МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ГОСУДАРСТВЕННОГО САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА

Определение колиформных бактерий и E.coli с использованием хромогенных и флюорогенных индикаторных сред производства Merck (Германия)

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Издание официальное

Москоа 2004

Определение колиформных бактерий и Ecoli с использованием хромогенных и флюорогенных индикаторных сред производства Merck (Германия)

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

9. Порядок проведения испытания

9.1. Выявление колиформных бактерий и E.coll в определенной навеске образца.

9.1.1.    Навеску анализируемого образца (или ряд десятикратных разведений) в массе (объеме) которой предусматривается отсутствие колиформных бактерии и E.coli в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01, внести в среду Fluorocult LMX Broth (п. 8.1.1).

Соотношение между количеством (массой) высеваемого образца или его эквивалентным разведением и питательной средой - 1:9 по объему. Жидкие образцы можно не разводить.

Твердые образцы измельчить в гомогенизаторе (п.4.3).

Тампоны со смывами, взятые с объектов окружающей среды погрузить в пробирку с 5 см³ среды Fluorocult LMX Broth.

9.1.1.1.    Проверить наличие фоновой флюоресценции образца (особенно для проб, содержащих морепродукты) при облучении УФ-лампой (п.4.8).

9.1.2.    Посевы инкубировать при температуре (37±1)^вС в течение 21±3 часов.

9.1.3.    После инкубирования отметить наличие изменения цвета среды с образцами (смывами).

9.1.3.1.    Отсутствие изменения цвета среды учитывать как отсутствие в исследуемых образцах (смывах) колиформных бактерий и E.coli.

9.1.3.2.    Изменение цвета среды со светло-желтого на сине-зеленый подтверждает наличие колиформных бактерий.

9.1.3.3.    Для образцов, в которых среда изменила свой цвет, проверить наличие флюоресценциии при облучении УФ лампой. Флюоресценция среды указывает на возможное наличие E.coli.

Для подтверждения E.coli к флюоресцирующей среде добавить 1 см³ реактива Ковача (п.4.14) (индольный тест). Образование красного слоя на поверхности культуральной жидкости указывает на образование индола и подтверждает наличие E.coli (Табл.2).

ю

Примечание:

Для продовольственного сырья и пищевых продуктов, в той числе кисломолочных, заквасок, бактериальных концентратов и бактериальных препаратов молочнокислых бактерий, исследованных в соответствии с ГОСТ 30518 и ГОСТ 30726, для подтверждения принадлежности микроорганизмов к колиформным бактериям и Е.соП, пересеять образцы с жидких селективных сред на поверхность хромогенных агаризованных сред Chromocult Coliform Agar (п.8.1.2) или Chromocult Coll form Agar ES (n.8.1.3) с последующей идентификацией no n.9.Z3.

Схема проведения испытаний приведена в Приложении Ns3.

9.2. Определение количества колиформных бактерий и Е.соП.

9.2.1.    При определении количества колиформных бактерий и Е.соП в 1 г (см³) образца в соответствии с ГОСТ 30518, ГОСТ 30726 проводить посев навески образца (или его разведения) в объеме 0,1 или 0,2 см³ поверхностным методом, а в объеме 1 см³ - глубинным методом. При посеве использовать агаризованные среды Chromocult Coliform Agar (п.8.1.2) или Chromocult Coliform Agar ES (n.8.1.3).

Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посевы поверхностным и глубинным методами провести по ГОСТ 26670.

Жидкие образцы можно не разводить.

Твердые образцы измельчить в гомогенизаторе (п.4.3).

9.2.2.    Посевы инкубировать при температуре (37±1)°С в течение 21±3 часов.

9.2.3.    После инкубирования подсчитать характерно окрашенные колонии, выросшие на чашках Петри.

9.2.3.1.    Колиформные бактерии (за исключением Е.соП) образуют колонии розового (до красного) цвета.

9.2.3.2.    Е.соН образуют колонии темно-синего (до фиолетового) цвета.

Для подтверждения Е.соП на среде Chromocult Coliform Agar нанести каплю реактива Ковача (п.4.14) непосредственно на характерно окрашенные колонии (индольный тест). Изменение цвета реагента до розово-красного в течение нескольких секунд подтверждает наличие Е.соП.

9.1.3.3.    Для подсчета количества колиформных бактерий сложить количество

характерно окрашенных колоний по п.9.1.3.1 и п.9.1.3.2.

Дифференциация грамотрицательных бактерий на хромогенных средах Chromocult Coliform Agar и Chromocult Coliform Agar ES представлена в Табл.З.

п

Табл.№3.

Микроорганизмы Цвет колоний Индол Колиформные бактерии (за исключением E.coli) Розовый, красный E.coli Темно-синий, фиолетовый + Другие грам(-) бактерии Бесцветный, Бирюзовый Грам(+) бактерии Нет роста

Схема проведения испытаний приведена в Приложении №2.

10. Учет и оценка результатов испытаний

10.1.    Учет и оценку результатов испытаний по выявлению и количественному определению колиформных бактерий и E.coli в определенной навеске образца провести по ГОСТ 26670.

10.2.    Учет и оценку результатов испытаний смывов провести в соответствии с НД по контролю за микробиологической обсемененностъю окружающей среды на предприятиях торговли, общественного питания и лечебно-профилактических учреждений.

12

Определение колиформных бактерий и E.coli с использованием хромогенных и флюорогенных индикаторных сред производства Merck (Германия): Методические рекомендации.- М.:    Федеральный центр госсанэпиднадзора

Минздрава России, 2004.- 26 с.

1.    Разработаны: Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Брагина И.В., Криаопалова Н.С., Минаева НА, Белобородова О.К.), Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии (Котляров В.М., Фирсова Т.Е., Чевелева С.С.), МУП «Уфаводоканал» (Кантор Л.И., Труханова Н.В., Майтова Р.Ф.), центром госсанэпиднадзора в Южном Административном округе г. Москвы (Митрофанова ТА, Чернявский Г.И., Гудков АА), фирмой «Лаб-БиоМед», (Соколов Д.М., Кашинцев И.В.).

2.    Утверждены и введены в действие Заместителем главного государственного санитарного врача Российской Федерации - Главным врачом Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России Е.Н.Беляевым 10.02.2004 г.

3.    Введены впервые.

2

Содержание

внешней среды..................................................................... 4

1.    Общие положения и область применения............................................... 4

2.    Нормативные ссылки............................................................................ 5

3.    Требования к помещениям и технике безопасности.................................. 6

4.    Аппаратура, материалы, питательные среды............................................ 6

5.    Принцип действия хромогенных и флюорогенных питательных сред..........    6

6.    Сущность методов................................................................................ 7

7.    Отбор и подготовка проб....................................................................... 8

8.    Подготовка к проведению испытания...................................................... 8

9.    Порядок проведения испытания............................................................. 10

9.1.    Выявление колиформных бактерий и E.coli в определенной навеске

образца......................................................................................... 10

9.2.    Определение количества колиформных бактерий и E.coli.................... 11

10.    Учет и оценка результатов испытаний.................................................... 12

Приложение №1..................................................................................... 13

Приложение №2...................................................................................... 14

Приложение №3...................................................................................... 15

Раздел 2. Определение общих колиформных бактерий и E.coli в воде.....    16

1.    Общие положения и область применения................................................ 16

2.    Нормативные ссылки............................................................................ 16

3.    Требования к помещениям и технике безопасности.................................. 17

4.    Аппаратура, материалы, питательные среды............................................ 18

5.    Принцип действия хромогенных и флюорогенных индикаторных сред.........    18

6.    Сущность методов................................................................................ 20

7.    Методы отбора проб............................................................................. 20

8.    Подготовка к проведению испытаний...................................................... 20

9.    Порядок проведения испытания............................................................. 22

9.1.    Определение количества общих колиформных бактерий и E.coli 22

методом мембранной фильтрации..................................................

9.2.    Качественное определение общих колиформных бактерий и E.coli

методом прямого посева................................................................ 23

10.    Учет и оценка результатов испытаний................................................. 24

Приложение №1..................................................................................... 25

Приложение №2..................................................................................... 26

з

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель Главного государственного санитарного врача Российской Федерации -Главный врач Федерального центра Госсанэпиднадзора Минздрава России

Е.Н.Беляев

10 февраля 2004 г.

№ 24ФЦ/ 513

Дата введения: 01 марта 2004 г.

Определение колиформных бактерий и E.coli с использованием хромогенных и флюорогенных индикаторных сред производства Merck (Германия)

Методические рекомендации

Раздел 1. Определение колиформных бактерий и E.coli в пищевых продуктах, продовольственном сырье; смывах с объектов внешней среды

1. Общие положения и область применения

1.1.    Настоящие методические рекомендации устанавливают методы проведения лабораторных исследований по ускоренному определению и выявлению колиформных бактерий и E.coli с использованием хромогенных и флюорогенных индикаторных сред в образцах пищевых продуктов (кроме кисломолочных продуктов, заквасок, бактериальных концентратов и бактериальных препаратов молочнокислых бактерий), продовольственного сырья; смывов с объектов внешней среды.

1.2.    Методические рекомендации разработаны в соответствии с Федеральным законом «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения», Положением о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, Положением о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации.

1.3.    Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации и санитарно-эпидемиологической службы федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих государственный и ведомственный контроль; в лабораториях организаций, осуществляющих производственный контроль, а также в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения указанных испытаний.

4

2. Нормативные ссылки

2.1.    Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» № 52-ФЗ от 30 марта 1999 г.

2.2.    Закон РФ «О защите прав потребителей» от 7 февраля 1992 г.

2.3.    Закон РФ «О качестве и безопасности пищевых продуктов» № 29-ФЗ от 2 января 2000 г.

2.4.    «Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации», утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации № 554 от 24 июля 2000 г.

2.5.    «Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании», утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации № 554 от 24 июля 2000 г.

2.6.    СП 1.2.731-99 Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами.

2.7.    ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований.

2.8.    СанПиН 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов.

2.9.    СанПиН 2.3.2.1280-03 Дополнения и изменения №2 к СанПиН 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов.

2.10.    ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Порядок отбора проб для микробиологических анализов.

2.11.    ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов.

2.12.    ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов.

2.13.    ГОСТ 30518-97/ГОСТ Р 50474-93 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий).

2.14.    ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида E.coli.

2.15.    ИСО 16649. Количественное определение Escherichia coli в пищевых продуктах и кормах.

2.16.    ГОСТ 19569-89 Стерилизаторы паровые медицинские. Общие технические требования и методы испытаний.

2.17.    ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия.

2.18.    ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.

2.19.    ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия.

2.20.    ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.

2.21.    ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия.

5

3. Требования к помещениям и технике безопасности

Требования безопасности, общее расположение лаборатории, а также ее инфраструктура должны соответствовать требованиям СП 1.2.731-99, ГОСТ Р 51446.

4. Аппаратура, материалы, питательные среды*

4.1.    Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 37°С с отклонением от заданной ± 1°С

4.2.    Автоклав или стерилизатор паровой.

4.3.    Гомогенизатор бактериологический перистальтического типа Masticator (или аналогичный) со стерильными полиэтиленовыми пакетами.

4.4.    Облучатель бактерицидный.

4.5.    Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 1000г и допустимой погрешностью ±10мг.

4.6.    Баня водяная с подогревом до температуры 100±2°С

4.7.    Холодильник, позволяющий поддерживать температуру +2-4°С.

4.8.    УФ лампа 4Вт (или 6Вт), Зббнм.

4.9.    Пипетки градуированные 1-го и 2-го классов точности вместимостью 1 см³,10 см³.

4.10.    Пробирки бактериологические.

4.11.    Горелка газовая или спиртовая

4.12.    Спирт этиловый ректификованный технический

4.13.    Хромогенные и флюорогенные индикаторные среды

4.13.1.    Fluorocult LMX Broth

4.13.2.    Chromocult Conform Agar

4.13.3.    Chromocult Conform Agar ES (усиленной селективности)

4.14.    Реактив Ковача

5. Принцип действия хромогенных и флюорогенных питательных сред

Селективные хромогенные и флюорогенные индикаторные среды предназначены для ускоренного одновременного определения общих колиформных бактерий и E.coli в исследуемом образце.

Принцип действия хромогенных и флюорогенных сред основан на выявлении специфических ферментов - й-галактозидазы колиформных бактерий; й-глюкуронидазы и триптофаназы E.coli.

Специфическая активность ферментов проявляется в результате расщепления хромогенных и флюорогенных субстратов, входящих в состав индикаторных сред, с образованием флюоресцирующих или имеющих окраску продуктов, которые изменяют цвет (вызывают флюоресценцию) жидких сред или характерно окрашивают колонии на агаризованных средах.

’ Производство питательных сред компании Merck KGaA (Германия) имеет международный сертификат качества ISO 9001:2000.

На среде Fluorocult LMX Broth й-галактозидаза колиформных бактерий расщепляет хромогенный субстрат (X-GAL) с образованием окрашенного продукта, который изменяет цвет среды со светло-желтого на сине-зеленый. Фермент й-глюкуронидаза E.coli расщепляет флюорогенный субстрат (MUG¹) с образованием флюоресцирующего (при воздействии УФ-света) продукта.

На средах Chromocult Coliform Agar и Chromocult Coliform Agar ES й-галактозидаза колиформных бактерий расщепляет хромогенный субстрат (Salmon-GAL¹) с образованием хромогенного продукта, который окрашивает колонии в розовый (до красного) цвет. Ферменты й-галактозидаза и й-глюкуронидаза E.coli расщепляют    хромогенные    субстраты

(Salmon-GAL и X-GLUC¹) с образованием хромогенных продуктов, которые окрашивают колонии в темно-синий (до фиолетового) цвет.

Фермент триптофаназа выявляется при расщеплении триптофана, включенного в состав сред Fluorocult LMX Broth и Chromocult Coliform Agar, с подтверждением образования индола реактивом Ковача.

Для целей настоящих МР применяются следующие определения:

Колиформные бактерии - микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae, характеризующиеся наличием фермента р-галактозидазы, способного расщеплять специфические хромогенные субстраты, входящие в состав селективных индикаторных сред.

Е.со11 - колиформные бактерии, характеризующиеся наличием фермента р-глюкуронидаэы, способного расщеплять специфические хромогенные или флюорогенные субстраты, входящие в состав селективных индикаторных сред, и фермента триптофанаэы, расщепляющей триптофан.

Входящие в состав индикаторных сред качественные пептоны и фосфатный буфер обеспечивают оптимальные условия роста колиформных бактерий; триптофан дает возможность проведения индольного теста для окончательного подтверждения E.coli; пируват натрия восстанавливает поврежденные клетки колиформных бактерий и повышает чувствительность метода. Селективные агенты (лаурилсульфат натрия, тергитол 7, соли желчных кислот и пропионовая кислота) ингибируют рост сопутствующей микрофлоры.

Метод одновременного определения колиформных бактерий и E.coli с использованием хромогенных и флюорогенных питательных сред является высокочувствительным, специфичным, позволяет сократить время исследования до 24 часов.

6. Сущность методов

6.1. Метод выявления колиформных бактерий и E.coli основан на высеве определенного количества исследуемого образца или его разведений в жидкие селективные хромогенные среды; инкубировании посевов; учете изменения цвета и

флюоресценции среды с образцами; подтверждении образования индола для E.coli.

6.2. Метод определения количества колиформных бактерий и E.coli основан на высеве определенного количества образца или его разведений на агаризованные хромогенные селективные среды; инкубировании посевов; выявлении и подсчете характерно окрашенных колоний.

7. Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовку проб проводят по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669 и другим действующим ГОСТ и НД на анализируемый вид образцов, а также в соответствии с НД по контролю за предприятиями торговли, общественного питания, пищевой промышленности и лечебно-профилактическими учреждениями.

8. Подготовка к проведению испытания

8.1. Состав, приготовление и условия хранения индикаторных сред.

8.1.1.    Fluorocult LMX Broth (n.4.13.1)

Состав среды в (г/дм³)

Пептоны - 5,0; хлорид натрия - 5,0; сорбитол -1,0; триптофан -1,0;

гидрофосфат калия двузамещенный - 2,7; дигидрофосфат калия - 2,0; лаурилсульфат натрия -1,0;

1-изопропил-G-D-1-тио-галактопиранозид (IPTG) - 0,1 хромогенный субстрат:

5-бром-4-хлор-3-индолил-й-0-гапактопиранозид (X-GAL) - 0,008; Флюорогенный субстрат

4-метилумбеллиферил-й-0-глюкуронид (MUG) - 0,005.

Приготовление среды

В 1 дм³ дистиллированной воды растворить 17г сухой питательной среды. Стерилизовать в автоклаве при температуре (121±1)°С 15 минут. Приготовленная среда прозрачная светло-желтого цвета.

Условия хранения

При комнатной температуре до 6 месяцев.

8.1.2.    Chromocult Conform Agar (п.4.13.2)

Состав среды в (г/дм³).

Пептоны - 3,0; хлорид натрия - 5,0;

дигидрофосфат натрия однозамещенный - 2,2; гидрофосфат натрия двузамещенный - 2,7;

пируват натрия -1,0; триптофан - 1,0; агар-агар -10,0; сорбитол -1,0; тергитол-7 - 0,15;

1-изопропил-8-[>-1-тио-галактопиранозид (IPTG) - 0,1; хромогенные субстраты:

б-хлор-З-индолил-б-О-галактопиранозид (Salmon-GAL) - 0,15;

5-бром-4-хлор-3-индолил-В-[)-глюкуронид (X-GLUC) - 0,1.

Приготовление среды.

В 1 дм³ дистиллированной воды растворить 26,5 г сухой питательной среды. Нагревать на кипящей водяной бане, периодически помешивать до полного растворения (около 35 мин). Не автоклавировать! Не перегревать!

Среду разлить в стерильные чашки Петри или пробирки по 15 см³.

Готовые чашки со средой опалесцируют, желтоватого цвета.

Для предотвращения от высыхания поместить чашки со средой в пластиковые мешки.

Условия хранения.

Чашки со средой хранить в холодильнике при температуре (2-4)°С.

Срок годности готовой среды на чашках - 3 недели.

8.1.3. Chromocult Coliform Agar ES (усиленной селективности) (n.4.13.3).

Состав среды в (г/дм³).

Пептоны - 5,0; хлорид калия - 7,5;

MOPS-10.0;

соли желчных кислот -1,15; пропионовая кислота - 0,5; агар-агар -10,0;

1-изо пропил-G-D-1-тио-галактопираноз ид (IPTG) - 0,1; хромогенные субстраты:

б-хлор-З-индолил-В-О-галактопиранозид (Salmon-GAL) - 0,15; 5-бром-4-хлор-3-индолил-й-С)-глюкуронид (X-GLUC) - 0,1.

Приготовление среды.

В 1 дм³ дистиллированной воды растворить 34,5 г сухой питательной среды. Нагревать на кипящей водяной бане, периодически помешивать до полного растворения (около 45 мин). Не автоклавировать! Не перегревать!

Среду разлить в стерильные чашки Петри или пробирки по 15 см³.

Готовые чашки со средой прозрачные и бесцветные.

Для предотвращения от высыхания поместить чашки со средой в пластиковые мешки.

Условия хранения.

Чашки со средой хранить в холодильнике при температуре (2-4)°С. Срок годности готовой среды на чашках - 2 недели.

9

1

См.состав питательных сред.