Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.

Детекция и идентификация ГМО растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции в матричном формате

Методические указания МУК 4.2.3390—16

Издание официальное

Москва • 2017

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.

Детекция и идентификация ГМО растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции в матричном формате

Методические указания МУК 4.2.3390—16

МУК 4.2.3390—16

5.3.    Определение вероятных трансформационных событий, присутствующих в образце, по комплексу обнаруженных генетических элементов проводится с использованием базы данных трансформационных событий и генетических элементов или аналогичных баз данных (например, баз данных CERA http://cera-gmc.org/GMCropDatabase, GMOseek-Software http://www.gmoseek.com/gmoseek). Пример определения вероятных трансформационных событий по комбинации обнаруженных генетических элементов с помощью базы данных трансформационных событий и генетических элементов приведен в прилож. 2.

5.4.    Окончательный результат анализа определяется и вносится в протокол экспертом, проводившим исследование.

VI. Выделение ДНК

6.1.    Выделение ДНК осуществляется в соответствии с методами, описанными в МУК 4.2.2304—07 «Методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения», ГОСТ Р ИСО 21571-14 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот».

6.1.1.    Допускается использовать для выделения ДНК готовые наборы реактивов, предназначенных для работы с растительным сырьем. В этом случае выделение осуществляется в соответствии с протоколом (инструкцией по применению), рекомендованным производителем.

6.1.2.    Для упрощения процедуры выделения ДНК возможно применение методов, основанных на использовании сорбентов.

6.1.3.    Не допускаются методы выделения ДНК, основанные на применении комбинации «гуанидин-фенол хлороформ».

6.2. Полученный препарат ДНК следует хранить при 4 °С (кратковременное хранение, не более 6 ч) или в морозильной камере при -20 °С (длительное хранение, до 1 года).

VII. Подготовка образцов для анализа

7.1.    Подготовка образцов.

7.1.1.    Отобрать и промаркировать микропробирки в соответствии с количеством анализируемых образцов и схемой расположения тест-систем в ячейках ПЦР-матрицы (конфигурацией ПЦР-матрицы). В пробирки внести по (N * 0,15) мкл буферного раствора и по (N * 1,35) мкл очищенного препарата ДНК, где N - количество ячеек (реакций), в которых будет производиться анализ каждого из образцов, включая ячейку внутреннего контрольного образца. В случае если имеющегося объема

МУК 4.2.3390—16

препарата ДНК недостаточно для приготовления рабочей смеси, допускается разбавление препарата ДНК деионизованной водой в соотношении «ДНК : деионизованная вода» нс более 1 : 2 (v/v).

7.1.2.    В случае если конфигурация матрицы предполагает постановку контрольных реакций ПЦР, в отдельную пробирку внести по (N х 0,15) мкл буферного раствора и по (N * 1,35) мкл деионизованной воды, где N - количество контрольных ячеек (реакций) ГИДР. ПЦР-ма-трицы для скрининговых исследований не содержат в своей конфигурации ячеек с отрицательными и положительными контрольными образцами. Контроль работоспособности готовых матриц осуществляется производителем посредством проверки трех случайно выбранных матриц каждой партии.

7.1.3.    Тщательно перемешать полученные смеси, капли со стенок пробирок осадить кратковременным (3—5 с) центрифугированием.

7.2. Подготовка ГГЦР-матрицы.

7.2.1.    Извлечь из упаковки ПЦР-матрицу, убедиться в ее целостности, отсутствии трещин и сколов.

7.2.2.    Удалить защитную пленку с матрицы, вставить ПЦР-матрицу в картридж.

7.2.3.    Реакционную зону ПЦР-матрицы заполнить герметизирующей жидкостью (объем 620 мкл), используя дозатор с одноразовым наконечником. Герметизирующая жидкость должна покрывать всю реакционную зону однородным слоем. Недопустимо образование пузырьков на поверхности жидкости.

7.2.4.    В соответствии с конфигурацией матрицы ввести по 1,2 мкл смеси с образцами, приготовленными согласно п. 7.1, в ячейки матрицы под слой герметизирующей жидкости (рис. 1). Для этого погрузить наконечник дозатора со смесью под слой герметизирующей жидкости, подвести его как можно ближе к дну ячейки и осторожно, нс прикасаясь наконечником к поверхности ячейки, выдавить заранее определенный объем смеси в ячейку. Реакционная зона ПЦР-матрицы имеет специальное покрытие, обеспечивающее попадание капли в ячейку за счет гидрофильно-гидрофобных взаимодействий (рис. 2). Аналогично следует ввести смесь для контрольных реакций ПЦР в соответствующие ячейки, если контрольные реакции ПЦР предусмотрены.

Заполнение ячеек образцами после покрытия поверхности матрицы герметизирующей жидкостью обусловлено необходимостью минимизации риска контаминации образца (минимизации контакта образца с внешней средой) и снижением вероятности вытеснения капель образца из ячеек.

11

Рис. 1. Заполнение ячейки ПЦР-матрицы реакционной смесью Гидрофобмое покрытие    Гидрофильное покрытие

Рис. 2. Изображение ПЦР-матрицы

VIII. Проведение амплификации с детекцией в режиме реального времени

8.1.    Поместить картридж с ПЦР-матрицсй в термоблок амшшфика-тора. На протяжении анализа термоблок должен быть закрыт.

8.2.    Используя программное обеспечение амплификатора, создать новый проект анализа. Для этого необходимо перейти в раздел «Проект» и в открывшемся диалоговом окне нажать кнопку «Создать» (рис. 3).

8.2.1. Установить параметры термоциклирования. Для этого необходимо во вкладке «Терморежим» с помощью кнопок «Удержание» и «ПЦР-после» добавить в список соответствующие этапы реакции, после чего, устанавливая курсор в соответствующие поля созданной таблицы, ввести требуемые значения вручную (табл. 2, рис. 4).

Таблица 2

Параметры термоциклирования

Этап Температура, °С \ Время, с Количество циклов\ 1 - Удержание 94 180 » ....1 2-ПЦР 94 5 1 45 60* 30

* На этом этапе происходит регистрация сигнала (снятие кадра)

8.2.2. Установить параметры детекции флуоресцентного сигнала. Для этого необходимо во вкладке «Детектирование», устанавливая курсор в соответствующие поля, ввести требуемые значения вручную (табл. 3, рис. 5).

Таблица 3

Параметры детекции флуоресцентного сигнала

Канал Выдержка, мс Усиление Задержка, мс \ РАМ 1 500 100 0 \ ROX 1000 100 _S_

8.2.3. Установить параметры обсчета графиков ПЦР. Для этого необходимо во вкладке «Детектирование» нажать кнопку «параметры расчетов ПЦР», после чего, устанавливая курсор в соответствующие поля созданной таблицы, ввести требуемые значения вручную (табл. 4, рис. 6).

Таблица 4

Параметры обсчета графиков ПЦР

Параметр	Значение \
Длина волны циклов	2 \
Удалять фон	Экспоненциальный фон \
Количество выбросов	__п_

8.2.4. Указанные в п. 8.2.1—S.2.3 параметры являются едиными для всей матрицы.

ББК51.23

Д38

Д38 Детекция и идентификация ГМО растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции в матричном формате: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2017.—36 с.

ISBN 978—5—7508—1527—2

1.    Разработаны ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

(В. А. Тутсльян, Н. В . Тышко, Э. О. Салыкова, А. К. Голомидова,

С. И. Шестакова), Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А. К). Попова, И. В. Брагина), ФБУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора (М. В. Зароченцев, Д. С. Кудрявцев, В. В. Мордвинова), Российской академией наук (Г. Г. Онищенко), Институтом биоинженерии, ФГУ «ФИЦ Биотехнологии» РАН (К. Г. Скрябин, И. В. Яковлева, Б. Б. Кузнецов), МГУ им. М. В. Ломоносова (М. II. Кирпичников), ООО «ГенБит» (П. А. Французов, М. М. Никитин, А. Г. Голиков).

2.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 3 августа 2016 г.

3.    Введены впервые.

ББК 51.23

Редактор Л. С. Кучурова Компьютерная верстка Е. В. Ломановой

Подписано в печать 27.00.16 Формат 60x88/16    Печ. л. 2,25

Тираж 125 экз.    Заказ 3

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., л 18, стр. 5, 7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделением издательского обеспечения отдела научно-методического обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Реализация печатных изданий, тел./факс: 8 (495) 952-50-89

© Роспотребнадзор, 2017 ©Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2017

МУК 4.2.3390—16

Содержание

I. Область применения...........................................................................................5

И. Термины и определения.....................................................................................5

III.    Аналитические характеристики метода...........................................................6

IV.    Оборудование и реактивы.................................................................................7

V.    Алгоритм лабораторных исследований............................................................9

VI.    Выделение ДНК................................................................................................10

VII.    Подготовка образцов для анализа...................................................................10

VIII.    Проведение амплификации с детекцией в режиме реального времени......12

IX.    Регистрация и интерпретация результатов анализа......................................19

X.    Нормативные ссылки.......................................................................................25

Приложение 1. Определяемые генетические элементы........................................26

Приложение 2. Пример идентификации вероятных трансформационных событий, присутствующих в образце, по комбинации обнаруженных генетических элементов с помощью базы данных Г'МО (ГснБит)....................................................................36

3

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Л. Ю. Попова

3 августа 2016 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.

Детекция и идентификация ГМО растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции в матричном формате

Методические указания МУК 4.23390—16

В условиях общемировой тенденции увеличения использования генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения (ГМО) сохраняется необходимость постоянного совершенствования методов их идентификации для обеспечения установленного законодательством уровня контроля за обращением ГМО на рынке и соблюдением требований маркировки.

Появляющиеся на мировом продовольственном рынке новые линии ГМО в ряде случаев не содержат регуляторных последовательное гей (промотор 35S, промотор FMV и терминатор NOS), на выявлении которых основана стратегия контроля за ГМО, применяемая в настоящее время. Следовательно, возникает вероятность снижения эффективности контроля за такими ГМО, осуществляемого классическими методами в рамках рутинных скрининговых исследований, а расширенные исследования каждого образца продукции требуют до 100 отдельных анализов.

Существующий риск снижения эффективности контроля за ГМО может быть предотвращен за счет использования нового формата полимеразной цепной реакции (ГИДР) - предподготовленной, свободно конфигурируемой ПЦР-матрицы и оптимизированных тест-систем, позволяющих выявлять и идентифицировать большинство известных линий Г'МО в рамках одного анализа. Значительная часть используемых в этих тест-системах специфических реактивов (праймеры, ДНК-зонды) широко апробированы и используются для выявления и идентификации ГМО

МУК 4.2.3390—16

в Европейском Союзе. Технические особенности проведения ПЦР с использованием ПЦР-матриц дают возможность значительно (в 2—3 раза) сократить время проведения реакции за счет существенного увеличения скорости термоциклирования, а также снизить расход реактивов за счет уменьшения реакционного объема (со стандартных 20—30 мкл до 1,2 мкл).

Для упрощения интерпретации и систематизации полученных результатов была сформирована база данных трансформационных событий и генетических элементов, позволяющая определить линии ГМО, присутствие которых в исследуемом образце наиболее вероятно.

Таким образом, применение предложенной модификации ПЦР с использованием ПЦР-матриц позволит существенно расширить спектр одномоментно детектируемых объектов, повысить удобство, скорость работы и увеличить производительность ПЦР-лабораторий, осуществляющих исследования в области контроля за оборотом ГМО.

I. Область применения

1.1.    Настоящие методические указания устанавливают методы выявления и идентификации ГМО растительного происхождения в пищевых продуктах и продовольственном сырье (включая сложные и прошедшие переработку продукты).

1.2.    Представленные методы основаны на использовании ПЦР в формате предподготовленных, свободно конфигурируемых ПЦР-матриц. Методы направлены на одномоментное выявление регуляторных генетических элементов (промоторов, терминаторов), маркерных и смысловых генов, специфичных для ГМО, а также событие-снсцифичных последовательностей в различных сочетаниях.

1.3.    Настоящие методические указания предназначены для использования лабораториями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также другими испытательными лабораториями, аккредитованными в установленном порядке на проведение соответствующих испытаний пищевых продуктов и продовольственного сырья.

II. Термины и определения

Видоспецифичные гены - гены, последовательность ДНК которых специфична для конкретного вида растений (например, ген лектина - для сои, ген зеина - для кукурузы и др.) Используются для выявления соответствующей растительной ДНК в образце.

Генетический элемент - последовательность нуклеотидов ДНК, присутствующая в трансформационном событии и определяемая с помощью соответствующей ПЦР-тест-системы. К генетическим элементам

5

относятся смысловые гены, маркерные гены, событие-специфичные последовательности и регуляторные генетические элементы.

Маркерные гены - гены, присутствующие в геноме некоторых ГМО, используемые как маркеры удачно осуществленной трансформации (гены устойчивости к антибиотикам, гены флуоресцентных белков и др.).

ПЦР-тест-система - совокупность реагентов и условий, включающая в себя состав реакционной смеси (последовательности и концентрации специфических олигонуклеотидов - праймеров, ДНК-зондов, состав реакционного буферного раствора), параметры проведения тер-моциклирования, а также детектирования сигнала, обеспечивающая определение конкретного генетического элемента.

Регуляторные генетические элементы - последовательности нуклеотидов ДНК, участвующие в регуляции экспрессии матричной РНК и не кодирующие белковую последовательность (промоторы, терминаторы, энхансеры, сайленсеры). Традиционно используются для скрининговых исследований в качестве индикаторов присутствия ГМО.

Сложные пищевые продукты - пищевые продукты, содержащие в своем составе ДНК более одного вида организмов различного происхождения.

Смысловые гены - гены, отвечающие за проявление нового признака у ГМО, например, обеспечивающие устойчивость к гербицидам, устойчивость к насекомым-вредителям и др.

Событие-спсцифичная последовательность - последовательность нуклеотидов ДНК, специфичная для конкретного трансформационного события, и используемая для выявления соответствующего ГМО в образце.

Трансформационное событие - уникальное сочетание генетической конструкции и геномной ДНК растения, однозначно характеризующее место встраивания генетической конструкции в геном.

ПЦР-матрица - пластина из инертного материала с высокой теплопроводностью, содержащая на своей поверхности 30—48 ячеек, в каждой из которых проходят индивидуальные реакции ПЦР в реальном времени.

III. Аналитические характеристики метода

3.1.    Аналитическая чувствительность метода составляет 10⁴ копий ДИК или РНК в одном миллилитре раствора образца.

3.2.    Аналитическая специфичность метода ПЦР в формате ПЦР-матриц аналогична аналигической специфичности ПЦР в классическом формате. Отсутствует положительная реакция в тестах с ДНК нецелевых объектов (близкородственных растений, не содержащих генно-инженер-

МУК 4.2.3390—16

ных конструкций; растений, относящихся к другим видам; ДНК млекопитающих, птиц, рыб).

IV. Оборудование и реактивы

4.1.    Лаборатории, осуществляющие исследования, должны быть организованы в соответствии с требованиями, изложенными в ГОСТ Р 53214—08 (ИСО 24276:2006) «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов».

4.2.    Для проведения исследований используется следующее оборудование.

4.2.1.    Амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени, обеспечивающий проведение термоциклирования в ячейках объемом до 1,5 мкл («АриаДНА» или аналогичный).

4.2.2.    Ламинарный бокс или бокс для ПЦР со встроенной системой УФ-облучения.

4.2.3.    Холодильник бытовой электрический с температурой морозильной камеры минус 20 °С.

4.2.4.    Микроцентрифуга настольная для пробирок конических полипропиленовых с крышкой объемом 1,5—2 мл (максимальное ускорение не менее 11 000 g).

4.2.5.    Аппарат для встряхивания типа «Вортекс» или микроцентрифуга «Вортекс» (максимальное ускорение 450 g).

4.2.6.    Термостат твердотельный для пробирок конических полипропиленовых с крышкой объемом 0,5 мл и 1,5—2,0 мл, диапазон температур - от комнатной до 99 °С, количество гнезд - нс менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 1 °С, разность температур между соседними ячейками - нс более 0,5 °С.

4.2.7.    Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.

4.2.8.    Гомогенизатор лабораторный.

4.2.9.    Облучатель бактерицидный настенный.

4.2.10.    Дозаторы механические с переменным объемом дозирования: 0,2—2,5 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью ± 1,2 %; 0,5—10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью ± 0,8 %; 2—20 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью ±0,8%; 20—200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью ±0,6%; 100—1 000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью ±3%; 2—10 мл с шагом 0,1 мл, с точностью ± 0,5 %.

4.2.11.    Дозатор электронный с переменным объемом дозирования 0,5—10,0 мкл, обеспечивающий функцию диспенсирования (повторного дозирования).

7

4.3. Для проведения исследований используются следующие расходные материалы.

4.3.1.    Пробирки микроцентрифужныс конические полипропиленовые с крышкой (типа Эпнсндорф) вместимостью 0,5; 1,5 мл.

4.3.2.    Наконечники одноразовые с фильтром, для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 100; 200 и 1 000 мкл.

4.3.3.    ПЦР-матрицы (микрочины, расходный материал к амплифи-катору нуклеиновых кислот «АриаДНА» в соответствии с ТУ 9443-021-45549798—11, № РД-2050/7762 от 22.10.2013) с иммобилизованными реактивами, предподготовленные для выявления и идентификации ГМО, в том числе в их смесях. Типы ПЦР-матриц описаны в табл. 1.

Таблица 1

Типы ПЦР-матриц

Тип Назначение ПЦР-матрицы для общего скрининга Специализированные ПЦР-матрицы для конкретных видов растений ПЦР-матрицы с открытой конфигурацией* Выявление видосис-цифичных генов растений Гены нескольких видов растений (от 2 до 12) Ген одного вида растений +/- Выявление регуляторных генетических элементов + +/- +/- Выявление событие-специфичных последовательностей Последовательности, характерные для трансформационных событий различных видов растений Последовательности, характерные для трансформационных событий одного вида растений +/- Выявление смысловых генов + +/- +/- Выявление маркерных генов + +/- +/- * 11ЦР-матрицы с открытой конфигурацией могут содержать различные сочетания 11ЦР-гест-систем в зависимости от задач исследования. «+» - в конфигурации ПЦР-матрицы предусмотрены ячейки, предназначенные для выявления соответствующих генов или генетических элементов. «+/-» - в конфигурации ПЦР-матрицы могут присутствовать или отсутствовать ячейки, предназначенные для выявления соответствующих генов или генетических элементов

Определяемые генетические элементы и используемые специфические реактивы (праймеры, ДНК-зонды) для каждой ПЦР-тест-системы перечислены в прилож. 1.

4.4. Для проведения исследований используются следующие реактивы.

4.4.1.    Буфер для ПЦР с MgCl₂ концентрированный (10х).

4.4.2.    Вода деионизованная.

МУК 4.2.3390—16

4.4.3.    Герметизирующая жидкость для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе термоциклирования (минеральное масло, полимстилсилоксаи).

4.4.4.    Набор реактивов для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов.

Примечание. Допускается использование другой аппаратуры, инструментов и реактивов с техническими характеристиками, аналогичными указанным выше, отечественного и зарубежного производства, разрешенные для применения в установленном порядке.

V. Алгоритм лабораторных исследований

5.1.    Отбор проб пищевых продуктов и продовольственного сырья для выполнения лабораторных исследований на наличие ГМО проводят в соответствии с установленным порядком и рекомендуемыми нормами отбора проб.

5.2.    Общая схема лабораторных исследований: