Стр. 1
 

11 страниц

304.00 ₽

Купить официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на свиней и устанавливает методы лабораторной диагностики африканской чумы

Введен впервые

Ограничение срока действия снято: Протокол № 5-94 МГС от 17.05.94 (ИУС № 11-94)

Оглавление

1 Методы отбора проб

2 Метод прямой иммунофлуоресценции

3 Метод выделения и идентификации вируса африканской чумы свиней

4 Метод постановки биологической пробы

5 Метод обнаружения вируса АЧС в реакции аутогемадсорбции

6 Метод непрямой иммунофлуоресценции

7 Метод иммуноферментного анализа

Показать даты введения Admin

Страница 1

ГОСТ 28573-90

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

СВИНЬИ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ

Издание официальное

БЗ 9 -2004


Нмоа

Сшцдаргинфори

Страница 2

УДК 636.4.001.4:006.354    Группа    С79

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

СВИНЬИ

Методы лабораторной диагностики африканской чумы

ГОСТ

28573-90

Pigs. Methods of laboratory diagnostics of african plague

MKC 65.020.30 ОКСТУ 9809

Дата ввеления 01.01.91

Настоящий стандарт распространяется на свиней и устанавливает методы лабораторной диагностики африканской чумы.

Стандарт предназначен для диагностирования заболевания свиней в ветеринарных лабораториях и ветеринарных научно-исследовательских учреждениях.

1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

1.1.    Для проведения исследований от вынужденно убитых больных и павших свиней берут пробы органов и тканей — лимфатических узлов (подчелюстной, прот&аьный и мезентериальный), селезенки, легкого, крови и костного мозга.

Пробы берут не позднее чем через 10 ч после убоя или гибели животных.

1.2.    Пробы органов и крови хранят и транспортируют в термосе при 4 *С—8 *С не более 24 ч после отбора. При более длительном хранении пробы замораживают.

2. МЕТОД ПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Сущность метода заключается в соединении специфических иммуноглобулинов африканской чумы свиней (АЧС), меченных флуоресцеиннзотиоцнанатом (ФИТЦ). со специфическим антигеном вируса АЧС в зараженных клетках и обнаружении комплекса «антиген-антитело» люминесцентной микроскопией.

2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Микроскоп люминесцентный.

Криостат.

Термостат.

Автоклав.

Холодильник бытовой.

Центрифуга лабораторная любого типа, обеспечивающая частоту вращения 50<Х) мин1.

Шприцы по МРТУ 46-23.

Банка цилиндрическая по ГОСТ 25336.

Стекла покровные по ГОСТ 6672.

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Пипетка пастеровская.

Калий фосфорнокислый однозамешенный по ГОСТ 4198.

Натрий фосфорнокислый двузамешепный по ГОСТ 11773.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Издание официальное    Перепечатка воспрещена

© Издательство стандартов, 1990 © Стандартинформ, 2005

Страница 3

С. 2 ГОСТ 28573-90

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 183(H).

Ацетон по ГОСТ 2603.

Эфир этиловый по ГОСТ 22300.

Парафин по ГОСТ 23683.

Глицерин для микроскопии по ГОСТ 6824.

Гепарин.

Раствор фосфатный буферный pH 7,2—7,4.

ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС.

ФИТЦ-иммуноглобулины классической чумы свиней (КЧС).

Вила дистиллированная.

2.2. Подготовка к анализу

2.2.1.    Приготовление фосфатного буферною раствора pH 7,2—7,4

Раствор А. В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют 1,78 г двузамещенного фосфорнокислого натрия.

Раствор Б. В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют 1.36 г однозамешенного фосфорнокислого калия.

К 850 см-' раствора А добавляют 250 см3 раствора Б. В 1 дм3 полученной смеси растворяют 8,5 г хлористого натрия. Полученный раствор стерилизуют в автоклаве в течение 2,5 ч при 2 атм.

2.2.2.    Приготовление буферного раствора глицерина

9 cmj глицерина смешивают с 1 см3 фосфатного буферного раствора.

2.2.3.    Приготовление тест-препаратов (срезов, мазков-отпечатков)

2.2.3.1.    От лимфатических узлов (подчелюстного, портального и мезентериального), селезенки и легких двух-трех свиней при помощи криостата берут пробы массой 5—10 г. Из проб готовят срезы толщиной 5 мк и помещают их на покровные стекла, предварительно обезжиренные смесью спирт-эфира в соотношении 1:1. Из каждого органа готовят четыре тест-препарата.

2.2.3.2.    Из лейкоцитов крови больных и интактных свиней готовят мазки-отпечатки. Для этого из краниальной полой вены берут 10—15 см3 крови в пробирку, содержащую гепарин 10—20 ЕД/см3. Кровь в пробирке осторожно перемешивают и выдерживают 30 мин при температуре 37 ’С. Пастеровской пипеткой отбирают плазму с лейкоцитами, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин с частотой вращения 1000 мин-1. Надосадочную жидкость удаляют, а лейкоциты осадка наносят на покровные стекла и готовят по четыре мазка-отпечатка на одну пробу крови.

2.2.3.3.    Тест-препараты высушивают при комнатной температуре в течение 15—20 мин, помешают в сосуд с ацетоном, выдерживают 10—15 мин при температуре минус 10 “С и подсушивают на воздухе при комнатной температуре до полного испарения ацетона.

2.3.    Проведение анализа

Подготовленные тест-препараты обрабатывают ФИТЦ-иммуноглобулинами АЧС и КЧС. Для этого на предметные стекла, помещенные во влажную камеру, наносят капли ФИТЦ-нмму-ноглобулинов и на них помешают тест-препараты срезом или мазком-отпечатком вниз. Камеру помещают в термостат и выдерживают 30 мин при температуре 37 'С. Затем тест-препараты промывают в фосфатном буферном растворе в течение 10 мин дважды со сменой раствора, ополаскивают в дистиллированной воде, подсушивают при комнатной температуре и помешают на капли раствора глицерина, нанесенные на предметные стекла. Края предметных стекол окантовывают расплавленным парафином. Тест-препараты просматривают под люминесцентным микроскопом.

2.4.    Оценка результатов

В клетках тест-препаратов органов и крови свиней, зараженных вирусом АЧС и обработанных ФИТЦ-нммуноглобулином АЧС, специфический антиген обнаруживают по свечению зеленого или желто-зеленого цвета в форме отдельных гранул (включений) в перинуклеарной зоне на фоне диффузного свечения зеленого или желто-зеленого цвета цитоплазмы клеток лимфоидного ряда или макрофагов.

В клетках тест-препаратов органов и крови свиней, не зараженных вирусом АЧС, обнаруживают тусклое свечение клеток серо-зеленого цвета.

При обработке ФИТЦ-иммуноглобулином КЧС тест-препаратов, приготовленных из проб органов и крови свиней, больных КЧС, обнаруживают ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток, часто расположенных группами.

Страница 4

ГОСТ 28573-90 С. 3

3. МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

Сушмость метода заключается в инокуляции культуры лейкоцитов или костного мозга свиньи исследуемого материала и обнаружении реакции геыадсорбции или вирусоспецнфического антигена в клетках прямой иммунофлуоресцеицией.

3.1.    Аппаратура, материалы и реактивы

Термостат, обеспечивающий температуру нагрева 37 ‘С.

Центрифуга лабораторная любого типа, обеспечивающая частоту вращения 5000 мин-'.

Шкаф сушильный.

Микроскоп биологический.

Микроскоп люминесцентный.

Холодильник бытовой.

Мешанка магнитная.

Пипетки градуированные вместимостью I. 2, 5 и 10 см3 по ГОСТ 29227.

Пробирки бактериологические.

Камера Горяева.

Стекла покровные по ГОСТ 6672.

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Цилиндры мерные вместимостью 50 и 100 см3 по ГОСТ 1770.

Банка цилиндрическая по ГОСТ 25336.

Ступка фарфоровая с пестиком.

Чашки Карреля.

Трубка силиконовая.

Иглы типа «Рекорд» 1А1-16-90-115.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 1S300.

Трепановый синий, раствор с массовой долей 0,5 %.

Монохлорамин Б технический по ГОСТ 14193. раствор с массовой долей 5 %.

Гидролизат лакгальбумина на растворе Эрла, раствор с массовой долей 0,1 % (ростовая среда): готовят в соответствии с указаниями изготовителя.

Пенициллин.

Стрептомицин.

Гепарин.

Раствор фосфатный буферный pH 7,2—7,4; готовят по п. 2.2.1.

Ацетон по ГОСТ 2603.

ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС.

Вода дистиллированная.

3.2.    Подготовка к анализу

3.2.1. Приготовление культуры лейкоцитов крови

Культуру лейкоцитов готовят из крови моровых поросят крупной белой породы живой массой 25—30 кг. Кровь берут в количестве 10—15 см3 из краниальной полой вены в стерильный цилиндр вместимостью 50—100 см', содержащий гепарин 10—20 ЕД/см\ выдерживают 40—60 мин при температуре 37 'С и отделяют верхний слой, состоящий из плазмы и лейкоцитов. Плазму с лейкоцитами тщательно перемешивают и определяют концентрацию клеток.

Подсчет клеток проводят в камере Горяева. Для этого к пробе клеточной суспензии добавляют равный объем раствора трепанового синего с массовой долей 0.5 %. Количество клеток определяют по всему полю камеры, имеющей 25 больших и 100 малых квадратов. Число клеток умножают на 2200. Полученный результат соответствует количеству клеток в 1 cmj суспензии.

Для посева используют суспензию, содержащую 4—6 млн лейкоцитов в 1 см3. Для получения средней посевной концентрации 5 млн/см3 к плазме с лейкоцитами добавляют необходимое количество питательной среды pH 7,2—7,4 следующего состава: 0,1 % гидролизата лакгальбумина на растворе Эрла, пенициллин 100—200 ЕД/см3, стрептомицин 100—200 мг/см3, гепарин 10—20 ЕД/см3.

Приготовленную суспензию клеток разливают по 9—10 см3 в чашки Карреля или по 2—3 см’ в пробирки с пластинками из покровных стекол, помешают в термостат при температуре 37 "С и выдерживают в течение 2—3 сут.

Для исследования используют культуру клеток с плотностью не менее 400—500 клеток в поле зрения микроскопа (увеличение 10 х 10) с отчетливой ростовой активностью. Клетки должны быть прозрачными, без зернистости, различной величины, без признаков дегенерации.

Страница 5

С. 4 ГОСТ 28573-90

3.2.2.    Приготовление культуры клеток костного мозга

Поросят обескровливают через сонную артерию или сердце с помощью полого ножа. Кровь собирают в стерильный сосуд и выдерживают при температуре 37 "С в течение 1—3 ч. Затем сыворотку отсасывают в стерильный флакон и осветляют центрифугированием при 2000—2500 в течение 30 мин. Сыворотку инактивируют при 56 ‘С в течение 30 мин.

После обескровливания у поросят удаляют кожный покров вместе с мышечной тканью в области бедренной кости, предварительно продезинфицировав этот участок йодированным спиртом, и отделенную бедренную кость разрезают на расстоянии 2 см от суставов. Извлекают костный мозг, помешают в каабу с магнитом, содержащую 0,1 % гндролизата лактальбумина на растворе Эрла. Содержимое колбы перемешивают на магнитной мешалке в течение 15 мин и центрифугируют при 2000—2500 мин-' в течение 10 мин. Осадок ресуспензируют ростовой средой и определяют количество клеток, как указано в п. 3.2.1. Суспензию клеток разбавляют ростовой средой до концентрации 4—6 млн/см* и разливают в чашки Карреля и в пробирки с пластинками из покровных стекол. К питательной среде, приготовленной по п. 3.2.1, добавляют сыворотку свиньи до концентрации 10 %.

3.2.3.    Приготовление суспензии органов

Пробы селезенки, легкого, лимфатических узлов (подчелюстного, мезентериального) в стерильных условиях очищают от соединительной и жировой тканей, делают навески массой 2—3 г, тщательно растирают каждую в отдельности в ступке со стерильным стеклянным песком и добавляют стерильный фосфатный буферный раствор до соотношения 1:10. Приготовленные суспензии подвергают 1—2-кратному замораживанию и оттаиванию и центрифугируют при 3000 мин-1 в течение 15—20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, доба&тяют пенициллин 500 ЕД/см3, стрептомицин 500 мг/см’, выдерживают 1 ч при температуре 37 “С и используют для инокуляции культуры клеток лейкоцитов или костного мозга.

Оставшийся после приготовления суспензий материал обезвреживают в растворе монохлорамина Б с массовой долей 5 % с последующей утилизацией после термической обработки.

3.3.    Проведение анализа

Культуру лейкоцитов или костного мозга, выращенных в чашках Карреля и в пробирках, инокулируют приготовленными суспензиями органов без удаления питательной среды. На каждую пробу берут по четыре чашки Карреля и 8—10 пробирок. В первые две чашки вносят по 1,0 см', в две другие чашки и в пробирки — по 0.1 см* суспензии и инкубируют при температуре 37 ’С в течение 5—7 сут.

Культуру клеток просматривают на наличие реакции гемадсорбции при малом увеличении микроскопа (10 х 10). Первый просмотр проводят через 15—18 ч после инокуляции. Перед просмотром чашки слегка встряхивают.

При отсутствии реакции гемадсорбции в течение 5—7 cvr проводят два пассажа на аналогичной культуре клеток. Параллельно культуру клеток, инокулированную в пробирках, обрабатывают методом прямой иммунофлуореспенции. Для этого пластинки извлекают из пробирок, высушивают, помешают в ацетон на 10 мин и обрабатывают ФИТЦ-иммуноглобулииом ЛЧС, как указано в п. 2.3.

3.4.    Оценка результатов

При наличии в исследуемом материале вируса ЛЧС наблюдают реакпню гемадсорбции, проявляющуюся в виде «розетки* эритроцитов на поверхности отдельных клеток. При легком встряхивании эритроциты остаются на клетках.

Результат выделения вируса ЛЧС считается положительным при наличии реакции гемадсорбции в инокулированной культуре клеток и при положительной реакции методом прямой иммуно-флуоресценции.

Результат выделения вируса ЛЧС считается отрицательным при отсутствии реакции гемадсорбции в инокулированной культуре клеток в течение трех пассажей и отрицательной реакции методом прямой иммунофлуоресценцни.

4. МЕТОД ПОСТАНОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ

Сущность метода заключается в воспроизведении заболевания африканской чумой при введении восприимчивым и иммунным к вирусу классической чумы свиньям суспензии органов и крови, взятых от вынужденно убитых больных и павших свиней.

4.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Термостат, обеспечивающий температуру нагрева 37 "С.

Страница 6

ГОСТ 28573-90 С. 5

Центрифуга лабораторная любого типа, обеспечивающая частоту' вращения 5000 мин1.

Автоклав.

Термометры ветеринарные.

Пипетки градуированные вместимостью 5 и 10 см' по ГОСТ 29227.

Ступка фарфоровая с пестиком.

Поросята живой массой 25—30 кг. непривитые против КЧС. 6 гол.

Раствор фосфатный буферный pH 7,2—7,4 стерильный; готовят по п. 2.2.1.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 18300.

Пенициллин.

Стрептомицин.

Вирус классической чумы свиней (КЧС), эпизоотический вирулентный с активностью I0*0 ЛДзо/см*.

Вирусвакцина культуральная из штамма «К» ЛК-ВНИИВВиМ или ВГНКИ с активностью 105 0 И мДм/см3.

4.2. Подготовка к аиализу

4.2.1.    Приготовление суспензии органов — по п. 3.2.3.

4.2.2.    Подготовка животных

Четырем поросятам вводят культуральную вирусвакцину из штамма «К» ЛК-ВНИИВВиМ или ВГНКИ в разведении 1:100 внутримышечно. У вакцинированных и невакцинированных поросят ежедневно измеряют температуру. Через 15—20 сут после вакцинации при отсутствии клинических признаков болезни поросят используют для постановки биопробы.

4.3.    Проведение анализа

Двум вакцинированным и двум невакцинированным поросятам, содержащимся в одном боксе, вводят внутримышечно (в области внутренней поверхности бедра) по 2 см1 смеси суспензий органов вынужденно убитых больных и павших свиней. Двум вакцинированным поросятам, содержащимся в другом боксе, вводят эпизоотический вирулентный вирус КЧС в дозе 10*0 ЛД}0/см\ За животными ведут наблюдение в течение 15 сут с ежедневным измерением температуры тела. В конце контрольного периода животных забивают и сравнивают результаты патолого-анатомических и гистологических исследований павших и убитых животных с клиническими признаками АЧС. Параллельно пробы органов исследуют методами прямой иммунофлуоресценции, выделения и идентификации вируса.

4.4.    Оценка результатов

Биопробу считают положительной, если у свиней, инокулированных суспензией органов больных африканской чумой свиней, установлены признаки болезни или наблюдается гибель.

При обнаружении клинических признаков болезни или гибели только невакцинированных свиней, проводят исследование на подтверждение классической чумы свиней методом прямой иммунофлуоресценции с применением ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС.

5. МЕТОД ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА АЧС В РЕАКЦИИ АУТОГЕМАДСОРБЦИИ

Сущность метода заключается в выявлении гемадсорбирующнх клеток, сформированных в организме больного АЧС животного.

5.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Термостат.

Микроскоп световой инвертированный или обычный.

Шприцы вместимостью 10—20 см3 по МРТУ 46—23.

Иглы инъекционные типа «Рекорд* IAI 16-20-115 или 15150.

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Стекла покровные по ГОСТ 6672.

Пипетки мерные по ГОСТ 29227.

Флаконы пенициллиновые.

Панели пластиковые 96-луночные по ТУ 92-2-428.

Раствор фосфатный буферный pH 7,2—7,4: готовят по п. 2.2.1.

Гепарин.

Пенициллин.

Стрептомицин.

Страница 7

С. 6 ГОСТ 28573-90

5.2.    Подготовка к анализу

Из краниальной полой, ушной или хвостовой вены свиней берут 10—15 см3 крови в пробирки, содержащие гепарин в количестве 10—20 ЕД/см1.

5.3.    Проведение анализа

Пробирки с отобранными пробами крови помещают в вертикальном положении в термостат при температуре 37 "С. Пипеткой отбирают верхний слой плазмы, содержащей лейкоциты с эритроцитами. Отобранную плазму крови вносят по 50—100 мм1 в 2—4 лунки панели, по 1—3 см3 в 2—4 пробирки и готовят двукратные разведения суспензии клеток с 1:2 до 1:128. Для разведения используют стерильный физиологический раствор, содержащий пенициллин 100—200 ЕД/см’. стрептомицин 100— 200 мг/см3 и гепарин 10—15 ЕД/см3.

Панели с приготоатенными разведениями лейкоцитарной фракции крови просматривают под инвертированным, пробирки — под обычным микроскопом.

5.4.    Оценка результатов

При положительной реакции обнаруживают гемадсорбцню. проявляющуюся в виде -розетки» эритроцитов на поверхности отдельных клеток. При отсутствии «розеток* плазму с клетками рассматривают как культуру лейкоцитов. Для этого панели с культурой клеток продолжают инкубировать при температуре 37 *С и результаты оценивают по п. 3.4.

При отсутствии реакции гемадсорбиии препараты высушивают, обрабатывают ацетоном и ставят реакцию прямой иммунофлуоресценции.

6. МЕТОД НЕПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Сущность метода заключается в соединении иммуноглобулинов ЛЧС исследуемой сыворотки свиней с вирусоспецифическим антигеном тест-препаратов ЛЧС и обнаружении комплекса «антиген-антитело» обработкой антисвиными ФИТЦ-нммуноглобулннами и люминесцентной микроскопией.

6.1.    Аппаратура, материалы и реактивы

Микроскоп люминесцентный.

Термостат.

Центрифуга лабораторная любого типа, обеспечивающая частоту вращения 5000 мин-1.

Холодильник бытовой.

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Стекла покровные по ГОСТ 6672.

Раствор фосфатный буферный pH 7,2—7.4; готовят по п. 2.2.1.

Раствор глицерина буферный: готовят по п. 2.2.2.

Парафин по ГОСТ 23683.

Тест-препараты специфические ЛЧС и отрицательные; готовят следующим образом: специфические ЛЧС тест-препараты готовят заражением перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15), выращенной на покровных стеклах в пробирках, вирусом ЛЧС, высушиванием и обработкой ацетоном. Отрицательные тест-препараты готовят аналогично, но не заражая вирусом ЛЧС. Хранят в герметической емкости при температуре минус 20 ‘С.

Ф И Т Ц - и м м Vi югл обул и и ы антисвиные, представляющие собой иммуноглобулины кролика или осла, иммунизированных иммуноглобулинами сыворотки свиньи, и меченные ФИТЦ.

Сыворотки свиньи отрицательные и положительные к вирусу ЛЧС.

6.2.    Подготовка к анализу

6.2.1.    Пробы крови — по п. 5.2.

6.2.2.    Суспензии органов — по п. 3.2.3.

6.3. Проведение анализа

Капли положительных и отрицательных к вирусу ЛЧС сывороток и суспензий органов, разведенные в фосфатном буферном растворе 1:20. наносят на предметные стекла и добавляют специфические ЛЧС и отрицательные тест-препараты. Предметные стекла помещают в термостат и выдерживают 30 мин при температуре 37 *С. Затем тест-препараты промывают в фосфатном буферном растворе в течение 10 мин дважды со сменой раствора, ополаскивают дистиллирован ной водой и подсушивают при комнатной температуре. Далее тест-препараты обрабатывают антисвиными ФИТЦ-иммуноглобулииамн, как указано в п. 2.3. и просматривают пол люминесцентным микроскопом.

Страница 8

ГОСТ 28573-90 С. 7

6.4. Оценка результатов

При положительной реакции п клетках специфических тест-препаратов АЧС, обработанных исследуемыми сыворотками и суспензиями органов, обнаруживают специфический антиген вируса АЧС.

При отрицательной реакции в указанных тест-препаратах обнаруживают тусклое свечение клеток серо-зеленого цвета.

7. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

Сущность метода заключается во взаимодействии специфического антигена АЧС. фиксированного на твердой фазе с сыворотками АЧС и пероксндазным антисвиным конъюгатом, и регистрации комплекса по остаточной ферментативной активности с помощью субстрата.

7.1.    Аппаратура, материалы и реактивы

Термостат.

Холодильник бытовой.

С пектрофотометр.

Панели пластиковые %-луночные по ТУ 92-2-428.

Микропипетка многоканальная регулируемая вместимостью 50 — 200 мм3.

Микропипетка одноканальная регулируемая вместимостью 50—200 мм3.

Натрия карбонат по ГОСТ 83.

Перекись водорода по ГОСТ 10929. раствор с массовой долей 3 %; готовят следующим образом: к 10 см3 дистиллированной воды добавляют 1 см3 раствора перекиси водорода с массовой долей 33 %.

Натрия бикарбонат по ГОСТ 4201.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный, 12-водный по ГОСТ 4172, раствор концентрации c(Na,HPO. 12Н,0) = 0,2 моль/дм3, готовят следующим образом: 2,Н4 г двузамещенного форсфор-нокислого натрия 12-водного растворяют в 100 см3 дистиллированной воды.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Натрий азид.

Калий хлористый по ГОСТ 4234.

Калий фосфорнокислый однозамешенный по ГОСТ 4198.

Кислота лимонная по ГОСТ 3652, раствор концентрации 0,1 моль/дм3; готовят следующим образом: 1.92 г лимонной кислоты растворяют в 100 см3 дистиллированной воды.

Кислота серная по ГОСТ 4204. раствор концентрации с 3.

Твин-20.

Раствор буферный карбонатно-бикарбонатный pH 9,5 для сенсибилизации пластин концентрации 0.05 моль/дм3: готовят следующим образом: 0,795 г карбоната натрия. 0,100 г азида натрия и 1.465 г бикарбоната натрия растворяют в 500 см3 бидистиллированной воды.

Раствор фосфатно-буферный (отмывочный); готовят следующим образом: 16,0 г хлористого натрия, 0.400 г однозамешенного фосфорнокислого калия, 5.8 г двузамещенного фосфорнокислого 12-водного натрия. 0,2 г хлористого калия и 1,6 см3 твин-20 растворяют в 2 дм' бидистиллированной воды.

Раствор ортофенилендиамнна (субстрат); готовят следующим образом: 40 мг ортофенилендиамина растворяют в 100 см3 буферного фосфат но-нитратного раствора pH 4.9. Перед использованием к раствору добаатяют 1,4 см3 раствора перекиси водорода с массовой долей 3 %.

Альбумин яичный лиофилизнрованный по ТУ 6-09-4477, раствор с массовой долей 1 %; готовят следующим образом: 1 г яичного альбумина растворяют в 100 см3 фосфатно-буферного раствора.

Альбумин бычий сывороточный лиофилизнрованный по ТУ 09-10-342.

Конъюгат нммунопероксидазный антисвиной.

Антиген специфический АЧС.

Антиген отрицательный.

Сыворотка специфическая АЧС.

Сыворотка отрицательная свиная.

Вода дистиллированная.

Вода б иди стилл и ро ваш <ая.

7.2.    Подготовка к анализу

Специфический АЧС и отрицательный антигены разводят в буферном карбонатно-бнкарбо-

Страница 9

С. 8 ГОСТ 28573-90

натном растворе концентрации 0.05 моль/дм3 в соответствии с дозой, указанной на препарате, и вносят в лунки панелей по 200 мм5 в лунку. Панели выдерживают 18—20 ч при температуре 18 *С—20 *С (сенсибилизация). После сенсибилизации панели промывают фосфатно-буферным раствором трижды, удаляют отмывочный раствор, в лунки вносят по 200 мм3 раствора яичного альбумина с массовой долей 1 % и выдерживают 15 мин при температуре 18 *С—20 *С. Панели промывают фосфатно-буферным раствором трижды и используют для постановки реакции.

7.3.    Проведение анализа

В лунки панелей со специфическими АЧС и отрицательными антигенами вносят по 200 мм* исследуемых сывороток больных и подозреваемых в заболевании свиней, взятых в пятикратном разведении. Разведения сывороток готовят на фосфатно-буферном растворе.

После 2 ч инкубации при температуре 37 'С панели промывают и в лунки вносят по 200 мм5 пероксидазного антисвиного конъюгата, разведенного на фосфатно-буферном растворе с яичным альбумином с массовой долей 1 %, в рабочем разведении, указанном на ампуле препарат. В лунку 1А конъюгат не вносят (контрольная лунка). После 1 ч инкубации конъюгат удаляют: панели промывают, как указано в п. 7.2, и в каждую лунку вносят по 200 мм* раствора субстрата. Когда раствор субстрата в лунках начинает окрашиваться (примерно через 20 мин), его фотометрнруют на спектрофотометре при длине волны 495 нм. Язя визуальной оценки реакцию останавливают при помощи раствора серной кислоты концентрации cC/2H2S04) = 0,2 моль/дм3, внося в каждую лунку по 250 мм’.

7.4.    Оценка результатов

При визуальной оценке результаты реакции учитывают по интенсивности окрашивания субстрата. В лунках со специфической сывороткой и специфическим антигеном должно быть интенсивное желтое или желто-коричлевой окрашивание субстрата.

В лунках со специфической сывороткой и нормальным антигеном, отрицательной сыворотки со специфическим и отрицательным антигенами окрашивания не должно быть.

При оценке результатов на спектрофотометре реакция считается положительной, если отношение положительных и отрицательных контролей составляет 2,1 и более раза. Исследуемые сыворотки считаются положительными с разведениями 1:125 и выше. Сыворотки, показывающие положительную реакцию в разведениях 1:5 и 1:25, считаются сомнительными.

Страница 10

ГОСТ 28573-90 С. 9

И НФОР МАЦИОН Н Ы Е ДАНН ЫЕ

1.    РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всесоюзным научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии

2.    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР но управлению качеством продукции и стандартам от 12.06.90 № 1511

3.    В стандарт введен СГ СЭВ 6539—88

4.    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД. на который лана ссылка

Номер пункта

ГОСТ 83-79

7.1

ГОСТ 1770-74

3.1

ГОСТ 2603-79

2.1: 3.1

ГОСТ 3652-69

7.1

ГОСТ 4172-76

7.1

ГОСТ 4198-75

2.1: 7.1

ГОСТ 4201-79

7.1

ГОСТ 4204-77

7.1

ГОСТ 4233-77

2.1: 7.1

ГОСТ 4234-77

7.1

ГОСТ 6672-75

2.1; 3.1; 5.1; 6.1

ГОСТ 6824-%

2.1

ГОСТ 9284-75

2.1; 3.1; 5.1; 6.1

ГОСТ 10929-76

7.1

ГОСТ 11773-76

2.1

ГОСТ 14193-78

3.1

ГОСТ 18300-87

2.1; 3.1; 4.1

ГОСТ 22300-76

2.1

ГОСТ 23683-89

2.1: 6.1

ГОСТ 25336-82

2.1; 3.1

ГОСТ 29227-91

3.1: 4.1: 5.1

ТУ 6-09-4477-77

7.1

ТУ 09-10-342-75

7.1

ТУ 92-2-428-83

5.1: 7.1

МРТУ 46-23-61

2.1; 5.1

6.    Ограничение срока действия снято по протоколу № 5—94 Межгосударственного совета по стандартизации. метрологии и сертификации (ИУС 11-12—94)

7.    ПЕРЕИЗДАНИЕ. Июнь 2005 г.

Страница 11

Редактор О.В. Гслемсева Технический редиктор В.II Прусакоаа Корректор В.Н. Варениова Компьютерная верстка А.II. Золотаревой

Слано и набор 30.06.2005. Подписано и печать 2S.07.2005. Формат 60х84‘/х- Бумага офсетная.    Гарнм тура Таймс.

Печать офсетная. Уел. печ. л. 1.40. Уч.-Hva. л. 1,03. Тираж 50 эк>. Зак. 474. С 1554.

ФГУП «Станлартинформ». I2399S Москва. Гранатный пер.. 4. www.goitinro.ruinfoOjovlinfo.ru Набрано но ФГУП •Станларшнформ» на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП •Станлартинфарм* — тип. “Московский печатник”. 105062 Москва. Лялин пер.. 6.