ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

Продукты пищевые

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ И ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ НИХ ПРОДУКТОВ

Экстракция нуклеиновых кислот

ISO 21571:2005

Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Nucleic acid extraction

(IDT)

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2016

Предисловие

1    ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным учреждением науки «Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева» Российской академии наук (ИФР РАН) на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 447 «Биологическая безопасность пищевых продуктов, кормов и товаров народного потребления и методы ее контроля»

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 ноября 2014 г. № 1656-ст.

4    Настоящий стандарт является идентичным международному стандарту ИСО 21571:2005 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот» (ISO 21571:2005 «Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Nucleic acid extraction»), включая техническую поправку: Amd.1:2013.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты Российской Федерации и межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

5    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0-2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

© Стандартинформ, 2016

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ Р ИСО 21571-2014

Приложение А (обязательное)

Методы экстракции ДНК

А.1 Получение применимой для ПЦР ДНК методами экстракции ДНК на основе фенола/хлороформа

А. 1.1 Основной метод на основе фенола/хлороформа

А.1.1.1 Общие положения

Настоящий метод является общепринятым (см. [5]) и применяется для экстракции ДНК из большой группы продуктов (см. А.1.1.8).

Фенол обычно подходит для деструкции нуклеаз и денатурации белка.

При исследовании листьев или зеленой массы растений (например, листьев цикория, высушенной люцерны) вместе с ДНК могут совместно осаждаться многие ингибиторы ПЦР. По этой причине могут возникнуть трудности, связанные с воспроизводимостью получения ДНК, амплифицируемой в ПЦР.

С учетом агрессивных и опасных свойств фенола в качестве альтернативы целесообразно применять методы экстрагирования ДНК, основанные на ЦТАБ и/или поливинилпирролидоне (ПВП) и/или на адсорбции диоксидом кремния.

А. 1.1.2 Статус валидации

Этот метод широко применяется во всех областях биологии, агрономии и медицины на протяжении 40 лет, однако он никогда не подвергался оценке путем межлабораторных исследований для обнаружения ГМО в пищевых продуктах.

А.1.1.3 Принцип метода

Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия и высокой концентрации этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и последующее удаление загрязняющих примесей (например, липофильных молекул, полисахаридов и белков) и нуклеаз из водной фазы, содержащей ДНК, с помощью фенола и хлороформа. Заключительное осаждение этиловым спиртом концентрирует ДНК и удаляет соли и остаточный хлороформ. Критическим этапом метода является стадия лизиса [5].

А. 1.1.4 Меры предосторожности

Работы с органическими реактивами необходимо выполнять в вытяжном шкафу.

А. 1.1.5 Реактивы

А. 1.1.5.1 Этиловый спирт (С₂Н₅ОН), 96 %-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А. 1.1.5.2 Ледяная уксусная кислота, СН₃СООН.

А.1.1.5.3 Калия ацетат, С₂Н₃0₂К.

А. 1.1.5.4 Соляная кислота, HCI, 37 %-ная.

А.1.1.5.5 Изоамиловый спирт [(СН₃)₂СНСН₂СН₂ОН].

А.1.1.5.6 Фенол, С₆Н₅ОН.

А.1.1.5.7 Хлороформ, СНС1₃.

А.1.1.5.8 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), C₄H₁₁N0₃.

А.1.1.5.9 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двукалиевая соль (К₂ЭДТА), CioHi₄N₂0₈K2.

А. 1.1.5.10 Калия гидроксид, КОН.

А.1.1.5.11 Калия хлорид, KCI.

А.1.1.5.12 Натрия додецилсульфат (SDS), C₁₂H₂₅0₄SNa.

А. 1.1.5.13 Протеиназа К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

А. 1.1.5.14 Рибонуклеаза-А, выделенная из бычьей поджелудочной железы, очищенная от ДНК, приблизительно 50000 ед./мг лиофилизата.

А.1.1.5.15 Уравновешенный фенол, > 7,8 ед. pH

Используется фенол, уравновешенный буфером для экстрагирования/лизиса (А.1.1.5.18), без SDS, или приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.

А.1.1.5.16 Смесь хлороформ — изоамиловый спирт

Смешивают 24 объемные части хлороформа (А. 1.1.5.7) и одну объемную часть изоамилового спирта (А.1.1.5.5).

А.1.1.5.17 Смесь фенол —хлороформ — изоамиловый спирт

Смешивают одну объемную часть уравновешенного фенола (А. 1.1.5.15) и одну объемную часть смеси хлороформ — изоамиловый спирт (А.1.1.5.16).

А. 1.1.5.18 Буфер для экстрагирования/лизиса

Молярные концентрации компонентов: Трис = 0,050 моль/дм³, К₂ЭДТА = 0,050 моль/дм³; массовая концентрация SDS = 30 г/дм³. Доводят pH до 8,0 ед. pH, используя HCI или КОН.

7

А.1.1.5.19 Буфер ТЕ, Трис = 0,010 моль/дм³, К₂ЭДТА = 0,001 моль/дм³.

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCI или КОН.

А. 1.1.5.20 Раствор протеиназы-К в стерильной воде, 20 мг/см³.

Автоклавирование раствора не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °С, избегать многократного замораживания и оттаивания.

А. 1.1.5.21 Раствор рибонуклеазы-А, 10 мг/см³ лиофилизата

Следует хранить при температуре минус 20 °С, избегать многократного замораживания и оттаивания.

А. 1.1.5.22 Раствор этилового спирта, С₂Н₅ОН, 70 %-ный.

Следует хранить при температуре минус 20 °С.

А. 1.1.5.23 Раствор ацетата калия, (С₂Н₃0₂К), 3 моль/дм³

Доводят значение pH до 5,2 ед. pH ледяной уксусной кислотой. Автоклавирование раствора не допускается. При необходимости пропускают через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

А. 1.1.6 Оборудование

Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

А. 1.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение не менее 10000 д. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А. 1.1.6.2 Водяная баня или инкубатор с рабочим диапазоном температур от 60 °С до 70 °С.

А.1.1.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).

А.1.1.6.4 Сублимационная сушилка (при необходимости).

|    А.1.1.6.5 Встряхиватель, например Vortex¹).

А. 1.1.6.6 Реакционные сосуды, способные выдержать заморозку в жидком азоте.

А.1.1.7 Методика

А.1.1.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК. При изменении размера анализируемой пробы необходимо соответственно скорректировать массы и объемы реактивов и буферных растворов.

А.1.1.7.2 Методика выделения

Взвешивают 0,25 г анализируемой пробы в микропробирке. Добавляют 1,6 см³ буфера для экстрагирования/ лизиса (А.1.1.5.18) и в случае необходимости (например, для проб с высоким содержанием белка) 50 мм³ раствора протеиназы-К (А.1.1.5.20). Инкубируют при температуре от 60 °С до 70 °С, обычно в течение от 30 мин до 2 ч (также возможно инкубирование в течение ночи). Добавляют рибонуклеазу-А (А. 1.1.5.21) до конечной массовой концентрации 0,1 мкг/см³. Центрифугируют при ускорении 5000 д в течение 30 мин. Извлекают образовавшийся верхний слой (супернатант) и переносят в чистую пробирку. Добавляют к нему один объем уравновешенного фенола (А. 1.1.5.15), затем осторожно и тщательно перемешивают. Центрифугируют при ускорении 5000д в течение 15 мин, переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку. Добавляют к верхнему слою один объем смеси фенол — хлороформ — изоамиловый спирт (А.1.1.5.17), затем осторожно и тщательно перемешивают. Центрифугируют при ускорении 5000д в течение 15 мин, переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку. В зависимости от состава анализируемой пробы (продукта) данную процедуру повторяют один или несколько раз до тех пор, пока граница раздела фаз не станет четкой.

Добавляют к верхнему слою один объем смеси хлороформ — изоамиловый спирт (А.1.1.5.16), затем осторожно и тщательно перемешивают. Центрифугируют при ускорении 5000 g в течение 10 мин и переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку. Повторяют до тех пор, пока граница раздела фаз не станет четкой. Смешивают образовавшийся верхний слой с 0,1 объема раствора ацетата калия (А.1.1.5.23) и 2,5 объема 96 %-ного этилового спирта (А. 1.1.5.1), затем тщательно перемешивают, переворачивая пробирки. Выдерживают в течение по меньшей мере 5 мин в жидком азоте или 1 ч при температуре минус 80 °С, или всю ночь при температуре минус 20 °С. Центрифугируют при ускорении 10000д (или до 13000д) при температуре 4 °С в течение по меньшей мере 15 мин, затем осторожно сливают образовавшийся верхний слой.

Тщательно промывают осадок ДНК в пробирке после центрифугирования двумя объемами 70 %-ного раствора этилового спирта (А. 1.1.5.22). Центрифугируют при ускорении от 10000д до 13000д при температуре 4 °С в течение 15 мин, затем осторожно сливают образовавшийся верхний слой. Эта стадия является особенно важной для удаления осаждающихся солей, которые могут оказать влияние на последующий анализ (например, ПЦР).

Высушивают осадок в пробирке после центрифугирования и повторно растворяют его в 100 мм³ воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А. 1.1.5.19). Полученный раствор представляет собой основной раствор ДНК. Добавляют рибонуклеазу-А (А.1.1.5.21) до конечной массовой концентрации 0,1 мкг/см³.

^ Vortex — это пример коммерчески доступного оборудования, пригодного для использования с описываемым методом. Эта информация приводится исключительно для информации пользователей настоящего стандарта и ни при каких условиях не может служить рекомендацией или одобрением конкретного типа оборудования. Допускается использование аналогичного оборудования, при условии, что оно позволяет получать такие же результаты.

ГОСТ Р ИСО 21571-2014

А.1.1.8 Перечень примеров

Описанный метод был успешно применен для экстрагирования ДНК¹) из следующих продуктов: квашеные соевые бобы¹), обезвоженная люцерна, детское сухое печенье¹), детское молоко¹), бактерии и их споры, семена ячменя, говяжий/свиной паштет¹), пиво¹), «голубой сыр», шоколадное пирожное с орехами¹), консервированная кукуруза, семена моркови, брикетированный зерновой концентрат¹), сыр, наггетсы куриные, листья цикория, корни цикория, печенье, глазированное шоколадом¹), шоколадная паста¹), печенье с корицей¹), компоты, кукурузные хлопья¹), дробленый рис, десертный крем¹), высушенные семена гороха, кукурузное печенье, кормовой кукурузный жмых, кукурузная мука, кукурузный глютеновый корм, семена кукурузы, гранулированный корм из маниоки, мясо в муке из маниоки, мясо свежее и подвергнутое тепловой обработке¹) (говядина, свинина, курица и индейка), мякоть дыни, семена дыни, рубленое мясо, ингредиенты мюсли, мюсли¹), побеги золотистой фасоли¹), семена овса, клубни картофеля, кормовой рапсовый жмых, «глупаколца», семена рапса, колбаса (реализуемая в ломтиках¹) и комбинированная¹) (см. А. 1.2 для усовершенствованного метода экстракции ДНК), шницель, суповые шарики, соевый белок в мясных продуктах¹), соевый лецитин (необработанный коричневый и желтый рафинированный¹)), побеги сои¹), соевые напитки, соя, соевый крем, кормовой соевый жмых, соевый творог, соус для спагетти¹), семена полбы, сахарная свекла (сушеный жом), сахарная свекла (свежие корнеплоды), семена сахарной свеклы, семена подсолнечника, тофу (японский соевый творог), свежие томаты, томатная паста¹), семена томатов, вегетарианский гамбургер, вафли (с шоколадом¹) и без шоколада¹)), пшеничные отруби, пшеничная мука, глютеновый корм из пшеницы, семена пшеницы, крупка из твердой пшеницы, йогурт¹) (см. А.1.3 для усовершенствованного метода экстрагирования).

А.1.2 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для заквасочных культур колбас, подвергаемых ферментации

А. 1.2.1 Общие положения

Этот метод предназначен для экстракции суммарной ДНК, включая бактериальную геномную ДНК, из колбас. Применимость метода для получения ДНК высокого качества, пригодной для специфического обнаружения рекомбинантной ДНК с использованием ПЦР, была продемонстрирована на колбасах, подвергнутых ферментации [6], а также на колбасах, подвергнутых ферментации и термической обработке, так называемых «летних колбасах» [7]. Кроме того, было показано, что настоящий метод экстракции пригоден для выделения суммарной ДНК из сливок специально для обнаружения Staphylococcus aureus в этом пищевом продукте [8]. (Перечень продуктов, для которых применим этот метод, приведен в А. 1.2.8).

А. 1.2.2 Статус валидации

Этот метод был проверен при межлабораторном исследовании проб массой 0,4 г (см. А.1.2.9).

А. 1.2.3 Принцип метода

Метод заключается в выделении бактериальных клеток из пищевого продукта путем гомогенизации проб колбас с последующим центрифугированием. Полученный осадок содержит не только бактериальные клетки, но также и частицы мяса. Для проведения специфического лизиса бактериальных клеток их оболочки расщепляют, добавляя лизоцим. Для улучшения расщепления клеточных оболочек молочнокислых бактерий может быть добавлен мутанолизин. Полный лизис клеток происходит при добавлении детергента SDS (додецилсульфата натрия) и протеиназы-К, а затем несколько раз проводится экстрагирование водной фазы фенолом и/или хлороформом. Стадия экстрагирования фенолом/хлороформом является важной для устранения любой нуклеазной активности и ингибиторов ПЦР, включая те, которые возникли из пищевого продукта (например гематина). Последним этапом является осаждение ДНК этиловым спиртом.

А. 1.2.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

А. 1.2.5 Реактивы

А. 1.2.5.1 Изопропанол [СН₃СН(ОН)СН₃].

А. 1.2.5.2 Этиловый спирт, С₂Н₅ОН, 96 %-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А. 1.2.5.3 Ледяная уксусная кислота, СН₃СООН.

А. 1.2.5.4 Соляная кислота, HCI, 37 %-ная.

А. 1.2.5.5 Натрия гидроксид, NaOH.

А.1.2.5.6 Изоамиловый спирт [(СН₃)₂СНСН₂СН₂ОН)].

А. 1.2.5.7 Фенол, С₆Н₅ОН.

А. 1.2.5.8 Хлороформ, СНС1₃.

А.1.2.5.9 Трис (оксиметил) аминометан (Трис), C^-^NO-j.

А. 1.2.5.10 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль, (№₂ЭДТА), Ci₀Hi₄N2O₈N^a2.

А. 1.2.5.11 Натрия додецилсульфат (SDS),

^ Повторяемость может зависеть от партии продукта и/или технологии его получения. В некоторых случаях ДНК не может быть обнаружена или она подверглась расщеплению таким образом, что результаты ПЦР оказываются ниже предела обнаружения метода независимо от используемых праймеров и/или протоколов ПЦР. Это может быть причиной низкой воспроизводимости результатов между лабораториями.

А.1.2.5.12 Лизоцим

50000 ед./мг белка (1 ед. будет давать ^450= 0,001 в минуту при 6,24 ед. pH и температуре 25 °С, используя суспензию Micrococcus lysodeikticus в качестве субстрата, в 2,6 см³ реакционной смеси при длине оптического пути 1 см).

А. 1.2.5.13 Сахароза, ^С12^Н12°1Т

А.1.2.5.14 Протеиназа-К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

А. 1.2.5.15 Натрия ацетат (C₂H₃0₂Na).

А.1.2.5.16 Уравновешенный фенол

Используют фенол, уравновешенный буферным раствором Трис/HCI (> 7,8 ед. pH) или приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.

А.1.2.5.17 Смесь хлороформ — изоамиловый спирт

Смешивают 24 объемные части хлороформа (А. 1.2.5.8) и одну объемную часть изоамилового спирта (А.1.2.5.6).

А.1.2.5.18 Смесь фенол — хлороформ — изоамиловый спирт

Смешивают 25 объемных частей уравновешенного фенола (А.1.2.5.16) с 24 объемными частями хлороформа (А.1.2.5.8) и одной объемной частью изоамилового спирта (А.1.2.5.6).

А.1.2.5.19 Раствор мутанолизина в стерильной воде, содержащий 500 или 5000 ед./см³ мутанолизина

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °С, избегая многократного замораживания и оттаивания.

А.1.2.5.20 Раствор лизоцима в стерильной воде концентрацией 10 мг/см³

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °С, избегая многократного замораживания и оттаивания.

А.1.2.5.21 Раствор сахарозы, С^Н^О^, 400 г/дм³.

А.1.2.5.22 Буферный раствор А, (Трис) = 0,020 моль/дм³, (Ыа₂ЭДТА) = 0,020 моль/дм³, (NaCI) = 0,1 моль/дм³

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCI или NaOH.

А.1.2.5.23 Буфер для экстрагирования/лизиса, содержащий одну объемную часть буфера А (А.1.2.5.22) и одну объемную часть раствора сахарозы (А.1.2.5.21).

А.1.2.5.24 Раствор SDS, (SDS) = 250 г/дм³

А.1.2.5.25 Раствор протеиназы-К концентрацией 20 мг/см³

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °С, избегая многократного замораживания и оттаивания.

А.1.2.5.26 Раствор этилового спирта, С₂Н₅ОН, 70 %-ный

Следует хранить при температуре и использовать при температуре минус 20 °С.

А.1.2.5.27 Раствор натрия ацетата, C₂H₃0₂Na концентрацией 3 моль/дм³

Доводят значение pH до 5,2 единиц ледяной уксусной кислотой.

А.1.2.5.28 Буфер ТЕ, (Трис) = 0,010 моль/дм³, (Ыа₂ЭДТА) = 0,001 моль/дм³

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCI или NaOH.

А.1.2.6 Оборудование

А. 1.2.6.1 Инструменты для измельчения пробы (например, скальпель).

А.1.2.6.2 Центрифуга, поддерживающая ускорение, как минимум, 12000д. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А.1.2.6.3 Водяная баня или инкубатор.

А. 1.2.6.4 Вакуумная сушилка (при необходимости).

А.1.2.6.5 Смеситель, например, Vortex.

А.1.2.7 Методика

А.1.2.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК. При изменении размера навески пробы требуется соответственно масштабировать массу реактивов и объемы буферов.

А.1.2.7.2 Приготовление пробы

Измельчают колбасу, гомогенизируют и добавляют к 200—500 мг гомогената три объема воды (до 1,5 см³). Выдерживают при комнатной температуре приблизительно 10 мин.

А.1.2.7.3 Методика выделения ДНК

Осторожно переносят 500 мм³ водной фазы (суспензии) в новую пробирку. Центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 12000д.

Надосадочную жидкость отбрасывают и повторно растворяют осадок в 500 мм³ буфера для экстрагирования/лизиса (А.1.2.5.23).

Добавляют 50 мм³ раствора лизоцима (А.1.2.5.20). Инкубируют при температуре 37 °С в течение 1 ч. Если результаты неудовлетворительные, можно добавить к лизоциму 10 ед. мутанолизина (А.1.2.5.19). Однако перед систематическим применением необходимо проверить специфичное для продукта воздействие этой добавки.

Добавляют 25 мм³ раствора SDS (А.1.2.5.24) и 25 мм³ раствора протеиназы-К (А.1.2.5.25), затем инкубируют в течение 10 мин при температуре 60 °С.

10

ГОСТ Р ИСО 21571-2014

Добавляют один объем смеси фенол —хлороформ — изоамиловый спирт (А. 1.2.5.18) и перемешивают.

Центрифугируют смесь в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000д. Переносят верхнюю водную фазу в новую пробирку.

Добавляют один объем смеси хлороформ — изоамиловый спирт (А.1.2.5.17) и перемешивают.

Центрифугируют смесь в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000д. Переносят верхнюю фазу в новую пробирку.

Добавляют 0,1 объема раствора ацетата натрия (А. 1.2.5.27) и один объем изопропанола (А. 1.2.5.1). Осторожно перемешивают несколько раз путем переворачивания пробирки.

Выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении приблизительно 12000д. Надосадочную жидкость удаляют.

Осадок после центрифугирования тщательно промывают не менее 500 мм³ раствора этилового спирта (А. 1.2.5.26), осторожно перемешивают, несколько раз переворачивая пробирку. Центрифугируют смесь в течение 10 мин при ускорении приблизительно 12000д. Эта стадия является особенно важной для удаления осаждающихся солей, которые могут оказать влияние на последующий анализ (например, ПЦР).

Надосадочную жидкость отбрасывают.

Осадок после центрифугирования высушивают и повторно растворяют его в 100 мм³ воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А. 1.2.5.28). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

А.1.2.8 Перечень примеров

См. таблицу А.1.

Таблица А. 1 — Перечень продуктов, к которым был успешно применен данный метод

Успешно проанализированный продукт Микроорганизм Ссылка Колбаса, подвергнутая ферментации Lactobacillus curvatus [6] «Летняя колбаса» (обработанная термически) Lactobacillus curvatus [7] Сливки Staphylococcus aureus [8]

А. 1.2.9 Эффективность применения метода

Данные по эффективности применения, приведенные в таблице А.2, были получены в результате совместного исследования, выполненного рабочей группой «Разработка методов идентификации пищевых продуктов, полученных с использованием способов генной инженерии» Комиссии Федерального управления по охране здоровья Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах [6].

При проведении этого исследования два образца дали ложноположительные результаты, вызванные, возможно, недостатками упаковки. Для данного исследования мутанолизин не использовался.

Таблица А.2 — Данные эффективности применения метода

Количество участвующих лабораторий Количество образцов колбасы на лабораторию Общее количество образцов Количество корректно идентифицированных образцов 15 10 150 148

А.1.3 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для заквасочных культур йогурта

А.1.3.1 Общие положения

Настоящий метод описывает процедуру экстрагирования основной массы ДНК из заквасочных культур, используемых для ферментации йогурта из молочных продуктов. Эта методика успешно применяется для обычных йогуртов, включая йогурты, содержащие различные ингредиенты, такие как фрукты, добавки и стабилизаторы, а также для продуктов с различным содержанием жира (см. А. 1.3.8 и [9]—[11]). Из йогуртов, подвергнутых термической обработке [12], также экстрагируется ДНК, пригодная для ПЦР.

А. 1.3.2 Статус валидации

Этот метод был проверен при межлабораторном исследовании (см. А.1.3.9).

А. 1.3.3 Принцип метода

Этот метод основывается на способе выделения ДНК с помощью фенола/ хлороформа, который адаптирован к специальному пищевому продукту. Грамположительные заквасочные культуры йогуртов концентрируются после расщепления коагулированного казеина при щелочном pH. Выделенные клетки повторно суспендируют в буферном водном растворе и обрабатывают лизоцимом (и мутанолизином) для расщепления клеточных оболочек. Лизис клеток происходит при добавлении ионного детергента, такого как додецилсульфат натрия (SDS). Белки удаляют путем обработки протеиназой-К, а затем экстрагируют смесью фенол — хлороформ и хлороформом в несколько стадий. Последней стадией является осаждение ДНК этиловым спиртом.

А. 1.3.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

11

А.1.3.5 Реактивы

А.1.3.5.1 Изопропанол [СН₃СН(ОН)СН₃].

А.1.3.5.2 Этиловый спирт, С₂Н₅ОН, 96 %-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А.1.3.5.3 Ледяная уксусная кислота, СН₃СООН.

А.1.3.5.4 Хлорид натрия, NaCI.

А.1.3.5.5 Цитрат натрия, C₆H₅Na₃0₇.

А.1.3.5.6 Соляная кислота, HCI, 37 %-ная.

А.1.3.5.7 Гидроксид натрия, NaOH.

А.1.3.5.8 Изоамиловый спирт Г(СНо),СНСН,СН,(ОН)1.

А.1.3.5.9 Фенол, С₆Н₅ОН.

А.1.3.5.10 Хлороформ, СНС1₃.

А.1.3.5.11 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), C₄H₁₁N0₃.

А.1.3.5.12 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (Ыа₂ЭДТА), C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂.

А.1.3.5.13 Додецилсульфат натрия (SDS), ^12^25^4® ^а.

А.1.3.5.14 Лизоцим, 50000 ед./мг белка (1 ед. будет давать АА₄₅₀ = 0,001 в минуту при 6,24 ед pH итемпера-туре 25 °С, используя суспензию Micrococcus lysodeikticus в качестве субстрата, в 2,6 см³ реакционной смеси при оптической длине пути 1 см).

А.1.3.5.15 Сахароза, С^₂Н₂₂0^.

А.1.3.5.16 Протеиназа-К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

А.1.3.5.17 Ацетат натрия, C₂H₃0₂Na.

А.1.3.5.18 Раствор цитрата натрия, C₆H₅Na₃0₇, 400 г/дм³.

А.1.3.5.19 Раствор гидроксида натрия, NaOH, 0,4 моль/дм³

Растворяют в стерильной воде. Автоклавирование не допускается. Перед использованием готовят свежий раствор.

А.1.3.5.20 Раствор хлорида натрия/цитрата натрия (SSC 5*, концентрированный 5-кратный основной раствор), (NaCI), 0,75 моль/дм³, (C₆H₅Na₃0₇), 0,075 моль/дм³.

Целесообразно готовить концентрированный основной раствор SSC 20* (например, 20-кратный основной раствор, так как растворы с высокой концентрацией солей обычно более устойчивы). Разбавляют перед использованием.

А.1.3.5.21 Уравновешенный фенол

Используется фенол со значением 8,0 ед. pH и уравновешенный буфером Трис/HCI (> 7,8 ед. pH) или, например, приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.

А.1.3.5.22 Смесь хлороформ — изоамиловый спирт

Смешивают 24 объемные части хлороформа (А.1.3.5.10) и одну объемную часть изоамилового спирта

(А.1.3.5.8).

А.1.3.5.23 Смесь фенол —хлороформ — изоамиловый спирт

Смешивают 25 объемных частей насыщенного фенола (А. 1.3.5.21) с 24 объемными частями хлороформа (А.1.3.5.10) и одной объемной частью изоамилового спирта (А.1.3.5.8).

А.1.3.5.24 Раствор мутанолизина в стерильной воде, содержащий 500 или 5000 ед./см³ мутанолизина Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °С, избегать многократного замораживания и оттаивания.

А.1.3.5.25 Раствор лизоцима в стерильной воде, содержащий 10 мг/см³ лизоцима

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °С, избегать многократного замораживания и оттаивания

А.1.3.5.26 Раствор сахарозы, С^Н^О^, 400 г/дм³.

А.1.3.5.27 Буферный раствор А, (Трис), 0,020 моль/дм³, (Иа₂ЭДТА), 0,020 моль/дм³, (NaCI), 0,100 моль/дм³ Доводят значение до 8,0 ед. pH, используя HCI или NaOH.

А.1.3.5.28 Буфер для экстрагирования/лизиса, содержащий 1 объемную часть буферного раствора А (А.1.3.5.27) и одну объемную часть раствора сахарозы (А.1.3.5.26).

А.1.3.5.29 Раствор SDS, (SDS), 250 г/дм³

А.1.3.5.30 Раствор протеиназы-К в стерильной воде, 20 мг/см³

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 °С, избегать многократного замораживания и оттаивания.

А.1.3.5.31 Раствор этилового спирта, (С₂Н₅ОН), 70 %-ный Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А.1.3.5.32 Раствор ацетата натрия, (C₂H₃0₂Na), 3 моль/дм³ Доводят значение pH до 5,2 ед. pH ледяной уксусной кислотой.

А.1.3.5.33 Буфер ТЕ, (Трис), 0,010 моль/дм³, (Иа₂ЭДТА), 0,001 моль/дм³ Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCI или NaOH.

А.1.3.6 Оборудование

Применяется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

ГОСТ Р ИСО 21571-2014

А. 1.3.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение не менее 12000д. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А. 1.3.6.2 Водяная баня или инкубатор.

А. 1.3.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).

А. 1.3.6.4 Смеситель, например, Vortex®.

А. 1.3.7 Методика

А. 1.3.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления навески анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК.

При изменении размера пробы требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы буферов.

А. 1.3.7.2 Методика экстракции ДНК

Йогурт хорошо встряхивают или перемешивают. Переносят 250 мм³ йогурта в пробирку вместимостью 2 см³. Добавляют 80 мм³ раствора цитрата натрия (А. 1.3.5.18). Добавляют 150 мм³ раствора NaOH (А. 1.3.5.19) и хорошо перемешивают. Центрифугируют при ускорении 12000д в течение 2 мин.

Осадок после центрифугирования должен иметь диаметр не более 0,7 см и занимать объем не более 100 мм³. В противном случае указанные стадии (добавление 80 мм³ раствора цитрата натрия и 150 мм³ раствора NaOH) необходимо повторить.

Отбрасывают верхний слой жира и образовавшийся верхний водный слой и осадок после центрифугирования повторно суспендируют в 500 мм³ раствора SSC 5* (А. 1.3.5.20). Центрифугируют не менее 2 мин при ускорении приблизительно 12000д. Надосадочную жидкость отбрасывают. Повторно суспендируют осадок после центрифугирования в 500 мм³ раствора SSC 5*. Центрифугируют в течение 2 мин при ускорении приблизительно 12000д. Надосадочную жидкость отбрасывают.

Осадок после центрифугирования повторно суспендируют в 500 мм³ буфера для экстрагирования/лизи-са (А.1.3.5.28). Добавляют 50 мм³ раствора лизоцима (А.1.3.5.25). Инкубируют при температуре 37 °С в течение 1 ч. Если результаты неудовлетворительные, к раствору лизоцима может быть добавлено 10 ед. мутанолизина (А.1.3.5.24). Однако перед систематическим применением необходимо проверить воздействие этой добавки для соответствующего продукта.

Добавляют 25 мм³ раствора SDS (А.1.3.5.29) и 25 мм³ раствора протеиназы-К (А.1.3.5.30). Инкубируют в течение 10 мин при температуре 60 °С. Добавляют 500 мм³ смеси фенол —хлороформ — изоамиловый спирт (А.1.3.5.23) и перемешивают. Центрифугируют в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000д. Переносят верхнюю водную фазу в новую пробирку. Добавляют один объем смеси хлороформ — изоамиловый спирт (А.1.3.5.22) и перемешивают. Центрифугируют в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000д.

Переносят верхнюю фазу в новую пробирку. Добавляют 0,1 объема раствора ацетата натрия (А.1.3.5.32) и один объем изопропанола (А.1.3.5.1). Выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении приблизительно 12000д. Надосадочную жидкость отбрасывают. Тщательно промывают осадок после центрифугирования не менее 500 мм³ раствора этилового спирта (А. 1.3.5.31). Центрифугируют смесь в течение 10 мин при ускорении приблизительно 12000д. Эта стадия является очень важной для удаления осаждающихся солей, которые могут оказывать влияние на последующий анализ (например, ПЦР).

Надосадочную жидкость отбрасывают.

Осадок после центрифугирования высушивают и повторно растворяют его в 100 мм³ воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А. 1.3.5.33). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

А.1.3.8 Перечень примеров

См. таблицу А.З.

Таблица А.З — Перечень продуктов, к которым был успешно применен описанный метод

Успешно проанализированный продукт Содержание, добавки и т. д. Микроорганизм Ссылка Обычный йогурт 0,3 % жира, 3,5 % жира Streptococcus thermophilus [9], [11] Фруктовые йогурты 1.5    % жира, модифицированный крахмал, лесной орех, желатин 1.5    % жира, 3,8 % белка, аспартам, ацесульфам, ананас 3.5    %жира, ароматизатор, желатин, персик, кокосовый орех 10% жира, модифицированный крахмал, лимон, ароматизатор, миндаль, пектин, каротин, рибофлавин Streptococcus thermophilus [9] Обычный йогурт, подвергнутый термообработке 3,5 % жира Streptococcus thermophilus [12]

А.1.3.9 Эффективность применения метода

Данные по эффективности применения методики, приведенные в таблице А.4, были получены в результате совместного исследования, выполненного рабочей группой «Разработка методов идентификации пищевых продуктов, полученных с использованием способов генной инженерии» Комиссии Федерального управления по охране здоровья Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах [11].

При проведении этого исследования две лаборатории не выполнили проверку гибридизацией. Для данного исследования мутанолизин не использовался.

Таблица А.4 — Данные по эффективности применения метода

Количество участвующих лабораторий Количество образцов йогурта на лабораторию Общее количество образцов Количество корректно идентифицированных образцов 20 10 200 200 (99 контрольных образцов и 101 образец с ГМО)

А.1.4 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для дрожжей и/или гифомицетов, собранных с пищевых продуктов

А. 1.4.1 Общие положения

Данный метод описывает одноступенчатое выделение и очистку ДНК, пригодной для ПЦР, из дрожжей, гифомицетов [13] или выделенных микробных популяций. Метод применим для выделения ДНК из генетически модифицированных микроорганизмов в продуктах очень сложного состава [14], [15]. Метод может использоваться для выделения общей ДНК из продукта [14], [15] или из микробной фракции, которая непосредственно выделена из продукта либо собрана из заквасочных культур (колонии на жидких или агаровых средах).

Примечание — Предварительное выделение микробной фракции из образца для анализа дает наиболее достоверные результаты при выделении ДНК.

Общую ДНК из продукта выделяют с помощью альтернативных методов, приведенных в приложении А. Однако эти методы не гарантируют, что достаточное количество ДНК будет выделено из всех микроорганизмов (особенно из грибов, устойчивых к лизису, или грамотрицательных бактерий). Данный метод может использоваться для выделения общей ДНК из таких продуктов, как йогурт, молоко или сыр. Однако достоверное хорошее выделение ДНК обеспечивается только для тонкоизмелыенных или размолотых твердых продуктов. В силу этого перед применением метода его эффективность необходимо всегда проверять на ДНК основного исследуемого продукта.

А. 1.4.2 Статус валидации

Этот метод выделения ДНК был применен и проверен [13] на представителях 25 родов грибов, представляющих 325 видов (включая дрожжи, используемые в хлебопекарном производстве или виноделии, и Penicillia spp. [16], используемые производителями голубого сыра), в форме мицелия и спор (среди которых виды, наиболее устойчивые к лизису, например Aspergillus fumigatus и Cryptococcus neoformans). Данный метод был разработан таким образом, чтобы избежать лабораторного загрязнения и загрязнения между пробами. Такое свойство метода позволяет применять его для проведения систематического выделения ДНК и в больших объемах и применения ее для ПЦР При применении метода не было обнаружено изменений качества матрицы ДНК при качественной ПЦР после долгосрочного хранения при температуре минус 20 °С в течение по крайней мере пяти лет или вариаций между различными препаратами ДНК из одного и того же организма. Несмотря на то, что качество выделенной данным методом ДНК подходит для качественной ПЦР она может подвергаться недостаточному расщеплению в процессе рестрикционного анализа. Однако для использования ДНК, полученной данным методом, для количественной ПЦР необходимо выполнить процедуру ее дополнительной очистки с применением другого метода, например такого, который описан в А.4.

А.1.4.3 Принцип метода

Как правило, бактерии, дрожжи или мицелий разрушаются при перемешивании с высокой скоростью в присутствии стеклянных шариков в смеси Трис — фенол — хлороформ — ЭДТА— SDS, а затем ДНК осаждается этиловым спиртом.

А. 1.4.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

А. 1.4.5 Реактивы

А.1.4.5.1 Этиловый спирт, С₂Н₅ОН, 96 %-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А.1.4.5.2 Ледяная уксусная кислота, СН₃СООН.

А.1.4.5.3 Серная кислота, H₂S0₄, > 90 %.

А.1.4.5.4 Бикарбонат калия, КНСО_э.

А.1.4.5.5 Ацетат калия, С₂Н₃0₂К.

А.1.4.5.6 Соляная кислота, HCI, 37 %-ная.

А.1.4.5.7 Изоамиловый спирт [(СН₃)₂СНСН₂СН₂ОН].

ГОСТ Р ИСО 21571-2014

А. 1.4.5.8 Фенол, С₆Н₅ОН.

А. 1.4.5.9 Хлороформ, СНС1₃.

А. 1.4.5.10 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), СдН^ЫОз.

А. 1.4.5.11 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (№₂ЭДТА), C₁₀H₁₄N₂O₈Na2.

А. 1.4.5.12 Гидроксид калия, КОН.

А. 1.4.5.13 Додецилсульфат натрия (SDS),

А. 1.4.5.14 Рибонуклеаза-А, выделенная из бычьей поджелудочной железы, свободная от дезоксирибонуклеазы, приблизительно 50 ед./мг лиофилизата.

А. 1.4.5.15 Уравновешенный фенол, > 7,8 ед. pH

Используют фенол (А.1.4.5.8), приготовленный в соответствии с [5] или (по выбору) полностью уравновешенный буфером для экстрагирования (А. 1.4.5.18) без SDS или в соответствии с рекомендациями изготовителя.

А. 1.4.5.16 Смесь хлороформ — изоамиловый спирт

Смешивают 24 объемные части хлороформа (А. 1.4.5.9) с одной объемной частью изоамилового спирта (А.1.4.5.7).

А. 1.4.5.17 Смесь фенол —хлороформ — изоамиловый спирт

Смешивают одну объемную часть насыщенного фенола (А. 1.4.5.15) с одной объемной частью смеси хлороформ — изоамиловый спирт (А.1.4.5.16).

А. 1.4.5.18 Буфер для экстрагирования/лизиса, (Трис) = 0,050 моль/дм³, (К₂ЭДТА) = 0,050 моль/дм³, (SDS) = 30 г/дм³

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCI или NaOH.

А. 1.4.5.19 Буфер ТЕ, (Трис) = 0,010 моль/дм³, (К₂ЭДТА) = 0,001 моль/дм³

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCI или NaOH.

А. 1.4.5.20 Раствор рибонуклеазы-А, =10 мг/см³ лиофилизата.

Следует хранить при температуре минус 20 °С.

А. 1.4.5.21 Раствор этилового спирта, С₂Н₅ОН, 70 %-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А. 1.4.5.22 Раствор ацетата калия, (С₂Н₃0₂К) = 3 моль/дм³

Доводят значение pH до 5,2 ед. pH ледяной уксусной кислотой. Автоклавирование не допускается. При необходимости пропускают через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

А. 1.4.5.23 Кондиционированные стеклянные шарики

Стеклянные шарики диаметром 0,2—0,5 мм выдерживают в течение ночи в концентрированной серной кислоте (А.1.4.5.3). Промывают их стерильной водой, кипятят в растворе КНС0₃ (А.1.4.5.24), снова промывают стерильной водой и высушивают при температуре 80 °С в вакууме [13], [14].

А.1.4.5.24 Раствор бикарбоната калия, (КНС0₃) = 50 г/дм³

Используют свежеприготовленный водный раствор.

А. 1.4.6 Оборудование

Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

А. 1.4.6.1 Встряхиватель для полиэтиленовых микропробирок вместимостью 2 см³ с навинчивающимися колпачками. Скорость встряхивания — не менее 100 встряхиваний/мин (например, Mini-BeadBeater™¹)).

А. 1.4.6.2 Микропробирки, полиэтиленовые пробирки вместимостью 2 см³ с кольцевым уплотнением и навинчивающимися колпачками.

А. 1.4.6.3 Устройство для фильтрования, фильтры из стекловолокна диаметром 25 мм.

А. 1.4.6.4 Центрифуга с ускорением как минимум 10000 д, с ротором, способным удерживать микропробирки вместимостью 2 см³.

На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А. 1.4.6.5 Водяная баня или инкубатор.

А. 1.4.6.6 Вакуумная сушилка (при необходимости). Рекомендуется для приготовления стеклянных шариков (А.1.4.5.23).

А. 1.4.6.7 Смеситель, например, Vortex®.

А. 1.4.7 Методика

А. 1.4.7.1 Приготовление анализируемой пробы и микробной фракции

Методы выделения микробных фракций, использующие этап обогащения, могут быть приведены в нормативных правовых актах по микробиологическому контролю пищевой продукции. Микробная фракция, полученная после этапа обогащения, может быть использована для выделения ДНК.

Исходя из анализируемой пробы объемом 1—2 см³ выделяют микробиологическую популяцию соответствующим образом (см. А. 1.3). В качестве альтернативы дрожжи или гифомицеты, выделенные из навески образца,

^ Mini-BeadBeater — это пример коммерчески доступного оборудования Biospec products, пригодного для использования с описываемым методом. Эта информация приводится исключительно для информации пользователей настоящего стандарта и ни при каких условиях не может служить рекомендацией или одобрением конкретного типа оборудования. Допускается использование аналогичного оборудования, при условии, что оно позволяет получать такие же результаты.

могут культивироваться как заквасочные культуры. В обоих случаях микроорганизмы собираются и подвергаются дальнейшей обработке в соответствии с А.1.4.7.2 или хранятся при температуре минус 20 °С до начала обработки.

А.1.4.7.2 Выделение ДНК

А.1.4.7.2.1 Мицелий, собранный на фильтре из стекловолокна, дважды промывают буфером для экстра-гирования/лизиса (А. 1.4.5.18), не содержащим SDS. Мицелиальную пленку снимают с фильтра и переносят ее в микропробирку вместимостью 2 см³ с навинчивающимся колпачком (А. 1.4.6.2), содержащую 600 мм³ буфера для экстрагирования/лизиса (А.1.4.5.18) и 600 мм³ смеси фенол —хлороформ — изоамиловый спирт (А. 1.4.5.17) и наполовину заполненную кондиционированными стеклянными шариками (А. 1.4.5.23). Дальнейшая обработка описана в А.1.4.7.2.3.

А.1.4.7.2.2 С осадками после центрифугирования либо общей микробной популяции, бактерий, мицелия, дрожжей, либо дрожжеподобных микроорганизмов необходимо выполнить следующие процедуры. Клетки промывают один раз 1 см³ буфера для экстрагирования/лизиса (А.1.4.5.18), не содержащего SDS, центрифугируют при ускорении от 10000д до 13000д в течение 10 мин, повторяют по меньшей мере еще один раз, затем повторно растворяют в 600 мм³ буфера для экстрагирования/лизиса (А.1.4.5.18) и переносят в микропробирку, содержащую стеклянные шарики и смесь фенол-хлороформ, как указано в А.1.4.7.2.1.

А.1.4.7.2.3 После стадии А.1.4.7.2.1 или А.1.4.7.2.2 содержимое микропробирки перемешивают на встряхи-вателе (А. 1.4.6.1) со скоростью не менее 100 встряхиваний/мин в течение 1—2 мин, затем немедленно инкубируют при температуре 65 °С в течение от 30 до 120 мин. Центрифугируют при ускорении от 10000 до 13000 д в течение 10 мин. Переносят образовавшийся верхний слой в новую микропробирку.

В случае применения ДНК для дальнейшей количественной ПЦР необходимо выполнить следующие процедуры. После 30 мин инкубирования содержимое микропробирки центрифугируют при ускорении от ЮОООддо 13000д в течение 15 мин. Переносят образовавшийся верхний слой в новую микропробирку. Добавляют рибонуклеазу-А (А.1.4.5.20) до конечной массовой концентрации 0,001 мг/см³ и инкубируют еще в течение 30—90 мин при температуре 65 °С.

Добавляют раствор ацетата калия (А.1.4.5.22) до конечной молярной концентрации 0,3 моль/дм³. Перемешивают, добавляют 1,2 см³ этилового спирта (А. 1.4.5.1) и инкубируют в течение ночи при температуре минус 20 °С или в течение 1 ч при температуре минус 80 °С. ДНК осаждают центрифугированием при ускорении от ЮОООд до 1ЗОООд в течение 15 мин при температуре минус 4 °С.

После центрифугирования осадок ДНК осторожно промывают раствором этилового спирта (А. 1.4.5.21). Сливают образовавшийся сверху слой на бумагу и высушивают содержимое микропробирки в вакууме. ДНК растворяют в 50—100 мм³ воды. Допускается длительное (до пяти лет) хранение при температуре минус 20 °С. На основании проведенных проверок [13] допускается использование воды вместо буфера ТЕ (А.1.4.5.19). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

А.1.4.8 Перечень примеров

Количество исследованных видов/штаммов указывается в скобках:

Absidia corymbifera (1), Acremonium spp. (2), Aspergillus spp. (119), Candida spp. (7), Cladosporium spp. (2), Cryptococcus spp. (6), Epidermophyton floccosum (1), Fusarium solani (1), Malbranchea pulchella (1), Geotrichum spp. (2), Microsporum canis (1), Paeciiomyces spp. (2), Penicillium spp. (20), Pityrosporum ovale (1), Rhizopus spp. (2), Saccharomyces cerevisiae (1), Schizosaccharomyces pombe (1), Scopu-lariopsis brevicaulis (1), Trichoderma spp. (124), Trichophyton spp. (2), Trichosporon spp. (2), Ulocladium botrytis (1), Verticillium tenerum (1).

A. 1.4.9 Эффективность применения метода

Эффективность метода проверялась в отношении грибов [13]. При количественном анализе эффективности выделения было установлено, что использование дробления с помощью стеклянных шариков было наиболее эффективным [18].

А.2 Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе

поливинилпирролидона(ПВП)

А.2.1 Основной метод на основе ПВП

А.2.1.1 Общие положения

Этот простой, быстрый и дешевый метод [19] пригоден для большой группы продуктов, особенно содержащих большие количества полифенольных соединений.

А.2.1.2 Статус валидации

Этот метод был проверен путем внутрилабораторных исследований и применяется для систематического выделения ДНК во многих лабораториях. Данный метод еще не оценивался путем официальных межлабораторных исследований.

А.2.1.3 Принцип

Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия и высокой концентрации ЭДТА) и последующее удаление из водной фазы, содержащей ДНК, загрязняющих примесей, например полифенольных молекул, полисахаридов, метаболитов и растворимых белков, с помощью ПВП в комбинации с ацетатом аммония. Последним этапом является осаждение ДНК этанолом, что концентрирует ДНК и очищает ее от солей (см. [19]—[23]).

16

ГОСТ Р ИСО 21571-2014

Содержание

1    Область применения.................................................................1

2    Нормативные ссылки.................................................................1

3    Принципы..........................................................................1

3.1 Общие положения................................................................1

3.2    Экстракция ДНК..................................................................2

3.3    Количественная оценка содержания ДНК.............................................2

4    Общие требования к лаборатории......................................................2

5    Методика...........................................................................2

5.1    Приготовление проб для анализа...................................................2

5.2    Экстракция и очистка ДНК.........................................................4

5.3    Количественная оценка экстрагированной ДНК........................................5

5.4    Стабильность выделенной ДНК.....................................................6

6    Оценка результатов..................................................................6

7    Протокол испытаний..................................................................6

Приложение А (обязательное) Методы экстракции ДНК......................................7

А.1 Получение применимой для ПЦР ДНК методами экстракции ДНК на основе фенола/

хлороформа........................................................................7

А. 1.1 Основной метод на основе фенола/хпороформа.....................................7

А.1.2 Метод на основе фенола/хпороформа. Процедура для заквасочных культур колбас,

подвергаемых ферментации..........................................................9

А.1.3 Метод на основе фенола/хпороформа. Процедура для заквасочных культур йогурта......11

А.1.4 Метод на основе фенола/хпороформа. Процедура для дрожжей и/или гифомицетов,

собранных с пищевых продуктов......................................................14

А.2 Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе

поливинилпирролидона (ПВП)........................................................16

А.2.1 Основной метод на основе ПВП..................................................16

А.З Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе ЦТАБ.........18

А.3.1 Основной метод на основе ЦТАБ.................................................18

А.4 Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе диоксида

кремния..........................................................................20

А.4.1 Основной метод на основе диоксида кремния......................................20

А.5 Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе

гуанидина-хпороформа..............................................................22

А.5.1 Основной метод на основе гуанидина-хпороформа..................................22

A. 5.2 Гуанидин хлороформный метод: Протокол для соевого лецитина......................24

Приложение В (обязательное) Методы количественной оценки выделенной ДНК................30

B. 1 Основной метод ультрафиолетовой спектрометрии...................................30

В.2 Метод электрофореза в агарозном геле и окрашивания бромистым этидием..............31

В.З Метод ПЦР в реальном времени для количественного анализа выделенной ДНК..........34

Приложение ДА (справочное) Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов

ссылочным национальным стандартам Российской Федерации.................35

Библиография.......................................................................36

ГОСТ Р ИСО 21571-2014

А.2.1.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

А.2.1.5 Реактивы

А.2.1.5.1 Этиловый спирт, С₂Н₅ОН, 96 %-ный.

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А.2.1.5.2 Изопропанол, СН₃СНОНСН₃.

А.2.1.5.3 Поливинилпирролидон (ПВП), молекулярная масса М= 360 кДа; характеристическая вязкость (значение К) = 80—100¹).

А.2.1.5.4 Ледяная уксусная кислота, СН₃СООН.

А.2.1.5.5 Соляная кислота, HCI, 37 %-ная.

А.2.1.5.6 Хлорид натрия, NaCI.

А.2.1.5.7 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), C^^NO^

А.2.1.5.8 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (№₂ЭДТА),

А.2.1.5.9 Додецилсульфат натрия (SDS), ^12^2504® ^а.

А.2.1.5.10 Ацетат аммония, C₂H₃0₂NH₄.

А.2.1.5.11 Раствор этилового спирта, С₂Н₅ОН, 70 %-ный.

Следует хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А.2.1.5.12 Буфер для экстрагирования, pH = 8,0 ед., (Трис) = 0,2 моль/дм³, (NaCI) = 0,250 моль/дм³, (Ыа₂ЭДТА) = = 0,025 моль/дм³, (SDS) = 50 г/дм³.

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH , используя HCI или NaOH.

А.2.1.5.13 Раствор ацетата аммония, (NH₄C₂H₃0₂) = 7,5 моль/дм³.

Растворяют в стерильной воде. При необходимости пропускают через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

А.2.1.5.14 Буфер ТЕ, (Трис) = 0,010 моль/дм³, (№₂ЭДТА) = 0,001 моль/дм³.

Доводят значение pH до 8,0 ед. pH, используя HCI или NaOH.

А.2.1.6 Оборудование

Необходимо использовать обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

А.2.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение 10000 д.

На некоторых этапах необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А.2.1.6.2 Водяная баня или инкубатор.

А.2.1.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).

А.2.1.6.4 Сублимационная сушилка (при необходимости).

А.2.1.6.5 Смеситель, например Vortex®.

А.2.1.7 Методика

А.2.1.7.1 Сразу после приготовления навески образца из исследуемого продукта (матрицы) необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК. При изменении размера навески образца требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы буферов.

А.2.1.7.2 Методика выделения ДНК

Взвешивают 0,25 г измельченного или жидкого материала в пробирке. Добавляют 1 см³ буфера для экстрагирования (А.2.1.5.12). Перемешивают суспензию при температуре 65 °С в течение 1 ч, охлаждают до комнатной температуры. Последовательно смешивают суспензию с 60 мг порошка ПВП (А.2.1.5.3) и 0,5 объема раствора ацетата аммония (А.2.1.5.13). Инкубируют на льду в течение 30 мин.

Центрифугируют при ускорении ЮОООд в течение 10 мин и переносят надосадочную жидкость в чистую пробирку. Смешивают верхний слой с одним объемом изопропанола (А.2.1.5.2) и инкубируют при температуре минус 20 °С в течение 30 мин. Центрифугируют при ускорении ЮОООд и температуре 4 °С в течение 10 мин и надосадочную жидкость осторожно отбрасывают.

Промывают осадок ДНК в пробирке после центрифугирования двумя объемами раствора этилового спирта (А.2.1.5.11). Этот этап является важным для удаления любых солей, которые могут оказывать влияние на последующий анализ (например, ПЦР). Надосадочную жидкость осторожно отбрасывают (в случае рыхлого осадка центрифугируют при ускорении 10ОООд и температуре 4 °С в течение 10 мин). Осадок высушивают и повторно растворяют его в 100 мм³ воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А.2.1.5.14). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

^ SIGMA Р-5288 — пример подходящего реактива, имеющегося в продаже. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательность его применения. Могут использоваться эквивалентные реактивы, если их применение приводит к тем же результатам.

17

Введение

Исследование генетически модифицированных организмов (далее — ГМО) и производных продуктов осуществляется посредством следующих стадий, выполняемых последовательно или одновременно. После отбора проб нуклеиновые кислоты выделяются из анализируемой пробы. Выделенные нуклеиновые кислоты далее могут быть очищены от возможных примесей в самом процессе выделения или после него. Следующими этапами являются: оценка количества выделенных нуклеиновых кислот (при необходимости), разведение нуклеиновых кислот (при необходимости) и выполнение аналитических процедур, например полимеразной цепной реакции (далее — ПЦР). Указанные этапы подробно изложены в настоящем стандарте и следующих международных стандартах:

-    ИСО 21568 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Отбор проб»;

-    ИСО 21569 «Продукты пищевые. Методы анализа на обнаружение генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Качественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте»;

-    ИСО 21570 «Продукты пищевые. Методы анализа на обнаружение генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте».

Дополнительная информация об общих требованиях и определениях, относящихся к упомянутым выше этапам, приведена в ИСО 24276 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения».

В 2013 г. в ИСО 21571:2005 была внесена техническая поправка № 1 (Amd.1:2013) в части уточнения условий экстракции ДНК и добавления нового подраздела А.5.2 (приложение А), касающегося применения гуанидин-хлороформного метода для соевого лецитина. В настоящем стандарте техническая поправка № 1 выделена на полях одиночной вертикальной чертой.

IV

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Продукты пищевые

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ И ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ НИХ ПРОДУКТОВ

Экстракция нуклеиновых кислот

Foodstuffs. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products.

Nucleic acid extraction

Дата введения — 2015—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает общие требования и специфические методы выделения, очистки и количественной оценки дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее — ДНК). Эти методы изложены в приложениях А и В.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, но может быть также применен к другим продуктам, например семенам и кормам.

Настоящий стандарт следует применять совместно с ИСО 21569, ИСО 21570 в части аналитических методов на основе нуклеиновых кислот, в частности качественных аналитических методов, установленных в ИСО 21569, и количественных аналитических методов, установленных в ИСО 21570.

2    Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта.

ИСО 24276:2006 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения (ISO 24276:2006, Foodstuffs.Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. General requirements and definitions)

ИСО 21568:2003 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Отбор образцов (ISO 21658:2003, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Sampling)

3    Принципы

3.1 Общие положения

Основная цель применения методов экстракции нуклеиновых кислот — обеспечение выделения нуклеиновых кислот, пригодных для последующего анализа (см. ИСО 24276).

Примечание — «Качество» ДНК зависит от средней длины экстрагированных молекул ДНК, химической чистоты и структурной целостности одной нити и двойной спирали ДНК (например, внутри- и межцепочечные связи оснований ДНК, выпадение оснований в цепочке ДНК, перекрестные сшивки с высокомолекулярными спиртами,

Издание официальное

гемином и т. д.). Кроме того, такие структурные изменения часто являются специфичными для определенной последовательности ДНК и поэтому не распределены по геному случайным образом (см. [1]—[4]).

Пользователям настоящего стандарта необходимо иметь в виду, что некоторые методы (например, методы на основе диоксида кремния) могут быть запатентованы.

3.2    Экстракция ДНК

Основной принцип выделения присутствующей в пробе ДНК заключается в одновременной или последующей очистке ДНК от ингибиторов полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Методы выделения и очистки ДНК изложены в приложении А. Выбор метода основывается на опыте пользователя с учетом области применения и примеров продуктов, которые указаны в каждом методе.

Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующем продукте, подлежащем исследованию.

3.3    Количественная оценка содержания ДНК

Количественная оценка экстрагированной ДНК может потребоваться для последующего ПЦР-анализа.

Такая оценка может выполняться либо физическими (например, измерением поглощения при специфической длине волны), физико-химическими (например, применением интеркалирующих или связующих агентов, обладающих флюоресцентными свойствами), ферментативными (например, био-люминесцентным обнаружением) методами, либо путем количественной ПЦР. Последний метод применяется для продуктов сложного состава, проб с низким содержанием ДНК или проб, в которых ДНК подверглась деградации.

Существует несколько методов, применяемых для определения количества ДНК, присутствующей в растворе. Эти методы изложены в приложении В.

Выбор наиболее подходящего метода осуществляется пользователем в зависимости от количества и качества ДНК, подлежащей количественному определению, а также от продукта, из которой была экстрагирована ДНК.

Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующем продукте.

4    Общие требования к лаборатории

Вследствие воздействия пыли и распыляемых аэрозолей может происходить случайная контаминация ДНК, поэтому организация рабочих мест в лаборатории основывается на строгом соблюдении:

-    последовательности всех установленных методологических этапов, используемых для получения промежуточных и конечных результатов;

-    принципа «прямого потока» при обращении с пробами.

Использование последнего принципа гарантирует, что ДНК, подлежащая анализу, и полученная в результате ПЦР амплифицированная ДНК, остаются физически разделенными.

Дополнительные требования к лабораториям приведены в ИСО 24276.

5    Методика

5.1    Приготовление проб для анализа

5.1.1    Общие положения

Специфические параметры анализируемого продукта (например, влажность) и его обработка могут влиять на количество и качество ДНК, выделяемой из анализируемого продукта. В связи с этим рабочие характеристики применяемого метода экстрагирования ДНК зависят от конкретного анализируемого продукта.

Необходимо принять соответствующие меры, чтобы гарантировать, что проба для анализа является представительной, отобранной из лабораторной пробы.

Проба для анализа должна быть достаточной(го) массы (объема) и содержать достаточное количество молекул ДНК для обеспечения представительности лабораторной пробы.

2

ГОСТ Р ИСО 21571-2014

Исходя из практических и технических соображений не рекомендуется, чтобы масса пробы для анализа превышала 2 г.

Любые ограничения, связанные с массой (объемом) пробы для анализа, не позволяющие рассматривать ее как представительную, должны быть учтены при интерпретации аналитических результатов и указаны в протоколе испытаний.

Методы экстракции ДНК, приведенные в приложении А, устанавливают массу пробы для анализа от 200 до 500 мг, что обычно является приемлемым для продукции с высоким содержанием ДНК (молотое зерно, мука). Однако некоторые продукты содержат очень малое количество ДНК или деградировавшую ДНК, в связи с этим указанная масса пробы не позволит выделить достаточное для анализа количество ДНК. В таких случаях масса (объем) пробы может быть увеличена.

Выделение ДНК должно выполняться не менее чем из двух параллельных проб одной и той же продукции.

Хранение стандартных образцов, лабораторных проб и анализируемых проб должно соответствовать требованиям ИСО 24276 и быть организовано таким образом, чтобы анализируемые биохимические параметры были сохранены (подробнее см. ИСО/МЭК 17025).

5.1.2 Пробы

Все операции по приготовлению лабораторных проб (например, измельчение, гомогенизация, деление, высушивание) должны выполняться в соответствии с лабораторными правилами, описанными в ИСО 24276:2006 (пункт 5.3.2). При выполнении всех необходимых операций должны быть приняты меры предосторожности для защиты лабораторной пробы от загрязнения или изменения ее состава.

Лабораторные пробы должны быть достаточно гомогенными перед измельчением или размолом и перед отбором анализируемой пробы.

В случае жидких проб сосуд с пробой необходимо встряхивать для обеспечения гомогенизации продукта. В случае негомогенных продуктов типа неочищенных масел необходимо убедиться, что осадок и все нерастворимые составляющие полностью удалены со стенок сосуда.

В случае твердых проб, которые не могут быть суспендированы без затруднений, лабораторная проба должна быть размолота для уменьшения размера частиц и/или облегчения экстрагируемости ДНК. В таких случаях особое внимание необходимо обратить на размер частиц. Проба для анализа, подвергаемая экстракции, должна содержать минимальное количество частиц. Необходимо, чтобы оборудование, предназначенное для дробления и измельчения проб, было легко моющимся по всей рабочей поверхности и обеспечивало требуемое количество и распределение по размерам частиц (гранулометрический состав) анализируемой пробы.

Если какие-либо компоненты лабораторной пробы были удалены до проведения экстракции ДНК, то это должно быть указано в протоколе испытаний с описанием проведенных операций.

Для твердых или пастообразных готовых пищевых продуктов с высоким содержанием липидов достаточно трудно достичь требуемого размера частиц за один этап измельчения. В таких случаях допускается перед измельчением применять дополнительные процедуры, такие как удаление липидов гексаном после промежуточного измельчения, замораживание или сублимационная сушка.

Для улучшения измельчения пастообразных или вязких продуктов в некоторых случаях можно использовать одну из следующих обработок:

-    нагрев до максимальной температуры 40 °С;

-    растворение в соответствующей жидкости, например в воде;

-    замораживание при температуре минус 20 °С или ниже.

После такой обработки необходимо гомогенизировать всю лабораторную пробу. Затем необходимо отобрать две параллельные анализируемые пробы с учетом возможного проведения в дальнейшем процедур разбавления или концентрирования.

Во время проведения процедур размола и измельчения необходимо соблюдать меры, гарантирующие нагрев лабораторной пробы на минимальном уровне и не допускающие ее сильного нагревания, так как нагрев может отрицательно воздействовать на качество выделяемой ДНК.

По возможности необходимо избегать способов размола/измельчения, при которых возникает высокий риск перекрестного загрязнения (например, комбинированное использование жидкого азота и ступки, а также использование одной и той же ступки для разных образцов). Одним из основных требований является необходимость изолирования любого методологического этапа, при проведении которого происходит образование пыли, от всех других аналитических этапов и процедур.

3

В случае присутствия в лабораторной пробе солей, специй, сахарной пудры и/или других веществ, которые потенциально могут оказывать влияние на выделение ДНК или последующий аналитический метод, должны быть предприняты дополнительные соответствующие процедуры очистки в соответствии с используемым методом (см. приложение А).

Например, в случае образцов сложного состава целевой материал для исследования (например, панировочный слой рыбных палочек) может быть отделен от остальной части продукта для выделения ДНК.

5.2 Экстракция и очистка ДНК

5.2.1 Общие положения

При разработке методов выделения ДНК необходимо учитывать следующие требования.

Качество и выход экстрагированной нуклеиновой кислоты при использовании того или иного метода для того или иного продукта должны быть как повторяемыми, так и воспроизводимыми при условии содержания достаточного количества нуклеиновой кислоты в анализируемой пробе, из которой она была выделена.

Для получения ДНК хорошего качества рекомендуется при необходимости удалить следующие компоненты:

-    полисахариды (пектин, целлюлозу, гем и целлюлозу, крахмал, загустители и т. д.) путем обработки соответствующим ферментом (например пектиназой, целлюлазой, гемицеллюлазой, а-амилазой) или экстрагирования органическим растворителем (например гексадецилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ)/ хлороформ);

-    рибонуклеиновые кислоты (далее — РНК) и/или белки путем соответствующей обработки, например ферментативной обработки рибонуклеазой и протеиназой соответственно;

-    липидные фракции путем ферментативной обработки или использования растворителей (например гексана);

-    солей (например из буфера для выделения и лизиса, добавляемых в раствор на стадии осаждения), способных оказывать влияние на последующий анализ.

В частности, в случае твердых или высушенных проб объем буфера для выделения и лизиса должен быть таким, чтобы гарантировать растворение в нем ДНК.

Примечание — Очистка ДНК может выполняться различными способами, например путем фракционного осаждения с использованием таких растворителей, как фенол, хлороформ, этанол, изопропанол, и/или с использованием адсорбции на твердые матрицы (ионообменную смолу, силикагель или жидкое стекло, диатомовую землю, мембраны и т. д ). Можно объединить несколько принципов очистки ДНК. При необходимости выделение и очистка могут совмещаться путем выполнения на одном и том же этапе.

В случае использования соосадителей ДНК, например гликогена, полиэтиленгликоля (ПЭГ), транспортной РНК (т-РНК), для увеличения выхода ДНК в ходе стадий осаждения они не должны обладать нуклеазной активностью (содержать детектируемый уровень нуклеаз), содержать ингибиторы и/или конкуренты ПЦР или последовательности нуклеиновых кислот, гомологичные анализируемым последовательностям. При выделении ДНК из генетически модифицированных растений в качестве соосадителя может быть использована ДНК-носитель, например ДНК из спермы лосося или сельди.

При использовании сублимационных сушилок для высушивания осадка ДНК, полученного после стадии осаждения, необходимо учитывать риск перекрестного загрязнения.

Необходимо повторно растворяют ДНК в воде или буферном растворе для предотвращения деградации ДНК.

Пример —Для ресуспендирования или разбавления ДНК пригоден трис/ЭДТА (1х или 0,1х) с 8,0 ед. pH.

При применении нового метода выделения ДНК или одного из методов, описанных в приложении А, для новых продуктов потенциальные качество и целостность выделенной ДНК с использованием выбранного метода должны быть проверены следующим образом: путем добавления в лизирующий буфер известного количества меченой ДНК вместе с пробой, из которой необходимо выделить ДНК. Если оценка нового метода производится на основании использования меченой ДНК, количество (масса) которой известно, или подсчета количества копий определенной последовательности ДНК, необходимо оценить возможную перекрестную реактивность такой ДНК с ДНК, содержащейся в исследуемой пробе.

Примечание — Использование меченой ДНК является наилучшим приближением к реальной ситуации, когда предполагается образование комплекса ДНК данного продукта с другими компонентами (например белками).

4

ГОСТ Р ИСО 21571-2014

Такой метод также может использоваться для оценки присутствия растворимых ингибиторов ПЦР в выделенной ДНК (см. ИСО 24276, ИСО 21569 и ИСО 21570).

Однако меченая ДНК может привести к ложному представлению о степени извлечения ДНК, так как она может гораздо легче выделяться из продукта, чем целевая ДНК.

5.2.2    Процедуры контроля

Процедуры контроля, подлежащие использованию при проведении анализа, описаны в таблице 1 ИСО 24276. Они должны включать, как минимум, отрицательный и положительный контроли экстрагирования, а также могут включать контроль окружающей среды.

5.2.3    Контроль чистоты ДНК. Внутренний контроль ПЦР

При отработке нового метода экстрагирования присутствие ингибиторов ПЦР в экстрагированной ДНК может быть оценено с помощью внесения чужеродной ДНК (внутренний стандарт, см. ИСО 24276, ИСО 21569 и ИСО 21570). Количество добавленной ДНК не должно превышать максимальный уровень, допустимый для применяемой системы ПЦР, и должно содержать установленное число копий последовательности целевой ДНК. Это число необходимо определять отдельно для каждой последовательности целевой ДНК и указывать как кратное нижнему пределу обнаружения. В идеальном случае концентрация целевой ДНК в ПЦР при положительном контроле должна соответствовать чувствительности, требуемой для анализа. При использовании в качестве положительного контроля ПЦР высококонцентрированной клонированной целевой последовательности ДНК необходимо соблюдать осторожность из-за высокой опасности перекрестного загрязнения. По возможности нуклеиновые кислоты положительного контроля должны максимально соответствовать параметрам нуклеиновых кислот исследуемого материала.

5.3    Количественная оценка экстрагированной ДНК

5.3.1    Общие положения

Качество, целостность и количество экстрагированной нуклеиновой кислоты оказывают влияние на рабочие характеристики аналитического метода и, следовательно, на полученные аналитические результаты. Предел обнаружения конкретного метода может, таким образом, зависеть от количества использованных нуклеиновых кислот. Необходимо определить общее количество ДНК, которое используется в ПЦР, равно как и общее количество ДНК целевого таксона, так как ДНК нецелевого таксона может повлиять на эффективность ПЦР.

Количественная оценка ДНК помогает:

-    при определении эффективности различных методов выделения ДНК для определенного вида объектов (повторяемость);

-    измерении концентрации нуклеиновых кислот перед анализом.

5.3.2    Область применения

Каждый метод количественной оценки должен применяться в пределах его динамического диапазона с учетом уровня точности измерения.

5.3.3    Количественные стандарты

Точность методов количественной оценки зависит от стандартов нуклеиновых кислот, используемых для калибровки метода.

При использовании метода, чувствительного к размеру и/или качеству фрагментов нуклеиновой кислоты, должны применяться стандарты нуклеиновой кислоты, которые соответствуют ожидаемым размеру и/или качеству нуклеиновой кислоты, экстрагированной из пробы.

Используемый контрольный материал (национальный или международный стандартный образец) должен обеспечивать проявление заявленных характеристик по непрерывной цепи при сравнении со стандартами национального или международного эталона (см. Руководство ИСО 30).

При применении метода с использованием интеркалирующих (встраивающихся в ДНК) агентов необходимо применять стандарт ДНК с высокой молекулярной массой, если количественной оценке подлежит ДНК с высокой молекулярной массой. Соответственно необходимо использовать стандарт ДНК с низкой молекулярной массой при количественной оценке ДНК с низкой молекулярной массой. Нуклеиновая кислота с высокой молекулярной массой, как правило, содержит некоторое количество фрагментов с более низкой молекулярной массой. Это означает, что многие методы количественной оценки ДНК имеют определенную степень неточности, которую необходимо учитывать при оценке результатов.

5

Примечание — Кроме того, в зависимости от исследуемого материала и применяемого метода выделения некоторая часть ДНК может быть извлечена в виде одноцепочечной ДНК (которая имеет гораздо более низкую способность к интеркаляции), что приводит к занижению общего содержания ДНК. С другой стороны, одноцепочечная ДНК также хорошо обнаруживается путем физических измерений.

Для построения калибровочного графика требуется не менее трех точек, предпочтительно в нескольких повторностях. Количество стандартной ДНК, использованной для каждой точки калибровочного графика, зависит от чувствительности метода и динамического диапазона измерений.

5.4 Стабильность выделенной ДНК

Выделенная из пробы ДНК должна храниться в условиях, которые обеспечивают ее стабильность для проведения последующих анализов.

Следует избегать многократного замораживания и оттаивания растворов ДНК.

6    Оценка результатов

Применяемый метод экстракции ДНК должен обеспечивать получение нуклеиновой кислоты, качество и количество которой соответствуют требованиям последующих анализов.

Качество выделенных нуклеиновых кислот должно быть удостоверено соответствующим аналитическим методом с регистрацией и оценкой параметров, аналогичных используемым при предстоящем анализе (например, если анализ, который будет выполнен, это ПЦР, качество выделенной ДНК должно быть оценено с использованием соответствующего ПЦР-контроля).

Дополнительные параметры для оценки совместимости метода указаны в ИСО 21569, ИСО 21570 и ИСО 24276.

7    Протокол испытаний

В случае представления протокола испытаний в соответствии с ИСО 24276 в него должна быть включена следующая дополнительная информация о деятельности лаборатории:

-    описание происхождения проб для анализа и предварительной обработки пробы перед экстракцией нуклеиновой кислоты;

-    масса проб для анализа, используемых для экстракции нуклеиновой кислоты;

-    используемый метод экстракции нуклеиновой кислоты;

-    любые нетипичные ситуации, наблюдаемые во время проведения испытаний;

-    любая операция, не указанная в методе или рассматриваемая как необязательная, которая может оказать влияние на результаты;

-    оценка результатов;

-    персонал.

Обработка и хранение исходных данных изложены в ИСО/МЭК 17025.