МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

СВИНЬИ

Методы лабораторной диагностики африканской чумы

Pigs. Methods of laboratory diagnostics of african plague

МКС 65.020.30 ОКСТУ 9809

Дата введения 01.01.91

Настоящий стандарт распространяется на свиней и устанавливает методы лабораторной диагностики африканской «сумы.

Стандарт предназначен для диагностирования заболевания свиней в ветеринарных лабораториях и ветеринарных научно-исследовательских учреждениях.

1. методы ОТБОРА ПРОБ

1.1.    Для проведения исследований от вынужденно убитых больных и павших свиней берут пробы органов и тканей — лимфатических узлов (подчелюстной, проталысый и мсзснтсриатьный), селезенки, легкого, крови и костного мозга.

Пробы берут не позднее чем через 10 ч после убоя или гибели животных.

1.2.    Пробы органов и крови хранят и транспортируют в термосе при 4 *С—8 *С нс более 24 ч после отбора. При более длительном хранении пробы замораживают.

2. метод ПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Сущность метода заключается в соединении специфических иммуноглобулинов африканской чумы свиней (АЧС), меченных флуорссцсинизотиоцианатом (ФИТЦ), со специфическим антигеном вируса АЧС в зараженных клетках и обнаружении комплекса «антиген-антитело* люминесцентной микроскопией.

2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Микроскоп люминесцентный.

Криостат.

Термостат.

Автоклав.

Холодильник бытовой.

Центрифуга лабораторная любого типа, обеспечивающая частоту вращения 5000 мин

Шприцы по МРТУ 46—23.

Банка цилиндрическая по ГОСТ 25336.

Стекла покровные по ГОСТ 6672.

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Пипетка пастеровская.

Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 11773.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Издание официальное    Перепечатка воспрещена

© Издательство стандартов, 1990 © Стандартинформ, 2005

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 18300.

Ацетон по ГОСТ 2603.

Эфир этиловый по ГОСТ 22300.

Парафин по ГОСТ 23683.

Глицерин для микроскопии по ГОСТ 6824.

Гепарин.

Раствор фосфатный буферный pH 7,2—7,4.

ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС.

ФИТЦ-иммуноглобулины классической чумы свиней (КЧС).

Вида дистиллированная.

2.2. Подготовка к анализу

2.2.1.    Приготовление фосфатного буферного раствора pH 7,2—7,4

Раствор А. В I дм³ дистиллированной воды растворяют 1,78 г двузамещенного фосфорнокислого натрия.

Раствор Б. В I дм³ дистиллированной воды растворяют 1,36 г однозамешенного фосфорнокислого калия.

К 850 см³ раствора А добавляют 250 см³ раствора Б. В I дм³ полученной смеси растворяют 8,5 г хлористого натрия. Полученный раствор стерилизуют в автоклаве в течение 2,5 ч при 2 атм.

2.2.2.    Приготовление буферного раствора глицерина

9 см³ глицерина смешивают с 1 см³ фосфатного буферного раствора.

2.2.3.    Приготовление тсст-прспаратов (срезов, мазков-отпечатков)

2.2.3.1.    От лимфатических узлов (подчелюстного, портального и мезентериального), селезенки и легких двух-трех свиней при помощи криостата берут пробы массой 5—10 г. Из проб готовят срезы толщиной 5 мк и помещают их на покровные стекла, предварительно обезжиренные смесью спирт-эфира в соотношении 1:1. Из каждого органа готовят четыре тест-препарата.

2.2.3.2.    Из лейкоцитов крови больных и интактных свиней готовят мазки-отпечатки. Для этого из краниальной полой вены берут 10—15 см³ крови в пробирку, содержащую гепарин 10—20 ЕД/см³. Кровь в пробирке осторожно перемешивают и выдерживают 30 мин при температуре 37 *С. Пастеровской пипеткой отбирают плазму с лейкоцитами, переносят в центрифуж-1зую пробирку и центрифугируют 10 мин с частотой вращения 1000 мин '. Надосадочную жидкость удаляют, а лейкоциты осадка наносят на покровные стекла и готовят по четыре мазка-отпечатка на одну пробу крови.

2.2.3.3.    Тсст-прспараты высушивают при комнатной температуре в течение 15—20 мин, помешают в сосуд с ацетоном, выдерживают 10—15 мин при температуре минус 10 *С и подсушивают на воздухе при комнатной температуре до полного испарения ацетона.

2.3.    Проведение анализа

Подготовленные тсст-прспараты обрабатывают ФИТЦ-иммуноглобулинами АЧС и КЧС. Для этого на предметные стекла, помещенные во влажную камеру, наносят капли ФИТЦ-имму-ноглобулинов и на них помешают тест-препараты срезом или мазком-отпечатком вниз. Камеру помещают в термостат и выдерживают 30 мин при температуре 37 *С. Затем тсст-прспараты промывают в фосфатном буферном растворе в течение 10 мин дважды со сменой раствора, ополаскивают в дистиллированной воле, подсушивают при комнатной температуре и помешают на капли раствора глицерина, нанесенные на предметные стекла. Края предметных стекол окантовывают расплавленным парафином. Тест-препараты просматривают под люминесцентным микроскопом.

2.4.    Оценка результатов

В клетках тест-препаратов органов и крови свиней, зараженных вирусом АЧС и обработанных Ф И Т Ц - им муногл обул и» юм АЧС, специфический антиген обнаруживают по свечению зеленого или желто-зеленого цвета в форме отдельных гранул (включений) в псринуклсарной зоне на фоне диффузного свечения зеленого или желто-зеленого цвета цитоплазмы клеток лимфоидного ряда или макрофагов.

В клетках тест-препаратов органов и крови свиней, не зараженных вирусом АЧС, обнаруживают тусклое свечение клеток серо-зеленого цвета.

При обработке ФИ ГЦ-иммуноглобулином КЧС тест-препаратов, приготовленных из проб органов и крови свиней, больных КЧС, обнаруживают ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток, часто расположенных группами.

ГОСТ 28573-90 С. 3

3. МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

Сущность метода заключается в инокуляции культуры лейкоцитов или костного мозга свиньи исследуемого материала и обнаружении реакции гсмадсорбции или вирус ©специфического антигена в клетках прямой иммунофлуорссцсшхисй.

3.1.    Аппаратура, материалы и реактивы

Термостат, обеспечивающий температуру нагрева 37 *С.

Центрифуга лабораторная любого типа, обеспечивающая частоту вращения 5000 мин¹.

Шкаф сушильный.

Микроскоп биологический.

Микроскоп люминесцентный.

Холодильник бытовой.

Мешалка магнитная.

Пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см³ по ГОСТ 29227.

Пробирки бактериологические.

Камера Горяева.

Стекла покровные по ГОСТ 6672.

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Цилиндры мерные вместимостью 50 и 100 см³ по ГОСТ 1770.

Банка цилиндрическая по ГОСТ 25336.

Ступка фарфоровая с пестиком.

Чашки Карреля.

Трубка силиконовая.

Иглы типа «Рекорд* 1А1-16-90-115.

Спирт этиловый рсктификова1шый по ГОСТ 18300.

Трспановый синий, раствор с массовой долей 0,5 %.

Монохлорамин Б технический по ГОСТ 14193, раствор с массовой долей 5 %.

Гидролизат лактальбумина на растворе Эрла, раствор с массовой долей 0,1 % (ростовая среда): готовят в соответствии с указаниями изготовителя.

Пенициллин.

Стрептомицин.

Гепарин.

Раствор фосфатный буферный pH 7,2—7,4; готовит по п. 2.2.1.

Ацетон по ГОСТ 2603.

ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС.

Вода дистиллированная.

3.2.    Подготовка к анализу

3.2.1. Приготовление культуры лейкоцитов крови

Культуру лейкоцитов готовят из крови здоровых поросят крупной белой породы живой массой 25—30 кг. Кровь берут в количестве 10—15 см³ из краниальной полой вены в стерильный цилиндр вместимостью 50—100 см³, содержащий гепарин 10—20 ЕД/см³, выдерживают 40—60 мин при температуре 37 *С и отделяют верхний слой, состоящий из плазмы и лейкоцитов. 11 л аз му с лейкоцитами тщательно перемешивают и определяют ко1шентрацию клеток.

Подсчет клеток проводят в камере Горяева. Для этого к пробе клеточной суспензии добавляют равный объем раствора трепанового синего с массовой долей 0,5 %. Количество клеток определяют по всему полю камеры, имеющей 25 больших и 100 малых квадратов. Число клеток умножают на 2200. Полученный результат соответствует количеству клеток в I см³ суспензии.

Для посева используют суспензию, содержащую 4—6 млн лейкоцитов в 1 см³. Для получения средней посевной концехгтрации 5 млн/см³ к плазме с лейкоцитами добавляют необходимое количество питательной среды pH 7,2—7,4 следующего состава: 0,1 % гидролизата лактальбумина на растворе Эрла, пенициллин 100—200 ЕД/см³, стрептомицин 100—200 мт/см³, гепарин 10—20 ЕД/см³.

Приготовленную суспензию клеток рахливают по 9—10 см³ в чашки Карреля или по 2—3 см³ в пробирки с пластинками из покровных стекол, помешают в термостат при температуре 37 *С и выдерживают в течение 2—3 суг.

Для исследования используют культуру клеток с плотностью нс менее 400—500 клеток в поле зрения микроскопа (увеличение 10 х 10) с отчетливой ростовой активностью. Клетки должны быть прозрачными, без зернистости, различной величины, без признаков дегенерации.

3.2.2.    Приготовление культуры клеток костного мозга

Поросят обескровливают через сонную артерию или сердце с помощью полого ножа. Кровь собирают в стерильный сосуд и выдерживают при температуре 37 *С в течение 1—3 ч. Затем сыворотку отсасывают в стерильный флакон и осветляют центрифугированием при 2000—2500 в течение 30 мин. Сыворотку инактивируют при 56 *С в течение 30 мин.

После обескровливания у поросят удаляют кожный покров вместе с мышечной тканью в области бедренной кости, предварительно продезинфицировав этот участок йодированным спиртом, и отделенную бедренную кость разрезают на расстоянии 2 см от суставов. Изалскают костный мозг, помешают в колбу с магнитом, содержащую 0,1 % гидролизата лактальбумина на растворе Эрла. Содержимое колбы перемешивают на магнитной мешалке в течение 15 мин и центрифугируют при 2000—2500 мин^-1 в течение 10 мин. Осалок рссуспснзируют ростовой средой и определяют количество клеток, как указано в п. 3.2.1. Суспензию клеток разбааляют ростовой средой до концентрации 4—6 млн/см³ и разливают в чашки Карреля и в пробирки с пластинками из покровных стекол. К питательной среде, приготоаленной по п. 3.2.1, добааляют сыворотку свиньи до концентрации 10 %.

3.2.3.    Приготовление суспензии органов

Пробы селезенки, легкого, лимфатических узлов (подчелюстного, мсэс»гтсриалыюго) в стерильных условиях очищают от соединительной и жировой тканей, делают навески массой 2—3 г, тщательно растирают каждую в отдельности в ступке со стерильным стеклянным песком и добааляют стерильный фосфатный буферный раствор до соотношения 1:10. Приготоалснныс суспензии подвергают 1-2-кратному замораживанию и оттаиванию и центрифугируют при 3000 мин-' в течение 15—20 мин. Над осад очную жидкость отсасывают, добааляют пенициллин 500 НД/см³, стрептомицин 500 мг/см³, выдерживают 1 ч при температуре 37 'С и используют для инокуляции культуры клеток лейкоцитов или костного мозга.

Оставшийся после приготоаления суспензий материал обезвреживают в растворе монохлорамина Б с массовой долей 5 % с последующей утилизацией после термической обработки.

3.3.    Проведение анализа

Культуру лейкоцитов или костного мозга, вырашешгых в чашках Карреля и в пробирках, инокулируют приготоаленными суспензиями органов без удаления питательной среды. На каждую пробу берут по четыре чашки Карреля и 8—10 пробирок. В первые две чашки вносят по 1,0 см³, в две другие чашки и в пробирки — по 0,1 см³ суспензии и инкубируют при температуре 37 *С в течение 5—7 сут.

Культуру клеток просматривают на наличие реакции гемалсорбции при малом увеличении микроскопа (10 х 10). Первый просмотр проводят через 15—18 ч после инокуляции. Перед просмотром чашки слегка встряхивают.

При отсутствии реакции гемалсорбции в течение 5—7 сут проводят два пассажа на аналогичной культуре клеток. Параллельно культуру клеток, инокулированную в пробирках, обрабатывают методом прямой иммунофлуоресиешши. Для этого пластинки извлекают из пробирок, высушивают, помешают в ацетон на 10 мин и обрабатывают ФИТП-иммуноглобулином ЛЧС, как указано в п. 2.3.

3.4.    Оценка результатов

При наличии в исследуемом материале вируса ЛЧС наблюдают реакцию гемалсорбции, про-яаляющуюся в виде «розетки* эритроцитов на поверхности отдельных клеток. При легком встряхивании эритроциты остаются на клетках.

Результат выделения вируса АЧС считается положительным при наличии реакции гемадсорб-ции в инокулированной культуре клеток и при положительной реакции методом прямой иммуно-флуоресценции.

Результат выделения вируса ЛЧС считается отрицательным при отсутствии реакции гсмадсорб-ции в инокулированной культуре клеток в течение трех пассажей и отрицательной реакции методом прямой иммунофлуорссцегщии.

4. MI-ГГОД ПОСТАНОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ

Супшость метода заключается в воспроизведении заболевания африканской чумой при введении восприимчивым и иммунным к вирусу классической чумы свиньям суспензии органов и крови, взятых от вынужденно убитых больных и павших свиней.

4.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Термостат, обеспечивающий температуру нагрева 37 *С.

ГОСТ 28573-90 С. 5

Центрифуга лабораторная любого типа, обеспечивающая частоту вращения 5000 мин '.

Автоклав.

Термометры ветеринарные.

Пипетки градуированные вместимостью 5 и 10 см³ по ГОСТ 29227.

Ступка фарфоровая с пестиком.

Поросята живой массой 25—30 кг, нспривитые против КЧС, 6 гол.

Раствор фосфатный буферный pH 7,2—7,4 стерильный; готовят по п. 2.2.1.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 18300.

Пенициллин.

Стрептомицин.

Вирус классической чумы свиней (КЧС), эпизоотический вирулентный с активностью 10W ЛД^см³.

Вирусвакцина культуральная из штамма «К* ЛК-ВНИИВВиМ или ВГНКИ с активностью 105 0 ИмД^см³.

4.2. Подготовка к анализу

4.2.1.    Приготовление суспензии органов — по п. 3.2.3.

4.2.2.    Подготовка животных

Четырем поросятам вводят культуральную вирусвакцину из штамма «К» ЛК-ВНИИВВиМ или ВГНКИ в разведении 1:100 внутримышечно. У вакцинированных и нсвакцинированных поросят ежедневно измеряют температуру. Через 15—20 сут после вакцинации при отсутствии клинических признаков болезни поросят используют для постановки биопробы.

4.3.    Проведение анализа

Двум вакцинированным и двум нс вакцинированным поросятам, содержащимся в одном боксе, вводят внутримышечно (в области внутренней поверхности бедра) по 2 см³ смеси суспензий органов вынужденно убитых бальных и павших свиней. Двум вакцинированным поросятам, содержащимся в другом боксе, вводят эпизоотический вирулентный вирус КЧС в дозе I0^{4 0} ЛДза/см³. За животными ведут наблюдете в течение 15 сут с ежедневным измерением температуры тела. В конце контрольного периода животных забивают и сравнивают результаты патолого-анатомических и гистологических исследований павших и уб»пых животных с клиническими признаками АЧС. Параллельно пробы органов исследуют методами прямой иммунофлуоресненции, выделения и идентификации вируса.

4.4.    Оценка результатов

Биопробу считают положительной, если у свиней, инокулированных суспензией органов бать-ных африканской чумой свиней, установлены признаки болезни или набиодается гибель.

При обнаружении клинических признаков болезни или гибели только нсвакцинированных свиней, проводят исследование на подтверждение классической чумы свиней методом прямой иммунофлуоресненции с применением ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС.

5. МСТОД ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА АЧС В РЕАКЦИИ АУТОГЕМ АДСОРБЦИИ

Сущность метода заключается в выявлении гсмадсорбируюших клеток, сформированных в организме больного АЧС животного.

5.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Термостат.

Микроскоп световой инвертирова!шый или обычный.

Шприцы вместимостью 10—20 см³ по МРГУ 46—23.

Иглы инъекционные типа «Рекорд* IA1 16-20-115 или 15150.

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Стекла покровные по ГОСТ 6672.

Пипетки мерные по ГОСТ 29227.

Флаконы пенициллиновые.

Панели пластиковые 96-луночные по ТУ 92-2-428.

Раствор фосфатный буферный pH 7,2—7,4; готовят по п. 2.2.1.

Гепарин.

Пенициллин.

Стрептомицин.

5.2.    Подготовка к анализу

Из краниальной полой, ушной или хвостовой вены свиней берут 10—15 см³ крови в пробирки, содержащие гепарин в количестве 10—20 ЕД/см³.

5.3.    Проведение анализа

Пробирки с отобранными пробами крови помещают в вертикальном положении в термостат при температуре 37 *С. Пипеткой отбирают верхний слой плазмы, содержащей лейкоциты с эритроцитами. Отобранную плазму крови вносят по 50—100 мм³ в 2—4 лунки панели, по 1—3 см³ в 2—4 пробирки и готовят двукратные разведения суспензии клеток с 1:2 до 1:128. Для разведения используют стерильный физиологический раствор, содержащий пенициллин 100—200 ЕД/см³, стрептомицин 100—200 мг/см³ и гепарин 10—15 ЕД/см³.

Панели с приготовленными разведениями лейкоцитарной фракции крови просматривают под инвертированным, пробирки — под обычным микроскопом.

5.4.    Оценка результатов

При положительной реакции обнаруживают гсмалсорбцию, проявляющуюся в виде «розетки* эритроцитов на поверхности отдельных клеток. При отсутствии «розеток* плазму с клетками рассматривают как культуру лейкоцитов. Для этого панели с культурой клеток продолжают инкубировать при температуре 37 *С и результаты оценивают по п. 3.4.

При отсутствии реакции гсмадсорбции препараты высушивают, обрабатывают ацетоном и ставят реакцию прямой иммунофлуоресценции.

6. МЕТОД НЕПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Сущность метода заключается в соединении иммуноглобулинов ЛЧС исследуемой сыворотки свиней с вирусоспсцифичсским антигеном тсст-прспаратов ЛЧС и обнаружении комплекса «антиген-антитело* обработкой антисвиными ФИ'ГЦ-иммуноглобулинами и люминесцентной микроскопией.

6.1.    Аппаратура, материалы и реактивы

Микроскоп люминесцентный.

Термостат.

Центрифуга лабораторная любого типа, обеспечивающая частоту вращения 5000 мин •.

Холодильник бытовой.

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Стекла покровные по ГОСТ 6672.

Раствор фосфатный буферный pH 7,2—7,4; готовят по п. 2.2.1.

Раствор глицерина буферный; готовят по п. 2.2.2.

Парафин по ГОСТ 23683.

Тест-прспараты специфические ЛЧС и отрицательные; готовят следующим образом: специфические ЛЧС тест-прспараты готовят заражением перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15), выращенной на покровных стеклах в пробирках, вирусом ЛЧС, высушиванием и обработкой ацетоном. Orpin отельные тест-препараты готовят аналогично, но не заражая вирусом ЛЧС. Хранят в герметической емкости при температуре минус 20 *С.

ФИТЦ-иммуноглобулины антисвиные, представляющие собой иммуноглобулины кролика или осла, иммунизированных иммуноглобулинами сыворотки свиньи, и меченные ФИ'ГЦ.

Сыворотки свиньи отрицательные и положительные к вирусу ЛЧС.

6.2.    Подготовка к анализу

6.2.1.    Пробы крови — по п. 5.2.

6.2.2.    Суспензии органов — по п. 3.2.3.

6.3. Проведение анализа

Капли положительных и отрицательных к вирусу ЛЧС сывороток и суспензий органов, разведенные в фосфатном буферном растворе 1:20, наносят на предметные стекла и добавляют специфические ЛЧС и отрицательные тест-препараты. Предметные стекла помешают в термостат и выдерживают 30 мин при температуре 37 *С. Затем тест-прспараты промывают в фосфатном буферном растворе в течение 10 мин дважды со сменой раствора, ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают при комнатной температуре. Далее тест-препараты обрабатывают антисвиными ФИТЦ-иммуноглобулинами, как указано в п. 2.3, и просматривают под люминесцентным микроскопом.

ГОСТ 28573-90 С. 7

6.4. Оценка результатов

При положительной реакции в клетках специфических тест-препаратов АЧС, обработанных исследуемыми сыворотками и суспензиями органов, обнаруживают специфический антиген вируса ЛЧС.

При отрицательной реакции в указанных тсст-прспаратах обнаруживают тусклое свечение клеток серо-зеленого цвета.

7. метод ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

Сущность метола заключается во взаимодействии специфического антигена АЧС, фиксированного на твердой фазе с сыворотками АЧС и псроксилазным антисвиным конъюгатом, и регистрации комплекса по остаточной ферментативной активности с помощью субстрата.

7.1.    Аппаратура, материалы и реактивы

Термостат.

Холодильник бытовой.

Спектрофотометр.

Панели пластиковые 96-луночныс по ТУ 92-2-428.

Микропипстка многоканальная регулируемая вместимостью 50—200 мм³.

Микропипетка одноканальная регулируемая вместимостью 50— 200 мм³.

Натрия карбонат по ГОСТ 83.

Перекись водорода по ГОСТ 10929, раствор с массовой долей 3 %; готовят следующим образом: к 10 см³ дистиллированной воды добавляют 1 см³ раствора перекиси водорода с массовой далей 33 %.

Натрия бикарбонат по ГОСТ 4201.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный, 12-водный по ГОСТ 4172, раствор концентрации c(Na₂HP0₄ • 12Н₂0) ■ 0,2 моль/дм³, готовят следующим образом: 2,84 г двузамещенного форсфор-нокислого натрия 12-водного растворяют в 100 см³ дистиллированной воды.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Натрий азид.

Калий хлористый по ГОСТ 4234.

Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198.

Кислота лимонная по ГОСТ 3652, раствор концентрации 0,1 моль/дм³; готовят следующим образом: 1,92 г лимонной кислоты растворяют в 100 см³ дистиллированной волы.

Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор концентрации с c(V₂H₂S0₄) = 2,5 моль/дм³.

Твин-20.

Раствор буферный карбонатно-бикарбонатный pH 9,5 для сенсибилизации пластин концентрации 0,05 моль/дм³; готовят следующим образом: 0,795 г карбоната натрия, 0,100 г азида натрия и 1,465 г бикарбоната натрия растворяют в 500 см³ бидистиллированной воды.

Раствор фосфатно-буферный (отмывочный); готовят следующим образом: 16,0 г хлористого натрия, 0,400 г аднозамехцеиного фосфорнокислого катия, 5,8 г двузамещетюго фосфорнокислого 12-водного натрия, 0,2 г хлористого катия и 1,6 см³ твин-20 растворяют в 2 дм³ бидистиллированной волы.

Раствор ортофенилендиамина (субстрат); готовят следующим образом: 40 мг ортофениленди-амина растворяют в 100 см³ буферного фосфатно-нитратного раствора pH 4,9. Перед использованием к раствору добавляют 1,4 см³ раствора перекиси водорода с массовой долей 3 %.

Альбумин яичный лиофилизированный по ТУ 6-09-4477, раствор с массовой датей I %; готовят следующим образом: I г яичного альбумина растворяют в 100 см³ фосфатно-буферного раствора.

Альбумин бычий сывороточный лиофилизированный по ТУ 09-10-342.

Ко1ГЬюгат иммунопсроксклазный антисвиной.

Антиген специфический АЧС.

Антиген отрицательный.

Сыворотка специфическая АЧС.

Сыворотка отрицательная свиная.

Вода дистиллированная.

Вода бидистиллированная.

7.2.    Подготовка к анализу

Специфический АЧС и отрицательный антигены разводят в буферном карбонатно-бикарбо-

С. 8 ГОСТ 28573-90

натном растворе концентрации 0,05 моль/дм³ в соответствии с дозой, указанной на препарате, и вносят в лунки панелей по 200 мм³ в лунку. Панели выдерживают 18—20 ч при температуре 18 *С—20 *С (сенсибилизация). После сенсибилизации панели промывают фосфатно-буферным раствором трижды, удаляют отмывочный раствор, в лунки вносят по 200 мм³ раствора яичного альбумина с массовой долей 1 % и выдерживают 15 мин при температуре 18 *С—20 *С. Панели промывают фосфатно-буферным раствором трижды и используют для постановки реакции.

7.3.    Проведение анализа

В лунки панелей со специфическими АЧС и отрицательными а!ггигенами вносят по 200 мм³ исследуемых сывороток больных и подозреваемых в заболевании свиней, взятых в пятикратном разведении. Разведения сывороток готовят на фосфатно-буферном растворе.

Посте 2 ч инкубации при температуре 37 *С панели промывают и в лунки вносят по 200 мм³ пероксидазного антисвиного конъюгата, разведенного на фосфатно-буферном растворе с яичным альбумином с массовой долей 1 %, в рабочем разведении, указанном на ампуле препарата. В лунку IA конъюгат не вносят (контрольная лунка). Посте I ч инкубации конъюгат удаляют: пансти промывают, как указано в п. 7.2, и в каждую лунку вносят по 200 мм³ раствора субстрата. Когда раствор субстрата в лунках начинает окрашиваться (примерно через 20 мин), его фотомстрируют на спектрофотометре при длине волны 495 нм. Для визуальной опенки реакцию останавливают при помощи раствора серной кислоты концентрации CO/2H2SO4) “ 0,2 моль/дм³, внося в каждую лунку по 250 мм³.

7.4.    Оценка результатов

При визуальной оцешее результаты реакции учитывают по интенсивности окрашивания субстрата. В лунках со специфической сывороткой и специфическим антигеном должно быть интенсивное желтое или желто-коричневой окрашивание субстрата.

В лунках со специфической сывороткой и нормальным а»гтигеном, отрицательной сыворотки со специфическим и отрицательным антигенами окрашивания нс должно быть.

При оценке результатов на спектрофотометре реакция считается положительной, если отношение положительных и отрицательных контролей составляет 2,1 и более раза. Исследуемые сыворотки считаются положительными с разведениями 1:125 и выше. Сыворотки, показывающие положительную реакцию в разведе»шях 1:5 и 1:25, считаются сомнительными.

ГОСТ 28573-90 С. 9

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1.    РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всесоюзным научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии

2.    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 12.06.90 Ns 1511

3.    В стандарт введен СТ СЭВ 6539—88

4.    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5.    ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД, на который дана ссылка	Номер пункта
ГОСТ 83-79	7.1
ГОСТ 1770-74	3.1
ГОСТ 2603-79	2.1; 3.1
ГОСТ 3652 69	7.1
ГОСТ 4172-76	7.1
ГОСТ 4198-75	2.1; 7.1
ГОСТ 4201-79	7.1
ГОСТ 4204 77	7.1
Г ОСТ 4233-77	2.1; 7.1
ГОСТ 4234-77	7.1
ГОСТ 6672-75	2.1; 3.1; 5.1; 6.1
ГОСТ 6824 96	2.1
ГОСТ 9284 75	2.1; 3.1; 5.1; 6.1
ГОСТ 10929 -76	7.1
ГОСТ 11773-76	2.1
ГОСТ 14193-78	3.1
ГОСТ 18300 87	2.1; 3.1; 4.1
ГОСТ 22300 76	2.1
ГОСТ 23683-89	2.1; 6.1
ГОСТ 25336-82	2.1; 3.1
ГОСТ 29227-91	3.1; 4.1; 5.1
ТУ 6-09-4477-77	7.1
ТУ 09-10-342-75	7.1
ТУ 92-2-428-83	5.1; 7.1
МРТУ 46-23-61	2.1; 5.1

6. Ограничение срока действия снято по протоколу Ns 5—94 Межгосударственного совета по стан дартизации, метрологии и сертификации (ИУС 11-12—94)

7. ПЕРЕИЗДАНИЕ. Июнь 2005 г.