*пшшът
Заместитель Главного Государственного санитарного врача СССР
А«й* Зайченко м 12 » апреля_I9£Pi*«
№ 32*7-85
ВРЕМЕННЫЕ
ИШДИЧВСШВ УКАЗАНИЯ НО ОПРЩВ1Ш0 БАЗУДИНА В ДШРСТШШОМ ГАСТИШЬНОМ СЬЕ>ЬВ ЭНЗШЮ-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ { Дополнение к методическим указаниям цо определению б&зудшга а воде, почве и р&отнтхьном материале тонкослойной н гаэошодЕоотной хроматографией £19X6-78)
I* Краткая характеристика препарата Б&вудт СО * О -ди *щ мдид )-то-
фооф&т - циашяой Структурная формула
CjgHgjHgOjPS
N.m. Э№,4
Z* Методика определения базудша Метод основан на з&стр&кщш ардоарата шш шюдедуемод проба оргязтдо&вм фтътрттт, ©чтотзш зкотршста % ©продавшим ме~ тедзж хроматографам в тштм сдое о эдзоди&ш лрояодвшза тат аетшда препарата пт mmtmm » парах брома» Бааудда, дефвоб-* ши к угнетения доядо&отФрдзн азчяяя крупного рогатого скота, йраяядятя а щде гтш бадего даота на голубом <$©ш.
ш
Количественное определение производит путей сражения пятен проб в стандарта.
2.1 .1. Метрологическая характеристика метода
Минимально детектируемое количество 1-5 нг или 0,001 ~0,005 и кг
Няюшй предел определения 0,05 нг/кг
|
Среднее значение определения,£ Стандартное отклонение,| для астрагала верстмото- |
|
цветкового |
93 |
2,5 |
|
алтея лекарственного |
84 |
7.6 |
|
мака масличного |
91 |
3.5 |
|
ревеня тангутокого |
60 |
II.3 |
|
ноготков лекарственных |
90 |
2,6 |
|
плодов виновника |
89 |
3,1 |
|
Относительное стандартное отклонение,$ для астрагала яеротиото- |
Доверительный вдтарвв* орадиего при аш5 и р»0 |
|
цветкового |
и |
3,0 |
|
алтея лекарственного |
э,* |
8.0 |
|
ыака масличного |
1.5 |
м |
|
ревеня тангутокого |
5.1 |
I't.I |
|
ноготков лекарственных |
1.3 |
З.б |
|
плодов шиповника |
М |
З.в |
2,2. Реактивы и раствори Бензол ,ч.д.а.,Г0СТ 5955-7Я Этиловый спирт^ректификат, ТУ 6-G9-X7-IQ-77. Бром, ч., ГОСТ 4109-79.
Борная кислота, х.ч.,ГОСТ 9656-75. Индокоилацетат, ч.д.а.,ТУ 6-09^7-1156-78, Уксусная кислота, х.ч., ГОСТ 6552-80. Ортофосфорнал кислота,x.4vr0CT 6 552-80.
105
Г океан х.ч. ТУ 6-09-3375-78
у i
Дкметилформамид^ х.ч.^ ГОСТ 20258-74
Калий жвлеэосинеродистый^х.ч.^ ГОСТ 4206-75 - 1,6 % водный раствор
Калий желеэистосинеродиотый,х.ч., ГОСТ 4207-65 - 2^-ный водный раствор
Активированный уголь марки ОУ-А
Буферный раствор pH 8,69 - готовят смесь ортофосфорной (2,1 ил), уксусной (2,3 мл) и борной ( 2,47 г) кислот и доводят дистиллированной водой до I л. Для получения буфера о pH 8,69 к 100 мл указ^я-ной смеси прибавляют 65 мл 0,2 н раствора едкого натра, который готовят растворением 0,£ГГ г двЮН в дистиллированной воде в мерной колбе емкость» 100 мл.
Ферментный препарат получает из печени крупного рогатого скота (овежую, однократно заморожеыну» н сохраняемую в дальнейшем в холодильнике печень можно использовать в течение 6 месяцев). Для приготовления ферментного раствора I г печени растирают в ступка о 9 мл буферного раствора, фильтрует через вату. К I мл полученной сыворотки прибавляют 4 мл буферного раствора и используют этот раствор для опрыскивания пластинок. Применяют свежеприговленный раствор.
Оонозной стандартный раствор базудина "А" - 100 мкг/мл, рабочий стандартный раствор ИБМ - I мкг/мл - готовят разбавлением основного раствора "Ан ( I мл раотвора “А" доводят в мерной колбе до IO0 мл ацетоном).
2.2.1. Проявляющий реагент; 10 ыг индокоилацетата растворяют в 6 мд этанола, прибавляют 6 мд дистиллированной воды, 2 мл раствора жале-зооиаеродиотого калия и 2 мл железистооннеродястого калия и хорошо перемешивают. Раствор готовят перед опрыскиванием.
2.2.2. Лекарственное растительное сырье
106
Трава астрагала шерстиотоцввткового,$С **2-533-72 Корень алтея неочищенный ГОСТ 6517-76 Корень ревеня £С **2-1910-82 Цветки ноготков лекарственных,ФС **2-1391-80 Плоды ииповника^ГОСТ I991*-76,продлен до 01.07.87 г*
Трава алтея лекарственного
2.3. Приборы и посуда
Компрессорная установка УК-40/260, ТУ 64-1-2749-73 ( для равномерного мелкодиоперстного опрыскивания пластинок)
Термостат ОШ-36
Аппарат для встряхивания марки АВУ-1^ТУ 64-1-24-51-72
Эксикатор, ГОСТ 6372-73
Ступка керамическая сЬ Ю см^ГОСТ 9147-74
Камера для хроматографирования}ГОСТ 10565-63
Стеклянные пластинки 9*12 см или хроматографические оластиики
"Силуфол"
Пульверизатор стеклянный^»ГОСТ 19391-81
Колбы конические плоскодонные на 250-500 ма^ГОСТ 10394-72
Колбы круглодонные на 250 мл со алнфом^ГОСТ 10394-72
Воронки делительные на 250-500 мл,ГОСТ 8613-76
Холодильник бытовой
Колбы мерные на 100 мл^ГОСТ 1770-74
Пробирки мерные на млифах на 5-10 ыл»Г0СТ 1770*74
Пипетки на I мл, 2 мл. 5 мл. 10 мл^ГОСТ 1770-74
Микроашриц на 10 нхл.ШН-Ю, ТУ 5К-2.633.024
2.4. Подготовка к определены»
2.4,1. Пластинки хроматографические
Стандартные хроматографические пластинки "Силуфол*, Хроматографические пластинка с тонким слоем силикагеля ИСК, скреп-
107
денным гипоом/
2.*.2. Отбор проб Лекарственное растительное сырье измельчают и отбирают методом квартования среднюю проб/ по 10,0 г,
2.5* Проведение определения Из лекарственного растительного сырья, представленного травой и цветками, базудин экстрагируют 150 мд 50^-ного водного ацетона, из корней алтея н семян мака масличного * 100 мл ацетона, аз корней ревеня и плодов шиповника - 100 мл гексана.
Из всех проб экстракцию проводят дважды на аппарате для встряли ^ вання в течение одного часа.
Трава астрагала шерстиотоцветкового и алтея лекарственного. Водно-ацетоновые экстракты объединяют, отфильтровывают в делительные воронки и подвергают очистке. С этой целью проводят реэкстракцию базудина гексаном по 50 мл трижды. Объединенные гексановые фракции сушат безводным сернокислым натрием, добавляют 2-3 г активированного угля марки 0У-А, перемешивают и через 30 минут отфильтровывают » круглодонные коАбы. Концентрируют экстракты под вакуумом при температуре 40°С до объема 0,5 мд, а затем на воздухе досуха. Остаток » колбе растворяют в ацетоне м количественно переносят в мерную пробирку 0 притертой пробкой. Обцнй объем экстракта в пробирке доводят до 10,0 мд. Закрывают пробкой и хорошо перемешивают.
Ноготки декаротвенные(цвоткн). Для проб ноготков проводят дополнительную очистку. Для этого сухой остаток после удаления гексана растворяют в 5 мл этилового спирта, добавляют равное количество
♦ Приготовление хроматографических пластинок производят в соответствии о инструкцией, изложенной в кы. М.А.Клисенко, Т.АЛебедева, З.Ф.Юрш>ва,рХаш1чесшШ анализ шлсрокодичеств ядохимикатов",#., лад. "Ивдйщша*1, 1972, о.293.
108
3%-ого раствора хлористого аммония и помещают в морозильную камеру на I час* Одновременно ставят для охлаждения смесь этилового спирта с 3%-нин раствором хлористого аммония в соотношении I:1. Раствор отфильтровывают в делительную воронку, промывают охлажденной смесью 2 раза по 10 мл и извлекают базудин из водно-спиртовой смеои 3 раза по 40 мл гекоана* Гексановый экстракт сушат б/в оульфатом натрия, концентрируют и далее поступают как описано выше.
Алтей лекарственный (корни), К объединенным ацетоновым экстрактам добавляют равное количество дистиллированной воды, перемешивают ы проводят реэкстракцию баэудина гексаном как указано выше для травы алтея.
Мак масличный ( немолотые семена)* Ацетоновые вытяжки из немолотых семян мака масличного как правило очистки не требуют* Йх концентрируют и доводят объем общего экстракта в мерной пробирке о притертой пробкой до 10,0 мл.
Ревень тангутский (корни), шиповник (плоды) . Гексановые экстракты концентрируют до объема 10,0 мл переносят в делительную воронку, приливают 50 мд диметилформамида, насыщенного гексаном и взбалтывают 2 мин. Гексановый слой отбрасывают* 3 большую делительную воронку переносят диметилформамидиый экстракт , приливают 250 нл воды, 15 мл насыщенного раствора хлористого натрия .перемешивают и извлекают базудин н-гексаном три раза по 50 мд. Объединенные гексановые экстракты сушат б/в сернокислым натрием, отгоняют растворитель и далее поступают как описано выше*
2*5.2. Хроматографирование в тонком слое с энзимным проявлением
G целью уменьшения краевого эффекта хроматографические пластинки с силикагелем КСК или "Снлуфол* предварительно разделяют на вертикальные полосы. Аликвотную часть экстракта пробы СЮ мкл) и стандартного раствора базудина (2-5 нг) наносят при помощи микрошприца на пдас-
109
ТМНКЙ.
Развитие хроматограммы производят в смеси н-гексана с ацетоном в объемном соотношении 4:1 для проб астрагала» ноготков, алтея и мака масличного, 9:1 - для шиповника. Для хроматографирования экстрактов ревеня предложены следующие системы подвижных растворителей: I - бензол, II - ацетон-гексан (1:4), Когда фронт растворителя поднимется на 10 см, пластинку вынимают из камеры и дают растворителя испариться. Для активации базудина в парах брома пластинку помещают на I минуту в эксикатор, насыщенный парами брома, Силуфольные пластинки активируют в течение 10 сек.
После удаления избытка брома с пластинки ( 60 мин) ее обрабатывают свежеприготовленным ферментным раствором и инкубируют в течение 60 мин в насыщенном водными парами термостате при температуре Э8°С ( для увлажнения ставят чашку Петри о водой).
После инкубации пластинки опрыскивают проявляющим реагентом и помещают в термостат при температуре 38°С. Базудин проявляется в течение 10 мин в виде белых пятен на голубом фоне,
базудина на пластинках о силикагелем KGK ж "Силуфол* в система ацетон-гексан (1:4) составляет соответственно 0,50 и 0,60, в системе ацетон-гексан (1:9) - 0,43 и 0,55 и в системе I- бензол, II--ацетон-гвксая(1:4) - 0,50 и 0,70.
2.5.3.Обработка результатов анализа Содержание базудиыа определяют путем сравнения площади пятен пробы и стандарта. Пропорциональная зависимость площади пятна от концентрации соблюдается в пределах 5 -50
^мг/кг)
Насчет содержания препарата в анализируемом объекте производят по формуле
по
А - содержание препарата в стандарте, мкг
2
й^ - площадь пятна стандарта, мм
о
~ площадь пятна пробы, мм ТЦ - объем экстракта, нанесенного на пластинк/, нкл ? - общий объем экстракта, мл Р - маоса пробы, взятой на анализ, г 3, Требования безопасности Соблюдается требования безопасности обычно ро&омоидуоыив для работы о химическими реактнвами»
44 Настоящие методические указания разработаны; Г.ЙДрамаренко, С.С,Горлановой (г Дубны Полтавской обл,, 7крайнская зональная опытная станция лекарственных растений Ш?)„
И.В.Письменная С г.Киев, ЩИЙГЙНТОКС)
5, Апробированы:
В Украинском НИН защиты растений (рАеа), ШИП. лекарственных раотений (г.Мооква)
