6.9).
Растворы выдерживают 15 мин. Затем измеряют оптические плотности при длине волны 492 нм, повторяя измерения через каждые 2 мин до достижения постоянных значений.
Строят графики зависимости оптических плотностей растворов от времени и экстраполируют их на момент внесения фермента ГДГ (приложение А).
Получают экстраполированные значения оптических плотностей исследуемого (А2) и контрольного (А2к) растворов.
8.4.3 Определяют микромолярный коэффициент оптической плотности формазана, повторяя операции по 8.4.1 и 8.4.2, но заменяя 0,5 см3 экстракта в первой фотометрической кювете на 0,5 см3 стандартного раствора L-(+)-глутаминовой кислоты (5.8).
Получают следующие значения оптических плотностей:
- А \ — стандартного раствора L-(+)-глутаминовой кислоты;
- А'1к — контрольного раствора;
-А 2 — стандартного раствора L-(+)-глутаминовой кислоты;
-А 2к — контрольного раствора.
8.5 Выполняют два параллельных определения в двух пробах из одного и того же образца (8.1).
9 Правила обработки результатов измерений 9.1 Метод расчета
Массовую долю Ь-(+)-глутаминовой кислоты в пробе X, %, вычисляют по формуле
где А А = (А2 — At) — (А2к — А1к);
147,1 — молярная масса L-(+)-глутаминовой кислоты;
М— массовая доля влаги в пробе, определенная по ГОСТ 9793; т — масса навески (8.2), г;
V— объем фильтрата, взятый на определение (8.3.6), см3;
к — микромолярный коэффициент оптической плотности формазана при длине волны 492 нм, см2/мкмоль, рассчитанный по формуле
к = АА' х — х — х 147,1 - 51,485 х АД',
где А А' = (Л 2 — А\) - (А'2к — А'1к).
За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений при условии выполнения 9.2.
Результат определяют с точностью 0,01 %.
9.2 Сходимость
Относительное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать 10 % среднеарифметического значения.
10 Оформление результатов измерений
В отчете об испытании должны быть указаны:
- используемый метод;
- полученные результаты;
- любые условия проведения испытаний, не установленные данным стандартом и касающиеся подробностей, которые могут повлиять на конечный результат.
В отчете должны быть все данные, необходимые для полной идентификации пробы.
ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное)
|
Пример построения графика зависимости оптической плотности раствора от времени |
|
УДК 637.5.001.4:006.354 ОКС 67.120.10 Н19 ОКСТУ 9209
Ключевые слова: мясо, мясные продукты, химический анализ, определение массовой доли, органические кислоты, Ь-(+)-глутаминовая кислота
124
