ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ
НАЦИОНАЛЬНЫЙ
СТАНДАРТ
РОССИЙСКОЙ
ФЕДЕРАЦИИ
МОЛОКО НАТУРАЛЬНОЕ КОРОВЬЕ —СЫРЬЕЛюминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов
Издание официальное
Москва
Стандартинформ
2006
Предисловие
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН ООО «Люмтек»
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 «Молоко и молочные продукты»
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 23 декабря 2005 г. N9 331-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет
© Стандартинформ. 2006
Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МОЛОКО НАТУРАЛЬНОЕ КОРОВЬЕ — СЫРЬЕ
Люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов
Fresh cow's milk — raw material.
Luminescent method of quantitative determination of the total amount of mesophilic aerobic and elective
anaerobic microorganisms
Дата введения — 2007—01—01
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на сырое натуральное коровье молоко — сырье (далее — молоко) и устанавливает люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) от 50 тыс. до 20000 тыс. КОЕ/см3. Наименьший предел обнаружения КМАФАнМ — не менее 50 тыс. КОЕ/см3.
Требования к молоку установлены в ГОСТ Р 52054.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения
ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ Р 51917-2002 Продукты молочные и молокосодержащие. Термины и определения ГОСТ Р 52054-2003 Молоко натуральное коровье — сырье. Технические условия ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2228-81 Бумага мешочная. Технические условия
ГОСТ 2405-88 Манометры, вакуумметры, мановакуумметры. напоромеры. тягомеры и тягонапо-ромеры. Общие технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия ГОСТ 6709-72 Реактивы. Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 8218-89 Молоко. Метод определения чистоты
ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа ГОСТ 10157-79 Аргон газообразный и жидкий. Технические условия ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 12290-89 Картон фильтровальный для пищевых жидкостей. Технические условия ГОСТ 22649-83 Стерилизаторы воздушные медицинские. Общие технические условия ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования ГОСТ 24861-91 (ИСО 7886—84) Шприцы инъекционные однократного применения ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
Издание официальное
ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29169-91 (ИСО 648—77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при тюльзовании настоящим стандартом следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины, определения, обозначения и сокращения
3.1 В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р ИСО 5725-1 и ГОСТ Р 51917.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие обозначения и сокращения:
КМАФАнМ — количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов;
АТФ — аденозин-5’-трифосфат;
BPN-реагент — растворитель соматических клеток, белка и жира молока;
КОЕ — колониеобразующие единицы.
4 Методика определения
Метод основан на:
- растворении соматических клеток, белка и жира молока BPN-реагентом;
- фильтровании полученного раствора молока через бактериальный мембранный фильтр;
- растворении отфильтрованных микроорганизмов диметилсульфоксидом;
- измерении люминесценции полученного раствора, расчете молярной концентрации АТФ микроорганизмов и выражении ее значения в КОЕ/см3 молока.
4.1 Средства измерений и вспомогательные устройства
Прибор «Биотокс-7». обеспечивающий измерение люминесценции в диапазоне длин волн от 380 до 600 нм по (1).
Люминометрическая кювета полистирольная диаметром 10 мм. вместимостью 0,35 см3, дно которой выполнено из бактериального мембранного фильтра с порами 0.45 мкм (приложение А, рисунок 1) (2).
Штатив для люминометрических кювет (приложение А, рисунок 2) (2).
Шприц медицинский вместимостью 5 см3 по ГОСТ 22967, ГОСТ 24861.
Наконечник резиновый к медицинскому шприцу (приложение А. рисунок 3) [2].
Колба вместимостью 5 см3. 100 см3, 1 дм 3 по ГОСТ 1770.
Пипетки автоматические, позволяющие дозировать объемы: 0,02, 0,05, 0.2 и 1 см3[3). Наконечники к автоматическим пипеткам стерильные (4].
Термометр стеклянный жидкостной (нертутный), диапазон измерения 0 °С—100 °С. цена деления шкалы 1 X по ГОСТ 28498.
Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
Шкаф сушильный, позволяющий поддерживать температуру (165 ± 5) °С.
Стерилизатор воздушный медицинский по ГОСТ 22649 или стерилизатор паровой медицинский, позволяющие поддерживать температуру (121 ± 2) вС.
Баня водяная, позволяющая поддерживать температуру (45 ± 1) °С.
Перегонная установка (см. приложение Б).
Весы лабораторные с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ± 0.02 мг по ГОСТ 24104.
Установка для получения деионизированной воды no [5].
Пипетка стеклянная номинальной вместимостью 50 см3 2 кл. по ГОСТ 29169.
Эксикатор по ГОСТ 23932.
Вакуумметр по ГОСТ 2405.
ГОСТ Р 52415-2005
4.2 Реактивы и материалы
АТФ-реагент для биолюминесцентного определения АТФ, чистый сухой, содержащий люциферзу светляков. Д-люциферин, соль магния, компоненты буферной системы, стабилизаторы [6].
Вода деионизированная с электропроводимостью не более 0,1 мкСм, получаемая в соответствии с инструкцией к установке по 4.1.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
АТФ сухой с содержанием основного вещества не менее 99 % [7).
BPN-реагент чистый сухой с массовой долей неионного детергента не более 5 %, содержащий компоненты буферной системы и комплекс протеаз (8).
Промывочный раствор для подготовки образцов к АТФ-метрии, чистый, с массовой долей неионного детергента не более 1 % (9).
Диметилсульфоксид [10].
Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.
Аргон по ГОСТ 10157.
Фильтровальная бумага по ГОСТ 12026 или фильтровальный картон по ГОСТ 12290.
Бумага мешочная по ГОСТ 2228.
Спирт этиловый по ГОСТ Р 51652.
Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств с метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов и материалов по качеству не уступающим приведенным выше.
4.3 Отбор проб
Отбор проб — по ГОСТ 9225 и ГОСТ 26809.
4.4 Подготовка к измерениям
4.4.1 Приготовление водного раствора с массовой долей соляной кислоты от 1 % до 2 %
В мерную колбу вместимостью 1 дм3 (см. 4.1) наливают от 100 до 200 см3дистиллированной воды и доливают пипеткой (см. 4.1) 50 см3 соляной кислоты (см. 4.2). Приливают дистиллированную воду до метки.
4.4.2 Подготовка посуды, инструментов и материалов
Лабораторную посуду, инструменты и материалы (полоски фильтровальной бумаги или фильтровального картона размером 4x12 см, завернутые в бумагу (см. 4.2), стерилизуют в соответствии с ГОСТ 26668 (пункт 1.2).
Колбу для отбора молока вместимостью 100 см3 (см. 4.1) кипятят в водном растворе соляной кислоты по 4.4.1 в течение 15 мин и ополаскивают дистиллированной водой. Затем колбу стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (160 ± 5) °С в течение 2 ч с последующим охлаждением в эксикаторе (см. 4.1) либо в стерилизаторе при температуре (121 ± 2) вС в течение (30 ± 1) мин с последующим охлаждением в эксикаторе (см. 4.1).
4.4.3 Очистка диметилсульфоксида с помощью перегонки
Диметилсульфоксид перегоняют в потоке аргона при температуре (72,0 ± 0.2) °С и остаточном давлении 15 мм рт. ст. Для шлифов перегонной установки (см. 4.1) использование смазки не допускается. Перегнанный диметилсульфоксид хранят в стеклянной посуде без доступа света в течение 30 дней при температуре не выше 4 °С.
4.4.4 Подготовка раствора АТФ-реагента
В упаковку с сухим АТФ-реагентом (см. 4.2) автоматической пипеткой, позволяющей дозировать 1 см3, вносят деионизированную воду по 4.2 в объеме, указанном на этикетке упаковки, и осторожно перемешивают покачиванием. Если для испытания используют несколько упаковок с сухим АТФ-реагентом. то их содержимое после добавления деионизированной воды объединяют в одну упаковку с помощью автоматической пипетки. Перед использованием раствор АТФ-реагента выдерживают от 15 до 30 мин. Полученный раствор используют в течение 6 ч.
4.4.5 Приготовление контрольного образца АТФ с молярной концентрацией (С,) — 1 10“11 моль/см3
Взвешивают (0,2755 ± 0,0001) г АТФ (см. 4.2), растворяют его деионизированной водой в мерной колбе вместимостью 5 см3 (молярная концентрация водного раствора АТФ — 0.1 моль/см3).
0,5 см3 водного раствора АТФ вносят в мерную колбу вместимостью 5 см3 и доводят объем раствора до метки диметилсульфоксидом по 4.4.3 (молярная концентрация полученного раствора АТФ в диметилсульфоксиде— 1 10”2 моль/см3). Данную процедуру повторяют еще девять раз, лоследова-
3
тельно растворяя 0.5 см3 вновь получаемых растворов ди метил сульфоксидом в мерных колбах вместимостью 5 см3.
Допускается использовать для приготовления контрольного образца лиофильно высушенную смесь АТФ с инертными наполнителями, обеспечивающую после ее растворения молярную концентрацию АТФ 1 10 11 моль/см3.
4.4.6 Измерение люминесценции контрольного образца АТФ
Люминометрическую кювету помещают в кюветное отделение прибора для измерения люминесценции и последовательно вносят в нее 0.02 см3 контрольного образца АТФ по 4.4.5 и 0.05 см3 деионизированной воды, а также 0.05 см3 раствора АТФ-реагента по 4.4.4. Раствор перемешивают прокачиванием: трижды набирая содержимое люминометрической кюветы в наконечник автоматической пипетки вместимостью 0.05 см3 и возвращая его в люминометрическую кювету. Измеряют люминесценцию /,.
Процедуру измерения люминесценции контрольного образца АТФ проводят дважды. АТФ-реагент считают пригодным для проведения испытаний, если для среднеарифметического значения двух результатов наблюдений люминесценции выполняется условие: /, £ 500 уел. ед.
4.4.7 Подготовка пробы молока
Из объединенной пробы молока по ГОСТ 9225 отбирают 250 см3 молока, фильтруют его через иглопробивную ткань в соответствии с требованиями ГОСТ 8218 (см. разделы 2. 3). Предварительно ткань стерилизуют при температуре (121 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин. охлаждают в эксикаторе до температуры (20 ± 2) вС. Предварительно поверхность установки для фильтрования молока обрабатывают этиловым спиртом (см. 4.2) и высушивают.
4.5 Проведение измерений
4.5.1 Отбирают 50 см3 отфильтрованного молока по 4.4.7 и помещают в колбу вместимостью 100 см3, подготовленную по 4.4.2. Молоко подогревают до температуры (20 ± 2) °С и перемешивают.
4.5.2 Автоматической пипеткой отбирают 1 см3 молока по 4.5.1, вносят его в упаковку с BPN-pea-гентом и перемешивают ее содержимое. Упаковку выдерживают в водяной бане при (45 ± 1) вС в течение 10 мин.
4.5.3 Люминометрическую кювету устанавливают на столку из трех-пяти полосок фильтровальной бумаги или на одну полоску фильтровального картона по 4.4.2, помещенных в штатив для люминомет-рических кювет (приложение А, рисунок 2). В люминометрическую кювету автоматической пипеткой вместимостью 0.2 см3 вносят 0.2 см3 раствора по 4.5.2 и продавливают его в фильтровальную бумагу или фильтровальный картон, создавая избыточное давление воздуха с помощью шприца с резиновым наконечником (приложение А. рисунок 3). Стопку фильтровальной бумаги или полоску фильтровального картона в штативе для люминометрических кювет периодически перемещают так. чтобы после фильтрования под люминометрической кюветой она оставалась сухой.
Если фильтрование затруднено, то процедуру по 4.5.2 повторяют с увеличением времени выдерживания упаковки в водяной бане до 20 мин.
4.5.4 В люминометрическую кювету по 4.5.3 автоматической пипеткой вместимостью 0,2 см3 вносят 0.2 см3 промывочного раствора (см. 4.2) и продавливают его в фильтровальную бумагу или фильтровальный картон, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником. Стопку фильтровальной бумаги (или полоску фильтровального картона) в штативе для люминометрических кювет периодически перемещают так, чтобы после фильтрования под люминометрической кюветой она оставалась сухой.
4.5.5 Подготовленную люминометрическую кювету по 4.5.4 помещают в кюветное отделение прибора для измерения люминесценции и автоматической пипеткой вместимостью 0.02 см3 вносят в нее 0.02 см3 диметилсульфоксида по 4.4.3. Через 1 мин автоматической пипеткой вместимостью 0.05 см3 в люминометрическую кювету вносят последовательно 0.05 см3 деионизированной воды и 0.05 см3 раствора АТФ-реагента по 4.4.4. Раствор перемешивают прокачиванием: трижды набирая содержимое люминометрической кюветы в наконечник автоматической пипетки и возвращая его в люминометрическую кювету. Измеряют люминесценцию анализируемой пробы /2.
4.5.6 Процедуры по 4.5.3— 4.5.5 проводят дважды.
4.6 Обработка результатов
4.6.1 За результат измерений люминесценции контрольного образца принимают среднеарифметическое значение двух результатов наблюденийесли их повторяемость (сходимость) не превышает 10 % среднеарифметического значения.
4.6.2 За результат измерений люминесценции анализируемой пробы принимают среднеарифме-
4
ГОСТ Р 52415-2005
тическое значение двух результатов наблюдений /?. если их повторяемость (сходимость) не превышает 10 % среднеарифметического значения.
4.6.3 В случае, если повторяемость превышает 10 %. процедуры по 4.4.6 и 4.5.2—4.5.5 повторяют.
4.6.4 Молярную концентрацию АТФ Сг. моль/см3. в анализируемой пробе рассчитывают по формуле
С2 = 0,1С1(/2У(/1), (1)
где 0,1 — коэффициент, учитывающий концентрирование микроорганизмов в люминометрической кювете при фильтровании раствора;
С, — молярная концентрация АТФ в контрольном образце. 1 10 11 моль/см3 по 4.4.6;
/, — среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений люминесценции контрольного образца АТФ по 4.4.6, уел. ед.;
12 — среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений люминесценции анализируемой пробы, уел. ед.
4.6.5 Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов определяют по таблице 1.
|
Таблица 1 |
|
Молярная ко»«*)нтраиия АТФ, Cj моль/см3 |
КМАФАнМ. КОЕ/см3 |
|
Менее 0,6 10—12 |
До 50 тыс. |
|
От 0,60 10-’2 до 1,20 10—12 включ. |
Св. 50 тыс. в 100 тыс. включ. |
|
» 1.21-10—12 » 2.70 10“12 в |
в 100 тыс. в 200 тыс. в |
|
в 2.71 10—12 » 4,2010—12 в |
в 200 тыс. в 300 тыс. в |
|
» 4.21 10-12 » 7,3010“12 » |
в 300 тыс. в 500 тыс. в |
|
в 7.31 10—12 » 74.00 Ю-12 * |
в 500 тыс. в 4000 тыс. в в 4000 тыс. в 20000 тыс. в |
|
в 74,10 10~12 „ 442.00 10-12 в |
|
|
5
Приложение А (обязательное)
Вспомогательные устройства для фильтрования молока
ГОСТ Р 52415-2005
Приложение Б (рекомендуемое)
1 — нагреватель; 2 — термометр. 3 — холодильнш, 4 — вакуумметр; 5 — охлаждаемая склянка 6 — приемник фракций,
7 — круглодонная колба; 8 — капилляр
Рисунок Б 1
7
Библиография
(1) ЮУВА 414236. 001 ТУ
[2) Каталог ООО «Люмтек». N по каталогу LR09 или каталог фирмы New Horizons Diagnostics Согр. США. N по каталогу 89—117021
[31 ТУ 9452-002-33189998—2002 Дозаторы пипеточные с двойным термостатированным цветным корпусом, фиксированными и переменными объемами одно- и многоканальные «Колор»
[4) ТУ 9452-002-33189998—2002 Наконечники полимерные одноразовые к дозаторам пипеточнымНП— «Термоэлектрон»
[5) Каталог фирмы Millipore. Франция. N по каталогу ZMQS500TY
[6) ТУ 2639-001-17919612—2002 АТФ-реагент для биолюминесцентного определения АТФ. Чистый
[7) Каталог фирмы Sigma. N по каталогу А7699
[8) ТУ 2639-002-17919612—2002 BPN-реагент. Чистый
[91 ТУ 2639-003-17919612—2002 Промывочный раствор для подготовки образцов к АТФ-метрии. Чистый
[10] Диметилсульфоксид Р 75/244/9. утвержденный Фармакологическим Государственным Комитетом Минздрава России от 15.03.99
8
