Стр. 1
 

7 страниц

244.00 ₽

Купить официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia

Введен впервые. Переиздание. Апрель 2010 г.

Ограничение срока действия снято: Протокол № 5-94 МГС от 17.05.94 (ИУС № 11-94)

Оглавление

1 Отбор и подготовка проб

2 Аппаратура, материалы и реактивы

3 Подготовка к испытанию

4 Проведение испытания

5 Обработка результатов

Показать даты введения Admin

Страница 1

ГОСТ 28560-90

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДОВ PROTEUS, MORGAN ELLA, PROVIDENCIA

Издание официальное

Страница 2

УДК 663/.664.«01.4:006.354    Группа 1109

МЕЖГОСУДАРСТВЕНН Ы Й С Т А Н Д А Р Т

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод выявления бактерий ролов Proteus, Morganella. Providencia

ГОСТ

28560-90

Food products. Method for dclcction of baclcria of Proteus. Morganella. Providencia genera

MKC 07.100.30 ОКСТУ 9109

Дата введения 01.07.91

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод пыяпления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia.

Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведений в жидкую селективную среду, культивировании посевов при (36 ± 1) 1С в течение 48 ч, последующем пересеве выросших культур на плотные дифференциально-диагностические среды, культивировании посевов при (36 ± П'С в течение 48 ч, выделении характерных колоний и подтверждении с помощью биохимических тестов их принадлежности к бактериям родов Proteus и (или) Morganella и (или) Providencia или к видам Proteus vulgaris или Proteus mirabilLs.

1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

Отбор проб - по ГОСТ 26668, подготовка к испытанию - по ГОСТ 26669.

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 241044, с наибольшим пределом взвешивания до 20<) г и пределом допускаемой погрешности ± 2 мг (для взвешивания реактивов);

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104. с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности ± 10 мг (для взвешивания продукта):

микроскоп световой биологический или импортный с аналогичными техническими характеристиками;

термостат с диапазоном рабочих температу р от 28 до 55 *С. позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью ±1 ‘С; холодильник бытовой; стерилизатор горячим воздухом; адоннт; мальтоза;

метил бутанол (амиловый спирт); мочевина;

* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.

77

1

© Издательство стандартов, 1990 С» СТАНДАРТИНФОРМ, 2010

Страница 3

С. 2 ГОСТ 28560-90

нейтральный красный: натрия дезоксихолат; натрия тиосульфат (Na,S,0j*5H,0); натрий аммония фосфат;

полимиксин В сульфат во флаконах по 25 мг (250 ООО ЕД и по 50 мг (500 000 ЕД); полимиксин М сульфат во флаконах по 500 000 ЕД;

L - или DL-фенилаланин;

L - или DL-орнитин; феноловый красный;

желчь сухая или желчь натуральная крупного рогатого скота;

железа (III) цитрат;

железо хлорное (FeCI3-6H ,0)

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

3.1.    Приготовление растворов

3.1.1.    Спиртовой раствор массовой концентрацией бромтимолового синего 16 г/дм': 1,6 г бромти-молового синего переносят в мерную колбу вместимостью 100 см' и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96 %. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.1.2.    Раствор массовой концентрацией мочевины 500 г/дм!: 50 г мочевины переносят в мерную колбу вместимостью 100 см5, растворяют в дистиллированной воде, раствор доливают до метки.

3.1.3.    Щелочной раствор фенолового красного массовой концентрацией 16 г/дм3: 1,6 г фенолового красного растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см ' в растворе гидроксида натрия массовой концентрацией 100 г/дм'. Раствор долина ют раствором гидроксида натрия до метки.

3.1.4.    Раствор хлорного железа массовой концентрацией 100 г/дм’: 16,6 г (FeC 1, 6Н,0) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см\ растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.5.    Раствор гидроксида натрия массовой концентрацией 100 г/дм’: 10 г гидроксида натрия переносят в мерную колбу вместимостью 100 см', растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.6.    Раствор кристаллического фиолетового массовой концентрацией I г/дм’: 0.1 г кристаллического фиолетового переносят в мерную колбу вместимостью 100 см’, растворяют о дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.7.    Раствор для среды агара-деюксихолат-цитрат лактозного: 17,0 г натрия лимоннокислого. 1,0 г натрия тиосульфата. 2,0 г железа (III) цитрата помешают в мерную колбу вместимостью 100 см', растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки и выдерживают на водяной бане при (60 ± I) “С в течение 1 ч. Раствор хранят при комнатной температуре не более 3 мес.

3.1.8.    Раствор дезоксихолата натрия массовой концентрацией 100 г/дм’: 10 г дезоксихолата натрия переносят в мерную колбу вместимостью 100 см ’, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки и выдерживают на водяной бане при (60 ± I) ‘С в течение I ч. Раствор хранят при комнатной температуре не более 6 мес.

3.1.9.    Растворы полимиксин В сульфата или полимиксин М сульфата готовят непосредственно перед использованием, для этого во флакон со стерильным антибиотиком вносят 5 или 10 см' стерильной дистиллированной воды.

3.1.10.    Реактивы для определения индола:

Реактив Ковача: 5.0 г п арад и мет ил а м и нобе 11 зал ьде гид а растворяют в 75 см5 метил бутанола и добавляют 25 см’ концентрированной соляной кислоты (р = 1,18—1,19 г/см5).

Реактив Эрлиха: 4,0 г парадиметиламннобензальдегида растворяют в 380 см' этилового спирта с массовой долей 96 % и добаачяют 80 см1 концентрированной соляной кислоты (р = 1,18 — 1,19 г/см'). Реактивы хранят в сосудах из темного стекла при температуре (4 ± 2) *С не более 1 мес.

3.1.11.    Вазелиновое масло готовят по ГОСТ 10444.1.

3.1.12.    Спиртовой раствор массовой концентрацией бромкрезолового пурпурного 10 г/дм3: 1 г бромкрезолового пурпурного переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96 %. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.2. Приготовление питательных сред

3.2.1. Агар мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.

78

Страница 4

ГОСТ 28560-90 С. 3

3.2.2.    Бульон мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.3.    Среда жидкая селективная. Основа среды: к I дм5 мясо-пептонного бульона по п. 3.2.2 добавляют 1,0 г маннита, 50,0 см' натуральной бычьей желчи или эквивалентное количество сухой желчи, 0,8 г калия фосфорнокислого двузамешенного, 2,0 см3 раствора кристаллического фиолетового, приготовленного по п. 3.1.6, 2,0 см3 спиртового раствора бромтимолового синего, приготовленного по п. 3.1.1. Устанаатнвают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (6,9 ± 0,1) при 25 'С. Стерилизуют текучим паром при 100 'С в течение 15 мин.

Для приготовления среды к основе добаа1яют асептически 10.0 см! раствора мочевины, приготовленного по п. 3.1.2, и 100 000 ЕД полимнкснна В сульфата или 120 000 ЕД полимикснна М сульфата. Среду разливают в стерильные пробирки по 5 см3. Хранят при (4 ± 2) "С не более 7 сут. Готовая среда прозрачная, желто-бурого цвета.

3.2.4.    Агар дезоксихолат-цнтратлактозный по Leifson модификация Hynes.

Основа среды: в 1 дм'кипящей мясной воды, приготовленной по ГОСТ 10444.1. растворяют

5.0    г пептона, 10,0 г лактозы, 22,5 г агара, охлаждают до (45—50) *С, устанавливают pH таким образом, чтобы при 25 *С он составлял (7.4 ± 0,1). Прибавляют 0,03 г нейтрального красного, разливают в мерные колбы, стерилизуют при (115 ± 1) 'С в течение 20 мин. Хранят при (4 ± 2) *С не более 7 сут.

Допускается использовать вместо 1 дм3 мясной воды и 5.0 г пептона 1 дм3 мясо-пептонного бульона, приготовленного по п. 3.2.2.

Для приготовления питательной среды к расплавленной и охлажденной до 45—50 ’С основе прибавляют из расчета на 100 см3 основы 5 см’ раствора солей, приготовленных по п. 3.1.7, и 5 см3 раствора дезокенхолата натрия, приготовленного по п. 3.1.8. Среду перемешивают и разливают по стерильным чашкам Петри по ГОСТ 26670. Среду используют в день ее приготовления.

3.2.5.    Агар тройной сахарный с цитратом железа: в 1 дм3 мясо-пептонного бульона по п. 3.2.2 растворяют при нагревании 15 см3 дрожжевого экстракта. 10,0 г пептона, 10,0 г лактозы. 10,0 г сахарозы, 1.0 г глюкозы. 0.3 г железа (111) цитрата, 0.3 г натрия тиосульфата, 0,024 г фенолового красного, 15,0 г агара. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 ‘С (7.4 ±0,1). Разливают в пробирки и стерилизуют при (121 ± 1)‘С в течение 10 мин. дают застыть в наклонном положении, чтобы максимальная высота столбика составляла 2,5 см. Среда имеет коричнево-красную окраску. Хранят при комнатной температуре не более 7 сут.

3.2.6.    Среда для расщепления фенилаланина: 15 см3 дрожжевого экстракта, 2.0 г Ш.-фе!шпалами на или 1,0 г /.-фенилаланина, 1.0 г натрия фосфорнокислого двузамешенного. 5,0 г натрия хлорида, 12,0 гагара растворяют в I дм’ кипящей дистиллированной воды. По 5 см3 среды разливают в пробирки, стерилизуют при (121 ± 1)*С 10 мин, дают застыть в наклонном положении. Среду хранят при (4 ± 2) ‘С не более 7 сут.

3.2.7.    Агар с цитратом: 0,2 г магния сульфата. 1,0 г одно заме шейного фосфорнокислого аммония,

1.0    г натрия аммония фосфата, 2,0 г трехосновного натрия лимоннокислого, 5.0 г натрия хлорида, 0.08 г бромтимолового синего, 15.0 г агара растворяют в 1 дм3 кипящей дистиллированной воды. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составил при 25 'С (7,0 ± 0.1). Стерилизуют при (121 ± 1) *С в течение 15 мин и дают застыть в пробирках в наклонном положении. Среда имеет зелену ю окраску, ее хранят при комнатной температу ре не более 7 сут.

3.2.8.    Агар дифференциально-диагностический: к 1 дм1 расплавленного мясо-пептонного агара по и. 3.2.1 добавляют 15,0 см3 дрожжевого экстракта, 10,0 г маннита, 10,0 г мальтозы. 80,0 см! натуральной бычьей желчи или эквивалентное количество сухой желчи, 2,0 г железа (111) цитрата, 0.5 г натрия тиосульфата, 0,5 см - раствора кристаллического фиолетового, приготовленного по п. 3.1.6, 2.0 см3 щелочного раствора фенолового красного, приготовленного по п. 3.1.3. раствор антибиотика, приготовленного по п. 3.1.9 и содержащего 120 000 ЕД полнмиксина М сульфата или 100 000 ЕД полимик-син В сульфата. Среду стерилизуют текучим паром (при 100 *С) в течение 15 мин и рапивают по ГОСТ 26670 после охлаждения по стерильным чашкам Петри. Среду хранят при (4 ± 2) *С не более 7 сут. Готовая среда оранжево-красного цвета.

3.2.9.    Триптон-триптофановая среда (Ljutov): 10,0 г триптона или пептона, 5,0 г натрия хлорида.

1.0    г £>/.-триптофана или 0,5 г /.-триптофана растворяют в 1 дм5 кипящей дистиллированной воды и фильтруют, устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял при 25 *С (7,5 ±0.1). Среду разливают по 5 см3 в пробирки, стерилизуют при (121 ± 1) *С в течение 15 мин. Среду используют в день приготовления.

79

Страница 5

С. 4 ГОСТ 28560-90

3.2.10. Среда для определения декарбоксилазы орнитина:

в I дм3 дистиллированной воды растворяют при нагревании 5,0 г А-орнитнна или 10.0 г Ш.-орнитнна. 15,0 см* дрожжевого экстракта, 1.0 г глюкозы. 1.2 см' раствора бром кре зол ового пурпурного, приготовленного по п. 3.1.12. Устанаативают pH таким образом, чтобы после стерилизации он состаапял при 25‘С (6.8 ± 0,1). Среду разливают в пробирки по 5 см1 и стерилизуют при (121 ± 1) ‘С в течение 10 мин. Хранят при (4 ± 2) *С не более 7 сут. Готовая среда светло-фиолетового цвета.

4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

4.1.    Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так. чтобы можно было определить предполагаемое минимальное количество продукта, содержащее бактерии родов Proteus и (или) Morganella, и (или) Providencia или видов Proteus vulgaris или Proteus mirabilis.

4.2.    Из продукта и (или) соответствующих разведений высевают по 1,0 см' в жидкую селективную среду по п. 3.2.3. Посевы инкубируют при (36 ± 1) *С в течение 48 ч.

4.3.    Положительными считают пробирки, в которых наблюдается помутнение среды. При росте бактерий, расщепляющих мочевину, наблюдается изменение цвета среды в синий. Отсутствие изменения цвета среды не является показателем отсутствия роста выяатяемых бактерий.

4.4.    Для подтверждения присутствия бактерий родов Proteus и (или) Morganella. и (или) Providencia или видов Proteus vulgaris или Proteus mirabilis из всех пробирок, в которых наблюдается помутнение среды, делают пересевы на одну из дифференциально-диагностических плотных сред, приготовленных по п. 3.2.4 или по п. 3.2.8, таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний.

Посевы инкубируют при (36 ± 1) *С в течение 48 ч.

4.5.    На дифференциально-диагностических плотных средах бактерии образуют колонии круглой формы диаметром 1 —3 мм. Бактерии рода Proteus обладают свойством роения (ползучим ростом).

4.6.    Из всех чашек с характерным ростом выбирают не менее 5 колоний для выделения чистых культур и дальнейшего изучения.

Для получения чистых культур используют скощенный в пробирке мясо-пептонный агар по п. 3.2.1 или мясо-пептонный бульон по п. 3.2.2. Посевы инкубируют при (36 ± I) С в течение 24 ч.

4.7.    Биохимическое подтверждение принадлежности выделенных микроорганизмов к бактериям родов Proteus и (или) Morganella, и (или) Providencia.

4.7.1.    Для определения наличия дезаминазы фенилаланина из 24-часовой культуры по п. 4.6 делают высев штрихами на поверхность скошенного в пробирке агара, притогоапенного по п. 3.2.6. и культивируют при (36 ± 1) *С в течение 48 ч, после этого на поверхность агара пипеткой наносят 3—5 капель раствора хлорного железа, приготовленного по п. 3.1.4. При этом появление интенсивной зеленой окраски среды свидетельствует о положительной реакции. При отрицательной реакции цвет среды не меняется.

Бактерии родов Proteus. Morganella. Providencia дают положительную реакцию.

4.7.2.    Для определения способности образовывать сероводород культуры по п. 4.6 высевают методом укола в столбик и штрихами по поверхности агаризованной среды, приготовленной по п. 3.2.5.

Посевы инкубируют при (36 ± 1) “С в течение 48 ч. При образовании сероводорода столбик среды чернеет. Бактерии рода Proteus образуют сероводород, при этом в столбике среды пояапяется газ, что указывает на ферментацию глюкозы с образованием кислоты и газа.

Допускается инкубирование посевов при отсутствии сероводорода через 48 ч продолжать до 4 сут. так как P.myxofaciens может образовывать сероводород на 3-и - 4-е сутки. Бактерии рода Morganella и Providencia сероводорода не образуют.

4.7.3.    Для определения способности утилизировать цитрат культуры, не образующие сероводород по п. 4.7.2. пересевают на поверхность скошенного агара, приготоатенного по п. 3.2.7. Посевы инкубируют при (36 ± 1) "С в течение 48 ч. Окрашивание среды в синий цвет - положительная реакция, отсутствие изменения— отрицательная реакция.

Бактерии рода Providencia утилизируют нитрат, бактерии рода Morganella не утилизируют цитрат.

S0

Страница 6

ГОСТ 28560-90 С. 5

4.8. Для дифференцирования видов P.vulgaris и P.mirabilis у культур, образующих сероводород по п. 4.7.2. проводят определение наличия декарбоксилазы орпитина и способности образовывать индол.

4.8.1.    Для определения способности образовывать индол выделенные культуры высевают в триптон-триптофановую среду, приготовленную по п. 3.2.9. Посевы инкубируют при (36 ± I) *С в течение 48 ч. После инкубирования добавляют 1 см’ реактива Ковача или Эрлиха, приготовленных по п. 3.1.10. Темно-красное кольцо свидетельствует о положительной реакции.

P.vulgaris образует индол. P.mirabilis и P.myxofaciens индола не образуют.

4.8.2.    Для определения наличия декарбоксилазы орннтина выделенные культуры высевают в среду, приготовленную по п. 3.2.10. Посевы инкубируют при (36 ± I) *С в течение 48 ч. Положительной реакцией считают помутнение среды и изменение ее цвета в фиолетовый.

P.mirabilis дает положительную реакцию, P.vulgaris P.myxofaciens - отрицательную.

5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1.    Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

5.2.    Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, то их относят к бактериям родов Proteus, Мorganella. Providencia.

5.2.1.    Результаты испытания записывают следующим образом: фенилдезаминирующие бактерии родов Proteus. Morganella, Providencia обнаружены или не обнаружены.

5.3.    Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин и образующие сероводород, то их относят к бактериям рода Proteus.

Микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, не образующие сероводород, утилизирующие цитрат, относят к бактериям рода Providencia.

Микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, не образующие сероводород, не утилизирующие цитрат, относят к бактериям рода Morganella.

5.3.1.    Результаты испытания записывают следующим образом: бактерии родов Proteus и (или) Morganella и (или) Providencia обнаружены или не обнаружены.

5.4.    Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, образующие сероводород и индол, не декарбоксилизирующие орнн-тин. то их относят к бактериям вида P.vulgaris.

Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, образующие сероводород, не образующие индол, декарбоксилирующие орнитин, то их относят к бактериям вида P.mirabilis.

5.4.1.    Результаты испытания записывают следующим образом:

бактерии видов P.vulgaris и (или) P.mirabilis обнаружены или не обнаружены.

5.5.    При записи результатов испытания указывают навеску продукта, в котором обнаружены или не обнаружены выявляемые микроорганизмы.

81