МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

МОЛОКО И МОЛОЧНАЯ ПРОДУКЦИЯ

Обнаружение Salmonella spp.

(ISO 6785:2001, Milk and milk products — Detection of Salmonella spp.,

IDT)

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии указанного в пункте 4 стандарта

2    ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 февраля 2015 г. № 75-П)

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 7 июня 2016 г. Ne 550-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 6785-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 6785:2001/IDF 93:2001 «Молоко и молочные продукты. Обнаружение Salmonella spp.» («Milk and milk products — Detection of Salmonella spp.». IDT).

Международный стандарт разработан подкомитетом SC 5 «Молоко и молочные продукты» Технического комитета по стандартизации ISO/ТС 34 «Пищевые продукты» Международной организации по стандартизации (ISO) и Международной молочной федерацией (IDF) совместно с Международной ассоциацией химиков-аналитиков (АОАС International).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международного стандарта, на который дана ссылка, имеются в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного стандарта в связи с особенностями системы межгосударственной стандартизации.

В разделе «Нормативные ссылки» и тексте стандарта ссылки на международный стандарт актуализированы.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместоссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

и

ГОСТ ISO 6785-2015

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе « Национальные стандарты ». а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случав пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Националы1ыв стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

© Стандартимформ. 2016

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

hi

ГОСТ ISO 6785-2015

Содержание

1    Область применения...................................................¹

2    Нормативные ссылки..................................................¹

3    Термины и определения................................................^

4    Сущность метода.....................................................1

4.1    Общие положения....... ¹

4.2    Предварительное обогащение в жидкой неселективной среде......................¹

4.3    Обогащение в селективной жидкой среде...................................¹

4.4    Посев штрихами и идентификация.......................................2

4.5    Подтверждение...................................................2

5    Питательная среда, реактивы и сыворотки.....................................2

5.1    Вода..........................................................2

5.2    Питательные среды.................................................2

5.3    Реактивы.......................................................7

5.4    Сыворотки......................................................⁹

6    Оборудование и стеклянная посуда.........................................⁹

7    Отбор проб........................................................1°

8    Подготовка пробы для испытания..........................................¹⁹

9    Проведение испытания................................................¹⁰

9.1    Меры предосторожности.............................................Ю

9.2    Рабочая часть пробы и предварительное обогащение..........................W

9.3    Обогащение.....................................................11

9.4    Посев штрихами и идентификация......................................11

9.5    Подтверждение..................................................12

10    Контрольные культуры................................................14

11    Выражение результатов...............................................14

12    Меры предосторожности...............................................14

13    Протокол испытаний.................................................15

Приложение А (обязательное) Схема процедуры.................................16

Приложение В (обязательное) Требования к бриллиантовому зеленому..................17

Приложение С (справочное) Стандартный метод штрихования агаровых пластинок...........17

Приложение ДА (справочное) Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов

межгосударственным стандартам................................18

Библиография........................................................19

IV

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МОЛОКО И МОЛОЧНАЯ ПРОДУКЦИЯ

Обнаружение Salmonella spp.

Milk and milk products.

Detection of Salmonella spp.

Дата введения — 2017—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод обнаружения Salmonella spp. (далее — сальмонеллы) в молоке и молочной продукции.

2    Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходим следующий ссылочный стандарт:

ISO 8261:2001/IDF 122:2001’) Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination (Молоко и молочные продукты. Общие руководства по подготовке испытательных проб, исходных суспензий и десятикратных разведений для микробиологического исследования)

3    Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1    сальмонеллы (Salmonella): Микроорганизмы, образующие типичные колонии на плотных селективных питательных средах и имеющие биохимические и серологические характеристики, описанные в настоящем стандарте.

3.2    обнаружение сальмонелл (detection of Salmonella): Определение присутствия или отсутствие этих микроорганизмов в конкретной массе или объеме по методу, установленному в настоящем стандарте.

4    Сущность метода

4.1    Общие положения

Обнаружение сальмонелл проходит в четыре этапа (см. приложение А).

4.2    Предварительное обогащение в жидкой неселективной среде

Для предварительного обогащения среду инокулируют рабочей частью пробы и инкубируют при температуре 37 °С в течение 16—20 ч.

4.3    Обогащение в селективной жидкой среде

Модифицированные среды хлорида магния/малахитового зеленого Раппапорта — Вассилиадиса и селенита/цистина инокулируют культурой, полученной после инкубирования по 4.2.

' ’ Действует только для применения настоящего стандарта.

Издание официальное

Инкубирование модифицированной среды хлорида магиия/малахитового зеленого Раппапор-та — Вассилиадиса на водяной бане или в термостате (6.4) осуществляют при температуре 41.5 °С в течение 24 ч. а затем еще в течение 24 ч.

Инкубирование среды селенита/цистина в термостате (6.3) осуществляют при температуре 37 °С в течение 24 ч. а затем еще в течение 24 ч.

4.4    Посев штрихами и идентификация

Полученные культуры (4.3) высевают в две плотные селективные среды (малахитовый зеленый/ феноловый красный агар и любую другую подходящую плотную селективную среду).

Примечание — Соответствующие среды позволяют выявить лактозо-ферментирующие штаммы сальмонелл.

Инкубирование посевов на агаре с бриллиантовым зеленым и феноловым красным осуществляют в термостате (6.3) при температуре 37 °С и контролируют через 20—24 ч. а при необходимости — еще раз через 40—48 ч и отмечают присутствие типичных колоний, которые по своим характеристикам могут быть сальмонеллами.

Инкубирование второй плотной селективной среды осуществляют при соответствующей температуре и в течение соответствующего времени, через которое отмечают присутствие колоний, по своим характеристикам рассматривающихся как предполагаемые сальмонеллы.

4.5    Подтверждение

Проводят субкультивирование колоний предполагаемых сальмонелл (4.4) и подтверждают посредством соответствующих биохимических и серологических испытаний.

5 Питательная среда, реактивы и сыворотки

Для получения сопоставимых результатов при приготовлении питательных сред следует использовать безводные основные компоненты или безводные готовые среды и четко следовать инструкциям изготовителя. Используют только реактивы признанного аналитического качества.

Значения pH измеряют при температуре 25 °С. При необходимости осуществляют регулирование pH посредством добавления соляной кислоты (с (HCI) = 1 моль/дм³) или раствора едкого натрия (с (NaOH) = 1 моль/дм³].

Приготовленную питательную среду и реактивы, если их не применяют сразу же. хранят при условиях. которые не вызывают никаких изменений в их составе, в темном месте при температуре от 0 °С до 5 ^вС не более 1 мес. если не установлено иное.

5.1    Вода

Должна использоваться дистиллированная или деминерализованная вода или вода эквивалентной чистоты. В ней не должны присутствовать вещества, которые могут препятствовать росту микроорганизмов в условиях, установленных для испытаний в настоящем стандарте.

5.2    Питательные среды

5.2.1    Предварительно обогащенная среда. Забуферная пептониая вода

5.2.1.1    Состав

5.2.1.2 Приготовление

Растворяют все компоненты в воде, при нагревании. Устанавливают pH так. чтобы после стерилизации его значение составляло 7.010,1 ед. pH.

Среду разливают по 225 см³ в колбы (6.9) вместимостью 500 см³ (или в количестве, кратном 225 см³, помещают в другие колбы соответствующей вместимости). Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121 °С в течение 15 мин. Охлаждают до комнатной температуры.

ГОСТ ISO 6785-2015

5.2.2 Первая селективная обогащающая среда. Модифицированная среда хлорида магния/малахитового зеленого Раппапорта — Вассилиадиса (RVS-бул ьон)

5.2.2.1    Раствор А

5.2.2.1.1    Состав

5.2.2.1.2 Приготовление

Компоненты растворяют в воде, нагревая ее приблизительно до температуры 70 “С. Раствор А готовят в день приготовления RVS-бульона.

5 2.2.2 РастворВ

5.2.2.2.1 Состав

5.2.2.2.2 Приготовление

Гексагидрат хлорида магния растворяют в воде. Так как эта соль является очень гигроскопичной, то все содержимое МдС1₂ 6Н₂0 растворяют непосредственно после открытия контейнера. Например. 250 г МдС1₂ • 6Н₂0 добавляют к 625 см³ воды, получают раствор объемом 795 см³ с концентрацией приблизительно 0.3 г/см³ МдС1₂ • 6Н₂0.

Раствор В можно хранить в герметичной бутылке из темного стекла при комнатной температуре в течение двух лет.

5.2.2.3 Растворе

5.2.2.3.1 Состав

5.2.2.3.2 Приготовление

Растворяют малахитовый зеленый оксалат в воде.

Раствор С можно хранить в герметичной бутылке из темного стекла при комнатной температуре в течение 8 мес.

5.2.2.4 Готовая среда

5.2.2.4.1 Состав

5.2.2.4.2 Приготовление

К 1000 см³ раствора А добавляют 100 см³ раствора В и 10 см³ раствора С. Устанавливают pH так. чтобы после стерилизации его значение составляло 5,2 i 0,1 ед. pH. Полученный таким образом раствор в количестве 10 см³ помещают в пробирки (6.9) или стерильные колбы (6.8) подходящей вместимости, чтобы получить пробы, необходимые для испытания. Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 115 °С в течение 15 мин.

Хранят приготовленную среду в холодильнике при температуре (3 ± 2) °С.

5.2.3 Вторая селективная обогащающая среда. Срода соленита/цистина

Предупреждение — Особую осторожность слодует проявлять при лабораторном использовании селенитовых растворов из-за их токсичности. Запрещается набирать жидкость в пипетку ртом.

3

ГОСТ ISO 6785-2015

5.2.3.2    Приготовление

Первые три основных компонента растворяют в воде путем кипячения в течение 5 мим. После охлаждения добавляют натрий гидрогенселенит. Устанавливают pH так. чтобы его значение составляло

7.010.1 ед. pH. Не стерилизуют.

5.2.3.3    Раствор L-цистина

5.2.3.3.1 Состав

5.2.3.3.2 Приготовление

Компоненты помещают в стерильную мерную колбу с одним делением вместимостью 100 см³. Разбавляют до метки стерильной водой. Не стерилизуют.

5.2.3.4 Готовая среда

5.2.3.4.1 Состав

5.2.3.4.2 Приготовление

Раствор L-цистина добавляют к основе с соблюдением правил асептики. Устанавливают pH 7.0 • 0,1 ед. pH. Разливают среду с соблюдением правил асептики в стерильные колбы подходящей вместимости, чтобы получить пробы, необходимые для испытания.

Среду можно использовать до тех пор. пока не появится осадок красного цвета.

5.2.4 Первая плотная селективная среда. Агар с бриллиантовым зеленым/феноловым красным (Эделя — Кампсльмахсра)

5.2.4.1 Состав

5.2.4.2 Приготовление

Компоненты или безводную готовую основу растворяют в воде, при необходимости нагревая. Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации его значение составляло 7.0 * 0.1 ед. pH. Основу переносят в пробирки (6.9) или колбы (6.8) соответствующей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121 °С в течение 15 мин.

ГОСТ ISO 6785-2015

5.2.4.3 Раствор сахара/фенолового красного

5.2.4.3.1 Состав

5.2.4.3.2 Приготовление

Компоненты растворяют в 50 см³ воды в мерной колбе с одной меткой вместимостью 100 см³. Добавляют воды до метки. Раствор нагревают на водяной бане (6.5) при температуре 70 'С в течение 20 мин. Охлаждают на другой водяной бане (6.5) при температуре 55 °С. Используют раствор сразу после его охлаждения.

5.2.4.4 Раствор бриллиантового зеленого

5.2.4.4.1 Состав

5.2.4.4.2 Приготовление

Бриллиантовый зеленый растворяют в воде. Хранят раствор не менее одних суток в темном месте, чтобы произошла самостерилизация.

5.2.4.5 Готовая среда

5.2.45.1 Состав

5.2.4.5.2    Приготовление

Раствор бриллиантового зеленого (5.2.4.3) добавляют с соблюдением правил асептики к раствору сахара/фенолового красного (5.2.4.2), охлажденному на водяной бане (6.5). примерно при температуре 55 °С. Все это добавляют к основе, предварительно нагретой в водяной бане до температуры 55 ®С. и перемешивают. Во время перемешивания температура водяной бани должна поддерживаться в диапазоне от 50 “С до 55 ®С.

5.2.4.5.3    Подготовка агаровых пластинок

Помещают в каждую из соответствующего количества больших чашек Петри (6.12) приблизительно 40 см³ свежеприготовленной готовой среды (5.2.4.4). При отсутствии больших чашек среду в объеме приблизительно 15 см³ помещают в маленькие чашки Петри (6.12). Дают затвердеть. Если агаровые пластинки были приготовлены заранее, то их хранят не более 4 ч при комнатной температуре или в течение не более 1 недели при температуре от 0 °С до 5 ⁹С.

Непосредственно перед использованием агаровые пластинки тщательно просушивают (желательно со снятыми крышками и агаровой поверхностью вниз) в печи (6.2) при температуре 50 °С или в ламинарном вытяжном шкафу (6.2) до тех пор. пока поверхность не станет сухой.

5.2.5    Вторая селективная плотная среда

Выбор второй среды остается за испытательной лабораторией.

5.2.6    Питательный агар

5.2.6.1 Состав

5.2.6.2    Приготовление

Компоненты или безводную готовую среду растворяют в воде, при необходимости нагревая. Устанавливают pH так. чтобы после стерилизации его значение составляло 7,0 х 0.1 ед. pH. Питательную среду переносят в пробирки (6.9) или бутылки (6.8) соответствующей емкости. Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121 °С в течение 15 мин.

5.2.6.3    Подготовка агаровых пластинок

Переносят приблизительно 15 см³ расплавленной среды встерильные мелкие чашки Петри (6.12) и выполняют действия в соответствии с 5.2.4.4.3.

5.2.7 Трехсахарный железистый агар (TSI-arap)

5.2.7.1 Состав

5.2.7.2 Приготовление

Компоненты или безводную готовую среду растворяют в воде, при необходимости нагревая. Устанавливают pH так. чтобы после стерилизации его значение составляло 7.4 ± 0,1 ед. pH. Разливают среду по 10 см³ в пробирки (6.9) диаметром 17—18 мм. Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121 "С в течение 15 мин. Допускается устанавливать пробирки в наклонном положении так. чтобы получился столбик высотой 2.5 см и уклоном 4—5 см.

5.2.8 Агар с мочевиной (Кристенсена)

5.2.8.1 Состав

5.2.8.1.1    Приготовление

Компоненты или безводную готовую основу растворяют в воде, при необходимости нагревая. Устанавливают pH так. чтобы после стерилизации его значение составляло 6.8 х 0.1 ед. pH. Стерилизуют в автоклаве (6.1)при температуре 121 °С втечение 15 мин.

5.2.8.2 Раствор мочевины

52.8.2.1    Состав

5 2.8.2.2 Приготовление

Мочевину растворяют в воде, стерилизуют фильтрованием и проверяют стерильность. (Подробности способа стерилизации фильтрованием можно найти в соответствующем руководстве по микробиологии).