ГОСТ Р 51198-98 (ИСО 4134-78)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ

Метод определения L-(+)-глутаминовой кислоты

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2010

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Московской государственной академией пищевых производств

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 28 августа 1998 г. № 336

3    Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 4134—78 «Мясо и мясные продукты. Определение содержания Е-(+)-глутаминовой кислоты» с дополнительными требованиями, отражающими потребности экономики страны (2, 4, 6.6, 6.8, 6.12, 6.13, 7.1 и 9.1)

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5    ПЕРЕИЗДАНИЕ. Январь 2010 г.

© ИПК Издательство стандартов, 1998 © СТАНДАРТИНФОРМ, 2010

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

118

ГОСТ Р 51198-98 (ИСО 4134-78)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ

Метод определения L-(+)-глутаминовой кислоты

Meat and meat products.

Method for determination of L-(+)-glytamic acid content

Дата введения 2000—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на мясо и мясные продукты и устанавливает метод определения L-(+)-глутаминовой кислоты.

2    Нормативные ссылки

ГОСТ 9793-74 Продукты мясные. Методы определения влаги

ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1—91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб

3    Определение

Массовая доля Ь-(+)-глутаминовой кислоты — массовая доля Ь-(+)-глутаминовой кислоты, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в процентах.

4    Сущность метода

Ь-(+)-глутаминовую кислоту экстрагируют из пробы продукта, взятой на испытание, ледяным раствором хлорной кислоты. Смесь центрифугируют, фильтруют и доводят активную кислотность фильтрата до требуемого значения. Проводят ферментативное преобразование Ь-(+)-глутамата в а-кетоглутарат в ходе реакции с никотинамидадениндинуклеотидом (НАД) в присутствии глутамат-дегидрогеназы (ГДГ):

гдг

Ь-(+)-глутамат + НАД⁺ +Н₂0 <->    а-кетоглутарат + НАДН + NH₃ + Н⁺.

Затем окисляют эквивалентное количество восстановленной формы НАДН хлоридом йодони-тротетразолия (ИНТ) в присутствии липоаминдегидрогеназы (ЛАДГ):

ЛАДГ

НАДН + ИНТ-хлорид + Н+ <->НАД⁺ + формазан.

Измеряют массовую долю образовавшегося формазана на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

5 Реактивы

Все реактивы должны быть аналитического качества (не ниже х. ч.). Все растворы, кроме растворов неорганических соединений (5.1 и 5.2), должны храниться в закрытой посуде из темного стекла, тщательно вымытой и пропаренной или стерилизованной.

Вода, используемая для приготовления растворов ферментов, должна быть деминерализованной или бидистиллированной, полученной в стеклянном дистилляторе.

Издание официальное

Вода, используемая для приготовления растворов химических реагентов и подготовки проб, должна быть дистиллированной или деминерализованной.

Примечание — Однократно дистиллированная вода может содержать ионы металлов, которые снижают активность ферментов, а деминерализованная вода может содержать микроорганизмы, увеличивающие неспецифическую фоновую ферментативную активность и искажающие результаты анализа.

Препарат НАД должен содержать не менее 90 % основного вещества.

Ь-(+)-глутаминовая кислота должна содержать не менее 98 % основного вещества.

Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые наборы реактивов при условии соответствия качества реактивов требованиям настоящего стандарта.

5.1    Раствор хлорной кислоты с (НСЮ₄) = 1,0 моль/дм³

8,6 см³ раствора хлорной кислоты массовой доли 70 % и плотности 1,67 г/см³ помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем раствора до метки водой.

Примечание — При использовании хлорной кислоты меньшей массовой доли проводят перерасчет объема кислоты, используемой для осаждения белков.

5.2    Раствор гидроксида калия с (КОН) = 2 моль/дм³

Растворяют 56,1 г гидроксида калия (КОН) в воде, доводят объем раствора до 500 см³.

5.3    Буферный раствор активной кислотности 8,6 pH

5.3.1    Растворяют 1,86 г гидрохлорида триэтаноламина в воде, доводят активную кислотность раствора до 8,6 pH раствором гидроксида калия (5.2), используя для измерений pH-метр. Затем добавляют 0,68 г октилфенолдекаэтиленгликолевого эфира (например, Тритон X = 100) и доводят объем раствора до 100 см³ водой.

5.3.2    Растворяют 0,86 г двузамещенного фосфорнокислого калия (К₂НР0₄) и 0,007 г одноза-мещенного фосфорнокислого калия (КН₂Р0₄) в воде и доводят объем раствора до 100 см³.

5.3.3    Смешивают 20 см³ раствора по 5.3.1 и 5 см³ раствора по 5.3.2.

Раствор хранят при температуре 4 °С.

5.4    Раствор НАД

Навеску НАД массой 0,025 г растворяют в 5,0 см³ воды в небольшой колбе со шлифом, колбу закрывают пробкой.

Раствор устойчив не менее 1 мес при температуре 4 °С.

5.5    Раствор йодонитротетразолия [2-(р-йодофенил)-3-(р-нитрофенил)-5-фенилтетразолия] хлорида (ИНТ-хлорида)

Растворяют 0,030 г ИНТ-хлорида в 50 см³ воды, колбу закрывают пробкой.

Раствор устойчив не менее 2 мес при температуре 4 °С в темноте.

5.6    Раствор ЛАДГ

Растворяют 0,003 г лиофильно высушенной липоаминдегидрогеназы в 1 см³ воды.

Раствор устойчив не менее трех недель при температуре 4 °С.

5.7    Раствор ГДГ

Используют раствор глютаматдегидрогеназы концентрации 10 мг/см³, свободный от сульфата аммония, этилендиаминтетрауксусной кислоты и глутаминазы, поставляемый в готовом виде (например, в расфасовке по 1,0 см³), удельной активностью не менее 900 Е/см³.

Раствор устойчив не менее 12 мес при температуре 4 °С.

5.8    Стандартный раствор L-(+)-глутаминовой кислоты

Растворяют 0,050 г L-(+)-глутаминовой кислоты в 25 см³ воды. Активную кислотность раствора устанавливают 7,0 pH раствором гидроксида калия (5.2), после чего доводят объем раствора до 50 см³.

Раствор хранят при температуре 4 °С и непосредственно перед использованием разводят водой в соотношении объемов 1 : 49.

6 Средства контроля и вспомогательные устройства

Обычная лабораторная аппаратура, а также указанная в 6.1 — 6.11.

6.1    Мясорубка механическая лабораторная, снабженная перфорированной пластинкой с отверстиями диаметром не более 4 мм.

6.2    Миксер лабораторный.

6.3    Центрифуга лабораторная с пробирками вместимостью 50 или 100 см³.

6.4    Иономер или pH-метр диапазоном измерений от 1 до 14 pH и допускаемой погрешностью ± 0,05 pH.

6.5    Фильтры бумажные гофрированные диаметром 15 см.

120

ГОСТ Р 51198-98

6.6    Колбы мерные вместимостью 100 и 250 см³ и допускаемой относительной погрешностью

± 0,2 %.

6.7    Дозаторы пипеточные объемами доз 25, 50 и 100 см³ и относительной погрешностью дозирования + 1 %.

6.8    Пипетки градуированные вместимостью 0,05; 0,2; 0,5 и 2,5 см³ и допускаемой относительной погрешностью + 1 %.

6.9    Шпатели пластиковые или палочки стеклянные для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.

6.10    Спектрофотометр (фотометр) со следующими техническими характеристиками: спектральный интервал — не более 10 нм; интервал измерений оптической плотности — от 0,000 до 2,000; погрешность установки длины волны — ± 3 нм; среднее квадратическое отклонение случайной составляющей погрешности измерений — не более 0,15 %.

6.11    Кюветы фотометрические толщиной поглощающего слоя 10 мм.

6.12    Термометр жидкостный стеклянный с интервалом измерений от 0 до 100 °С, допускаемой погрешностью измерений ± 2 °С.

6.13    Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью + 0,001 г.

7    Порядок подготовки к проведению измерений

7.1    Отбор проб — по ГОСТ Р 51447.

7.2    Пробу массой не менее 200 г, полученную из репрезентативной выборки, хранят в условиях, предотвращающих порчу и изменение состава.

8    Порядок проведения измерений

8.1    Подготовка пробы к проведению измерений

Образец пробы гомогенизируют, дважды пропуская через мясорубку (6.1) и тщательно перемешивая.

Образец хранят не более 24 ч в заполненном доверху и герметически закрытом контейнере таким образом, чтобы предотвратить порчу или изменение состава.

8.2    Навеска для проведения анализа

Взвешивают приблизительно 50 г исследуемого образца с точностью до 10 мг и помещают навеску образца в лабораторный миксер (6.2).

8.3    Приготовление экстракта

8.3.1    К навеске образца в лабораторном миксере добавляют 100 см³ охлажденного льдом раствора хлорной кислоты (5.1) и гомогенизируют.

8.3.2    Часть гомогенизата помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при угловой скорости 3000 мин^-1, затем, осторожно отодвинув слой жира, отфильтровывают супернатант через гофрированный бумажный фильтр (6.5) в коническую колбу вместимостью 200 см³. Первые 10 см³ фильтрата выбрасывают.

8.3.3    50 см³ подготовленного раствора, который может быть слегка мутным, переносят в стаканчик вместимостью 100 см³ и доводят активную кислотность раствора до 10 pH раствором гидроксида калия (5.2).

8.3.4    Количественно переносят содержимое стаканчика в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем раствора до метки водой.

8.3.5    Раствор охлаждают в ледяной бане 20 мин и фильтруют через гофрированный бумажный фильтр (6.5), отбросив первые 10 см³ фильтрата.

8.3.6    25 см³ фильтрата переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³ и доводят объем фильтрата до метки водой.

Примечание — Объем фильтрата выбирают так, чтобы концентрация Ь-(+)-глутаминовой кислоты была приблизительно 0,030 г/дм³.

8.4 Определение

8.4.1 Температуру растворов по 5.3 и 8.3.6 доводят до 20—25 °С. Для проведения ферментативной реакции берут две фотометрические кюветы (6.11), в каждую из которых пипеточным дозатором (6.5) добавляют:

-    2,50 см³ буферного раствора (5.3);

3

-    0,20 см³ раствора НАД (5.4);

121

-    0,20 см³ раствора ИНТ (5.5) и

-    0,05 см³ раствора линоаминдегидрогеназа (5.6).

Затем в одну кювету вносят 0,50 см³ экстракта (8.3.6), получая исследуемый раствор, а во вторую — 0,50 см³ воды, получая контрольный раствор.

Растворы в кюветах перемешивают пластиковыми шпателями или стеклянными палочками (6.9) и измеряют оптические плотности относительно воздуха при длине волны 492 нм: А₁ — оптическая плотность исследуемого раствора, А_1к — оптическая плотность контрольного раствора.

Температура растворов должна быть от 20 до 25 °С.

8.4.2    В каждую кювету вносят по 0,05 см³ раствора ГДГ (5.7) и тщательно смешивают с содержимым, используя шпатель или стеклянную палочку (6.9).

Растворы выдерживают 15 мин. Затем измеряют оптические плотности при длине волны 492 нм, повторяя измерения через каждые 2 мин до достижения постоянных значений.

Строят графики зависимости оптических плотностей растворов от времени и экстраполируют их на момент внесения фермента ГДГ (приложение А).

Получают экстраполированные значения оптических плотностей исследуемого (А₂) и контрольного (А_2к) растворов.

8.4.3    Определяют микромолярный коэффициент оптической плотности формазана, повторяя операции по 8.4.1 и 8.4.2, но заменяя 0,5 см³ экстракта в первой фотометрической кювете на 0,5 см³ стандартного раствора L-(+)-глутаминовой кислоты (5.8).

Получают следующие значения оптических плотностей:

-    А \ — стандартного раствора L-(+)-глутаминовой кислоты;

-    А'_1к — контрольного раствора;

-А 2 — стандартного раствора L-(+)-глутаминовой кислоты;

-А 2к — контрольного раствора.

8.5 Выполняют два параллельных определения в двух пробах из одного и того же образца (8.1).

9 Правила обработки результатов измерений 9.1 Метод расчета

Массовую долю Ь-(+)-глутаминовой кислоты в пробе X, %, вычисляют по формуле

Х= ААх

3,5 х 147,1

х

250    100

(100-

k х 0,5 х 1000    1000

х

Мх т 100

50

100

т

= 51,485х

А А

kxVxm

х(100 + ^)

где А А = (А₂ — A_t) — (А_2к — А_1к);

147,1 — молярная масса L-(+)-глутаминовой кислоты;

М— массовая доля влаги в пробе, определенная по ГОСТ 9793; т — масса навески (8.2), г;

V— объем фильтрата, взятый на определение (8.3.6), см³;

к — микромолярный коэффициент оптической плотности формазана при длине волны 492 нм, см²/мкмоль, рассчитанный по формуле

к = АА' х — х — х 147,1 - 51,485 х АД',

где А А' = (Л 2 — А\) - (А'_2к — А'_1к).

За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений при условии выполнения 9.2.

Результат определяют с точностью 0,01 %.

9.2 Сходимость

Относительное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать 10 % среднеарифметического значения.

4

122

10 Оформление результатов измерений

В отчете об испытании должны быть указаны:

-    используемый метод;

-    полученные результаты;

-    любые условия проведения испытаний, не установленные данным стандартом и касающиеся подробностей, которые могут повлиять на конечный результат.

В отчете должны быть все данные, необходимые для полной идентификации пробы.

ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное)

Пример построения графика зависимости оптической плотности раствора от времени

УДК 637.5.001.4:006.354    ОКС    67.120.10    Н19    ОКСТУ 9209

Ключевые слова: мясо, мясные продукты, химический анализ, определение массовой доли, органические кислоты, Ь-(+)-глутаминовая кислота

124