ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

(Сборник нормативных материалов)

Москва, 1994 г.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

(Сборник нормативных материалов)

Москва, 1994 г.

ВВЕДЕНИЕ

Загрязнение пищевых продуктов токсичными чужеродными веществами является частью глобальной проблемы загрязнения окружающей среды, поэтому в настоящее время очень важным аспектом является определение микропримесей загрязняющих веществ в продуктах питания и снижение их содержания. В последние годы все больший приоритет приобретают исследования по определению таких токсикантов как различные микотоксины (афла-токсины, патулин, зеараленон, вомитоксин, трихотецены и др.), соли тяжелых металлов, нитриты, нитраты, N-нитрозамины и др.

Настоящий сборник включает в себя ранее изданные Методические указания по определению наиболее приоритетных загрязнителей пищевых продуктов, разработанные научно-исследовательскими институтами медицинского профиля и утвержденные Главным санитарно-эпидемиологическим управлением Минздрава СССР и ГКСЭН РФ.

В соответствии с Постановлением Госкомсанэп ид надзора Российской Федерации от 06.02.92 г. № 1 *0 порядке действия на территории Российской Федерации нормативных актов бывшего Союза ССР в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» на всей территории Российской Федерации действуют общесоюзные санитарные правила и нормативные акты впредь до принятия соответствующих нормативных актов Российской Федерации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

Сборник предназначен для санитарно-гигиенических лабораторий центров Госсанэпиднадзора, НИИ и учреждений гигиенического профиля, кафедр гигиены питания медицинских институтов и институтов усовершенствования врачей, а также может быть использован лабораториями других организаций, занимающихся исследованиями пищевых продуктов.

Будем признательны за все критические замечания и пожелания, направленные на улучшение данного Сборника или составление аналогичных Сборников по другим разделам исследований пищевых продуктов.

Л. Г. Подунова

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА В ЗЕРНЕ И ЗЕРНОПРОДУКТАХ

Оборудование и материалы

1.    Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78.

2.    Ротационный испаритель с ловушкой ИР-1М или аналогичный.

3.    Мельница лабораторная электрическая ЭМ-ЗА по ТУ 46-22-236-79.

— Методические указания по обнаружению, иде|ггификации и определению содержания дсзоксиниваяспола (вомитоксина) в зерне и зернопродуктах, Угв. М3 СССР 10 октября 1985 г. №3940-85

41

4.    Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа ОЛД-41.

5.    Жидкостный хроматограф «Алтекс», модель 336 или другой хроматограф с аналогичными параметрами; колонка и предколонка с силикагелем типа «Ультрасфера-si» с размером частиц 5 мкм, длина колонки 25 см, предколонки — 4,5 см, внутренний диаметр — 0,46 см; ультрафиолетовый детектор «Кратос», модель SF-757 или другой детектор с аналогичными параметрами.

6.    Микрошприц М111-1 — на 10 мкл.

7.    Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками.

8.    Пластинки для ТСХ «Силуфол» размером 15 х 15 см или 20 х 20 см, ЧССР.

9.    Колбы плоскодонные конические на 250 мл с IIШ 29, тип КнКШ 250-29/32 по ГОСТ 10394-74.

10.    Цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой, тип 2-100 по ГОСТ 1770-74.

11.    Колбы грушевидные на 50 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-74.

12.    Распылитель стеклянный с грушей.

13.    Стандартный раствор дезоксиниваленола в смеси бензол—ацетонитрил (5:1) с концентрацией 25 нг/мкл (по поводу получения стандартного раствора обращаться в Институт питания АМН СССР).

14.    Ацетонитрил, ч. по ТУ 6-09-3534-74.

15.    Ацетон. ч.д.а. по ГОСТ 2603-79.

16.    Эфир диэтиловый, медицинский по ГОСТ 6265-52.

17.    Кислота уксусная, чд.а. по ГОСТ 61-75.

18.    Бензол, чд.а. по ГОСТ 5955-75.

19.    Гексан, ч. по ТУ 6-09-3375-78.

20.    Изопропиловый спирт (пропанол-2), х.ч. по ТУ 6-09-402-76.

21.    Спирт этиловый —ректификат по ТУ 6-09-1710-77.

22.    Хлороформ для наркоза или по ГОСТ 3610-51.

23.    Алюминия окись нейтральная для хроматографии по Брокману П, «Реанал» номер по каталогу 01125 (Венгрия) или алюминия окись для хроматографии по ТУ 6-09-3916-75.

24.    Уголь активированный Р.72.270.3.

25.    Колонка стеклянная хроматографическая 220 х 15 мм.

26.    Метанол. чд.а. по ГОСТ 6995-77.

1. Экстракция

При отборе пробы для анализа следует руководствоваться требованиями ГОСТ 12430-66 «Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе». Отобранную пробу измельчают в течение 1—2 мин. в лабораторной мельнице или кофемолке. Навеску 25 г измельченного зерна или муки помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 мл, добавляют 20 мл воды и затем 105 мл ацетонитрила. Встряхивают

42

на аппарате для встряхивания проб и в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр.

2. Очистка экстракта

В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек ваты, насыпают 0,75 г окиси алюминия и сверху —слой 0,75 г активированного угля, предварительно растертого в ступке. Над слоем угля помещают кусочек ваты. Наливают в колонку 25 мл экстракта, соответствующие 5 г исходного образца (при анализе кукурузы наливают 15 мл экстракта, соответствующие 3 г исходного образца). Отбирают элюат и, не давая колонке просохнуть, добавляют еще 10 мл смеси ацетонитрил—вода (84:16). Соединенные элюаты фильтруют через бумажный складчатый фильтр в грушевидную колбу на 50 мл, бумажный фильтр промывают 5—10 мл изопропилового спирта в ту же колбу. Фильтрат упаривают на ротационном испарителе до объема 5—7 мл. Добавляют 20 мл изопропилового спирта и повторно упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток в колбе после упаривания не должен содержать капель воды. Остаток растворяют в 200 мкл смеси хлороформ—ацетонитрил (4:1) — раствор А.

3. Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола с помощью ТСХ

На пластинке «Силуфол» проводят тонкую карандашную линию в 1,5—2 см от нижнего края пластинки. На эту линию на расстоянии 2 см друг от друга наносят с помощью микрошприца 2, 5,-10 и 20 мкл раствора А. Между пятнами экстракта на расстоянии 1 см от них на ту же линию наносят 2, 4, 6 мкл стандартного раствора дезоксиниваленола (50, 100 и 150 нг дезоксиниваленола соответственно). Пластинку помещают в камеру для ТСХ и развивают в системе хлороформ—ацетон—изопропиловый спирт (78:22:10) на расстоянии 10 см. Пластинку извлекают, сушат на воздухе 3—4 мин. и опрыскивают 10%-ным раствором хлористого алюминия в этиловом спирте. Пластинку нагревают в сушильном шкафу в течение 5—7 мин. при 105° С, затем рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Дезоксиниваленол проявляется в виде пятен с синей флуоресценцией и хроматографической подвижностью (Rf) 0,4—0,5. Наличие в экстракте пятен, соответствующих по цвету флуоресценции и хроматографической подвижности стандарту дезоксиниваленола, свидетельствует о загрязнении образца дезокси-ниваленолом.

Для количественного определения сравнивают интенсивность флуоресценции разных количеств стандарта дезоксиниваленола с

43

интенсивностью флуоресценции его пятен в образце, приблизительно оценивая количество нг дезоксиниваленола в нанесенных на пластинку объемах раствора.

Концентрацию дезоксиниваленола в образце рассчитывают по формуле:

_л Vixm

^{С =} ^5000^МГ/КГ'^ГДС:

Vi — объем раствора А в мкл (200 мкл);

V2 — объем раствора А, нанесенный на пластинку в мкл; m — количество нг дезоксиниваленола в V2 мкл раствора А, оцененное визуальным сравнением со стандартом наТСХ-пла-стинке.

Если интенсивность флуоресценции пятна дезоксиниваленола в экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна дезоксиниваленола, соответствующего 6 мкл стандартного раствора, то следует разбавить раствор А, т. е. увеличить объем Vi, внеся соответствующие коррективы в расчетную формулу.

4. Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола с помощью ВЭЖХ

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза гексан—изопропиловый спирт—вода (75:25:1,5), скорость подвижной фазы 1,2 мл/мин. Рекомендуется использовать перегнанные растворители, фильтруя их через бумажный складчатый фильтр перед использованием. УФ-детектор устанавливается на длину волны 224 нм, шкала чувствительности 0,005. Входное напряжение самописца 10 мВ.

Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят 2 и 4 мкл стандартного раствора, что соответствует 50 и 100 нг дезоксиниваленола. Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на хроматограмме. При описанных выше условиях ВЭЖХ время выхода пика дезоксиниваленола составляет от 12 до 14 мин. в зависимости от изменений в составе подвижной фазы.

В инжектор хроматографа вводится 10 мкл раствора А. При наличии пика, совпадающего по времени выхода со стандартом, определяют его высоту (h₀6_P.).

Расчет концентрации дезоксиниваленола в образце проводят по формуле:

мг/кг, где:

Vi — объем раствора А, в мкл (200 мкл);

V2 — объем раствора А, внесенный в хроматограф, в мкл (10 мкл); ш — масса стандарта дезоксиниваленола, введенная в хроматограф, в нг,

her. — высота пика, соответствующая данной массе стандарта, в мм;

44

Ьобр.— высота пика дезОксиниваленола из образца, в мм.

Если пик дезоксиниваленола в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ проводят повторно после разбавления раствора А смесью хлороформ—ацетонитрил (4:1), т. е. после увеличения

объема Vi.

5. Подтверждение наличия и количественное определение дезоксиниваленола с помощью двумерной ТСХ

Пластинку «Силуфол» размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слоя силикагеля. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 20 мкл раствора А. В правом верхнем и левом нижнем углах пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят 2, 3, 4 и 5, 6 мкл стандартного раствора дезоксиниваленола соответственно. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир—метанол—вода—бензол (90:3:0,5:3) и развивают пластинку в первом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 4 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 мин. Затем проводят развитие пластинки во 2-ом направлении в системе хлороформ-ацетон—изопропиловый спирт (78:12:10). После достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 4 см от верхнего края пластинки, ее извлекают из камеры и сушат на воздухе. Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола проводят аналогично п. 3.

45

СОДЕРЖАНИЕ

I    МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ    *

1.    Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах методом тех.................................... 3

2.    Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах с

помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии    ...    11

3.    Методика определения афлатоксинов в продуктах животного

происхождения ................................. 19

4.    Методика определения содержания патулииа в фруктовых и

овощных соках и пюре............................ 26

5.    Методика определения мпкотоксина патулииа в продуктах

переработки плодов и овощей ....................... 31

6.    Методика определения зсарпленопл в пищевых продуктах    ....    37

7.    Методика определения дсзоксинивалспола (вомитокспна) в    зерне

и зернопродуктах................................ 41

8.    Методика определения дсзоксинниллснола и зсараленона в зерне

и зернопродуктах ............................... 45

9.    Методика определения Т-2 токсина в пищевых продуктах и

продовольственном сырье.......................... 53

10.    Методика определения охратоксина А в пищевых продуктах ...    57

11.    Методики определения мпкотокеппои: Т-2 токсина, зсараленона

(Ф-2) и охратоксина А............................ 63

II. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ 77

12.    Атомно-абсорбционные методы определения токсинных элементов в пищевых продуктах и пищевом сырье.............. 77

13.    Методика определения мстил-этилмсркурхлорида в пищевых

продуктах, кулннарно обработанных ................... 93

14.    Методика определения содержания общей ртути в пищевых

продуктах методом беспламенной атомной абсорбции....... 97

15.    Методика по определению хрома в овощных консервах...... 103

16.    Методика определения содержания гистамина в рыбопродуктах

(флуоромстричсский метод)......................... 105

17.    Метод выделения, идентификации и количественного определения

гистамина в рыбопродуктах (колориметрический метод)...... ПО

18.    Методика определения нитратов и нитритов в молоке и молочных

продуктах..................................... 114

19.    Методика определения жиратов и нитритов в плодовоощной

консервированной продукции........................ 124

биологических жидкостях .......................... 133

21.    Методика определения остаточных количеств

Эстрадиола-17/? в продуктах животноводства ............. 138

22.    Методика определения антибиотиков тстрациклинового ряда методом тонкослойной хромато<рафии (качественный анализ) ...    142

23.    Методика определения антибиотиков тетрацикл и нового ряда

<]»луоримстричсским методом (количественный анализ) ...... 143

24.    Определение летучих N-нитрозаминов в продовольственном сырье

и пищевых продуктах........................ .    .    .    ]4<з

Брагина И. В., Орехова II. Л- — специалисты лаборатории физико-химических методов исследований Российского Республиканского информационно-аналитического центра.

Под редакцией: Подуповой JI. Г. — заместители Главного государственного санитарного врача РФ, заслуженного врача РФ.

Подписано к печати. 21.11.94.

Формат 60 х 88/16. Бумага офсетная. Уел. псч. л. 9,8. Уел. кр.-огг. 9,8. Тираж 1000 экз. Зак. 220.

Изготовлено в Московской типографии № 11 Комитета по печати РФ. 113105, Москва, ул. Нагатинская, 1,