СОКИ ФРУКТОВЫЕ И ОВОЩНЫЕ

Метод определения D-изолимонной кислоты

Издание официальное

ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Московской государственной академией пищевых производств. Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности

ВНЕСЕН Техническим комитетом ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность*

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 19 января 1998 г. № 6

3    Разделы настоящего стандарта за исключением 2; 5; 6; 8,2; 9 представляют собой аутентичный текст европейского стандарта EH 1139—94. «Фруктовые и овощные соки. Ферментативное определение содержания D-изолимонной кислоты. Спектрофотометрическое определение никотн-нам11дадениндннуклсотидфосфата (НАДФН)*

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5    ПЕРЕИЗДАНИЕ

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официатьного издания на территории Российской Федерации без разрешения Госстандарта России

104

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СОКИ ФРУКТОВЫЕ И ОВОЩНЫЕ

Метол определении 1)-и юличонной кислоты

Fruit and vegetable juices.

Method for determination of D-»socitric acid

Дата введения 1998-07-01

1    Область применения

Настоящим стандарт распространяется на фруктовые и овощные сокн. нектары и сокосодержащие напитки н устанавливает метод определения D-изолимонной кислоты в виде свободной кислоты или се соли, включая эфиры и лактоны.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603-79 Ацетон. Технические условия ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 3760-79 Аммиак водный. Технические условия ГОСТ 4108-72 Барий хлорид 2-водный. Технические условия ГОСТ 4166 76 Натрий сернокислый. Технические условия ГОСТ 4328-77 Натрий гидроокись. Технические условия ГОСТ 6259-75 Глицерин. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 10652-73 Этилсндиамннтетрауксусной кислоты динатрисвая соль. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора

проб

ГОСТ 26671-85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясораститель-ные. Подготовка проб для лабораторных анализов

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть I. Общие требования

3    Определения и сокращения

3.1    В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

массовая концентрация D-изолимонной кислоты во фруктовых и овощных соках, нектарах и сокосодержащих напитках: Массовая концентрация D-изолимонной кислоты, определенная в соответствии с методикой, установленной настоящим стандартом, выраженная в мг/дм⁵.

3.2    В настоящем стандарте применяют следующие сокращения:

И ЦДГ — изоцитратдегндрогеназа ПС 1. 1. 1.42 11 ];

НАДФ — никотннамидаденнндинуклсотндфосфат. окисленная форма;

НАДФН — ннкотннамидаденнндинуклеотидфосфат. восстановленная форма:

Е — стандартная единица, определяет количество (активность) фермента, которое служит катал и затором при 25 *С для превращения I мкмоля вещества в минуту.

Издание официальное

4    Сущность метода

Метод основан на осаждении D-нэолимонной кислоты в виде соли барии, перерастворении соли, ферментативном дскарбоксилнровании иона цитрата под действием НАДО в присутствии ИНДГ, фотометрическом измерении количества образовавшегося НАДФН, эквивалентного количеству D-и золи мон ной кислоты.

В ходе анализа протекают следующие ферментативные реакции:

и ид Г

0-изоинтрат-ион+НАДФ+-> а-кетоглутарат+НАДФН +СО,+Н*.    (I)

5    Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

и материалы

Спектрофотометр, позволяющий проводить исследования при длине волны 340 нм. или фотометр фотоэлектрический шириной спектральной полосы нс более 10 нм и допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более I %, или спектрофотометр на ртутной лампе, позволяющий проводить измерения при длинах волн 365 или 334 нм.

Кюветы из оптического стекла или полистироловые рабочей длиной 10 мм.

Иономер или рН-мстр с погрешностью измерения не более 0.05 pH.

Электрод для измерения pH стеклянный.

Электрод сравнения (каломельный).

Пипетки по ГОСТ 29227 типа 3. исполнения I. 1-го класса точности, вместимостью I и 10 см³.

Дозаторы нипсточные объемами I, 0.2 и 0,02 см³ относительной погрешностью дозирования

±1 % |2].

Колба мерная по ГОСТ 1770, исполнения 2, вместимостью 50 см³.

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая увеличение ускорения свободного падения при центрифугировании в 3000 раз.

Стаканы для центрифугирования вместимостью 100 см³.

Фильтры бумажные обеззоленные марки ФОМ но ГОСТ 12026.

Баня водяная (3).

Кислота D-изолнмонная по НД (4| раствор массовой концентрации w(C₆H_s0₇)=500 мг/дм³.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х. ч., раствор молярной концентрации с (НС1)-4 модь/дм³.

Аммиак водный по ГОСТ 3760. ч. д. а.

Ацетон по ГОСТ 2603. ч. д. а.

Барий хлористый 2-волный по ГОСТ 4108, х. ч., раствор массовой концентрации ет(ВаС1,)-300 I0³ мг/дм³.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328. ч. д. а., раствор молярной концентрации c(NaOH)=4 моль/дм³.

Натрий сернокислый по ГОСТ 4166. ч. д. а., раствор массовой концентрации m(Na₂SO₄)"7M0³ мг/дм³.

Марганец (II) сернокислый [5]. раствор массовой концентрации m(MnS0₄)-l2,5 I0³ мг/дм³.

Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль 2-водная по ГОСТ 10652. ч. д. а.

Трнс(гидрокснметил)аминометан [6), х. ч.

Глицерин по ГОСТ 6259.

НАДФ (динатриевая соль) по |4).

ИЦДГ (4).

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательные устройства с техническими характеристиками, а также реактивы по качеству не ниже перечисленных.

2 106

ГОСТ Р 51128-98

6    Отбор и подготовка проб

Отбор проб — по ГОСТ 26313, подготовка их к испытанию — по ГОСТ 26671.

6.1    Выделение D-и зол и мойной кислоты из фруктового и овощного сока, нектаров и сокосодержащих напитков

В стакане для центрифугирования 10 см³ исследуемого образца смешивают с 5 см³ раствора гидроокиси натрия. Раствор выдерживают в течение 10 мин при температуре от 20 до 25 °С. После добавления 5 см³ соляной кислоты объем раствора доводят водой до 25 см³. Последовательно приливают 2 см³ раствора аммиака, 3 см³ раствора хлористого бария и 20 см³ ацетона и хорошо перемешивают стеклянной палочкой. Раствор выдерживают в течение 10 мин, затем в течение 5 мин центрифугируют. Надосадочную жидкость осторожно декантируют, осадок в стакане для центрифугирования растворяют в 20 см³ раствора сернокислого натрия, помешивая стеклянной палочкой. Для ускорения растворения осадка стакан помешают на кипящую водяную баню и выдерживают в течение 10 мин при неоднократном перемешивании. После охлаждения до температуры от 20 до 25 *С раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³ и доводят буферным раствором до метки. Из мерной колбы раствор переносят в колбу Эрлснмайсра. содержащую I г активированного угля, выдерживают в течение 5 мин и фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Прозрачный, бесцветный фильтрат используют для ферментативного определения D-изо-лимонной кислоты.

6.2    Выделение D-и зол и мои ной кислоты из концентратов фруктовых и овощных соков, нектаров и сокосодержащих напитков

Перед выделением D-изолнмонной кислоты концентрат разводят водой до содержания сухих веществ по рецептуре натурального сока, нектара или сокосодержашего налитка. Далее выделение D-изолимонной кислоты проводят по 6.1.

7    Подготовка к испытанию

7.1    Приготовление    буферного    раствора    активной    кис

лотностью 7,0 pH

2.42    г трнс(гндроксиметил) аминомстана и 35 мг динатриевоЙ соли зтиленднамннтетрауксус-ной кислоты (дигидрата) растворяют в 80 см³ воды, значение pH раствора доводят с помощью соляной кислоты до 7.0 и объем доводят до 100 см³. Буферный раствор устойчив при температуре 4 *С в течение I г.

7.2    Приготовление    буферного    раствора    активной    кис

лотностью 7,4 pH

2.42    г трнс(гндрокснметил) аминомстана и 35 мг динатриевоЙ соли этиленднаминтетрауксус-ной кислоты (дигидрата) растворяют в 80 см³ воды, значение pH раствора доводят с помощью соляной кислоты до 7,4. затем объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 см³. Буферный раствор устойчив при температуре 4'Св течение I г.

7.3    Приготовление    раствора    НАДФ

50 мг динатриевоЙ соли НАДФ растворяют в 5 см' воды. Раствор устойчив при температуре 4 *С в течение четырех недель.

7.4    Приготовление    раствора    ИЦДГ

10,0 мг лиофилнзата ИЦДГ из свиного сердца растворяют в I см³ (20 Е/см³) глицерина. Раствор устойчив при температуре 4‘Св течение 6 мес.

8    Проведение испытания

Анализ проводят при температуре от 20 до 25 ‘С.

При проведении испытания количество реактивов задают в см³, а результаты пересчитывают на I дм³ пробы.

Для дозирования исследуемой пробы и растворов используют пипетки с делениями или пипеточные дозаторы.

Растворы ферментов, коферментов и буфер;» вносят соответствующими пипсточными дозаторами.

Ферментативное определение D-изолимонной кислоты может быть проведено также с использованием имеющихся в продаже специальных наборов реактивов.

107

8.1    Приготовление опытной пробы

В кювету спектрофотометра вносят 2.0 см³ буферного раствора активной кислотностью 7.4 pH, 0,1 см³ раствора сульфата марганца. 0,1 см³ раствора НАДФ и 1.00 см³ исследуемого раствор;» пробы, подготоатенного по разделу 6. Смесь перемешивают, выдерживают в течение 3 мин и измеряют оптическую плотность раствора — (Л,)_прови относительно воздуха.

8.2    Реакция с ферментом и количественный анализ

К подготовленному в кювете по 8.1 раствору добаатяют 0,01 см³ раствора И1ЩГ. Раствор перемешивают. Через 10 мин (окончание реакции) измеряют оптическую плотность (Л,)_проба Р^30-твора относительно воздуха.

Через 5 мин проводят контрольное измерение. Если оптическая плотность меняется, измерения проводят каждые следующие 5 мин до тех пор. пока не будет достигнута постоянная величина ее приращения. В этом случае оптическую плотность раствор;» (Л_:)_про6л определяют экстраполяцией на момент внесения раствора ИЦДГ.

8.3    К о и т р о л ь и о е испытание

Контрольное испытание проводят параллельно с основным. В кювету спектрофотометра вносят 3,0 см³ буферного раствора активной кислотностью 7,4 pH и 0,1 см³ раствора НАДФ. Смесь перемешивают, выдерживают в течение 3 мин и измеряют оптическую плотность (/^контроль относительно воздуха.

К подготовленному в кювете раствору добаатяют 0,01 см³ раствор;» ИЦДГ. перемешивают и через 10 мин измеряют оптическую плотность раствора Mi)_KOIfTpftlk. как в 8.2.

9 Выражение результатов

Основой данного метода является линейная зависимость между образующимся количеством НАДФН и количеством D-изолимонной кислоты.

Разность измеренных оптических плотностей АЛ вычисляют по формуле

А А = (Л> — Л|)проб« ^— Wj — Л|)|«жтрол1>-    (2)

Массовую концентрацию А)-и зол и мои ной кислоты в пробе X, мг/дм³, вычисляют по формуле

_v Mv_xF\m

^Х= el v₂ 1000 ^АА'    <³>

где «ЗА—молярная масса D-иэолимоиной кислоты, АА = 192,1 г/моль;

Г, — суммарный объем рас»вор;» в кювете.см³;

F— фактор разведения пробы в процессе выделения D-изолимонной кислоты,рассчитываемый как отношение объема разведенной пробы к объему.взятому для разведения; £ — молярный показатель поглоше»»ня Н«\ДФН, при 340 им — £ =6,3 дм³ммоль^-1 • см^-1, при 365 нм — £ =3.5 дм³ммоль^-1 • см^-1 (ртутная лампа), при 334 нм — £ =6,18 дм³ ммоль^-1 • см^-1 (ртутная лампа);

/— рабочая длина кюветы,см;

— использованный для приготовления измеряемого раствора объем пробы.см³.

Для указанных в прописи объемов растворов массовую концентрацию D-изолимонной кислоты в пробе X, мг/дм³, вычисляют по формуле

Х= 3083-^-^.    <⁴>

При использовании имеющихся в продаже наборов реактивов численный коэффициент (3083) в формуле (4) может быть иным из-за изменения суммарного объема раствора в кювете (У_х).

108

ГОСТ Р 51128-98

При анализе концентратов соков, продуктов с высокой вязкостью и/нли очень большим содержанием мякоти результаты испытаний могут быть выражены как массовая доля D-нзолимон-нон кисло 1 ы в пробе А',. млн^-1, по формуле

_х _ X 1000 V    (5)

¹ т

где V — объем разведенного концентрата сока, продукта с высокой вязкостью и/или очень большим содержанием мякоти,см³; т — масса концентрата сока, продукта с высокой вязкостью и/или очень большим содержанием мякоти,взятых для разведения.г.

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, округленное до целого значения.

Абсолютное расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать более чем в 5 % случаев значения показателя сходимости </“2.5 мг/дм³.

Абсолютное расхождение между результатами двух измерений, выполненных в двух лабораториях. не должно превышать более чем в 5 % случаев значение показателя воспроизводимости />=4,4 мг/дм³.

10    Контроль достоверности полученных результатов

Достоверность получаемых результатов рекомендуется контролировать с помощью стандартного раствора D-иэолимонной кислоты массовой концентрации нс более 500 мг/дм³, который испытывают по 8.1—8.2 без предварительного разведения.

Если массовая концентрация D-изолимонной кислоты, определенная в результате испытания составляет менее 95 % концентрации стандартного раствора, то испытание повторяют со свежеприготовленными растворами реактивов.

11    Отчет об испытании

В отчете об испытании должны быть указаны:

-    обозначение настоящего стандарта;

-    дата и способ отбора проб (если это возможно):

-    дата доставки образца;

-    дата проведения анализа;

-    результаты исследования;

-    обнаруженные в ходе исследования особенности;

-    все рабочие условия, не установленные данным стандартом или касающиеся как необязательных, так и любых других подробностей, которые могут повлиять на конечный результат.

В отчете должны быть указаны все детали, необходимые для полной идентификации пробы.

109

ПРИЛОЖЕНИЕ Л (справочное)

Библиография

|1|    Номенклатура ферментов. Рекомендации Международного биохимического сою» по

номенклатуре и классификации ферментов, а также единицам ферментов и символам кинетики ферментативных реакций. М. 1979 |2|    ТУ 64-13329—81 До»торы пи поточные

|3|    ТУ 46-22-603—75 Баня водяная лабораторная с электрическим или с огневым подо

гревом

|4|    Bochringcr Mannheim. Methoden dcr cnzimatischen BioAnalytik und Lcbcnsmittclcanalytik

mi! Tcst-Combinaiionen |5|    ТУ 6-09-01-218—84 Марганец (II) сернокислый

|6|    ТУ 6-09-4292—76 Трис(гидроксимстил)аминомстаи

ОКС 67.080    Н59

Ключевые слов;!: продукт питания, напиток, нектар, фруктовые и овощные соки, ферментативный анализ, определение концентрации, D-иэолимониая кислота, спектрофотометрия

ПО